Summary
Denne videoen viser prosedyrer for karakterisering av humane pankreas holmer med hematoxylin og eosin (H & E) og immunhistokjemi (IHC). Pankreas deler fra hode, kropp og hale regioner er farget av både H & E og IHC å bestemme holmen endokrine sammensetning (insulin, glukagon, og bukspyttkjertelen polypeptid), celle replikering (Ki67) og inflammatoriske infiltrater (H & E, CD3). Den uncinate regionen er lokalisert ved hjelp av IHC for bukspyttkjertelen polypeptid.
Abstract
Estimater av holmen areal og tall og endokrine celle sammensetning i voksent menneske bukspyttkjertelen varierer fra flere hundre tusen til flere millioner og beta masse spenner fra 500 til 1500 mg 1-3. Med dette kjente heterogenitet, ble en standard behandling og farging prosedyre utviklet slik at bukspyttkjertelen regionene var klart definert og holmer karakterisert ved hjelp av strenge histopatologi og immunolocalization undersøkelser.
Standardiserte rutiner for behandling av menneskelige bukspyttkjertelen utvinnes fra organdonorer er beskrevet i del 1 av denne serien. Bukspyttkjertelen er behandlet i 3 hovedområder (hode, kropp, hale) etterfulgt av tverrgående deler. Tverrgående deler fra bukspyttkjertelen hodet er igjen delt, som angitt basert på størrelse, og nummerert alfabetisk å betegne underseksjoner. Denne standardiseringen gir en komplett tverrsnitt analyse av hodet regionen inkludert uncinate regionen som inneholder holmer komponerthovedsakelig av bukspyttkjertelen polypeptid celler til halen regionen.
Den nåværende Rapporten omfatter del to av denne serien, og beskriver prosedyrer som brukes for seriell seksjonering og histopatologisk karakterisering av pancreatic parafinsnitt med en vekt på holmen endokrine celler, replikering og T-celle infiltrater. Pathology av pankreas seksjoner er ment å karakterisere både eksokrin, ductular, og endokrine komponenter. Exocrine rommet er evaluert for tilstedeværelse av pankreatitt (aktiv eller kronisk), atrofi, fibrose, og fett, samt kanalsystemet, spesielt i forhold til tilstedeværelse av pankreas intraductal neoplasi 4. Holmene er evaluert for morfologi, størrelse og tetthet, endokrine celler, betennelse, fibrose, amyloid, og tilstedeværelsen av replikere eller apoptotisk celler ved hjelp av H & E og IHC flekker.
Den siste komponenten er beskrevet i del 2 er bestemmelsen av de fargede lysbildets som digitaliserte hele lysbildene. De digitaliserte lysbilder organiseres av saken og bukspyttkjertel region i en online patologi database skape en virtuell biobank. Tilgang til denne elektroniske samlingen er for tiden til over 200 klinikere og forskere er involvert i type 1 diabetes forskning. Den elektroniske databasen gir et middel for rask og fullstendig deling av data og for etterforskerne å velge blokker for parafin eller frosne seriesnitt.
Protocol
1. Skjæringen for Unstained Seksjoner
- Sett opp vannbad og mikrotomen som for standard parafin skjæringen. Bruk positivt ladede lysbilder og pre-label med saksnummer, bukspyttkjertel region (prøve) og skyv nummer. Plasser parafin blokk i mikrotomen chuck med kassetten etiketten på venstre side.
- Følg normale skjæringen prosedyrer, pkt. inn i blokk før vevet er jevnt oppstått. Lag et bånd av seriesnitt (4 mikrometer tykke, 3-6 avhengig av antall innledende nødvendige flekker (se sak skjema for innsending, Vedlegg 1)). Egne seksjoner i båndet, plukke opp hver i orden, og plass på lysbilder med bestillingen nummerert med blyant. Betegne hvis en seksjon er ubrukt ved nummereringen seksjoner i nøyaktig rekkefølge. Opprettholde samme orientering på lysbildet som finnes i kassetten med lysbildet etiketten orientert mot venstre. Tørke over natten i romtemperatur da fortsette med flekker eller distribusjon til etterforskerne.
- ResEAL overflaten av parafin blokk med tynt lag av parafin å bevare vev og arkiv ved romtemperatur eller -20 ° C.
- For påfølgende skjæringen, vedlikeholde nummerering for seriesnitt på hvert nivå som ovenfor. Skaff en ekstra slide og beis av H & E lysbilde for hvert ~ 100 mikrometer nivå innenfor hver blokk.
2. H & E Farging
- Plasser den første serielle seksjoneres lysbilde fra hver blokk i et lysbilde stativ så i den første skuffen på autostainer.
- Velg standard H & E flekken program og fortsetter som vanlig.
- Når du er ferdig farging, fjerne lysbilder fra autostainer og sted i hette for coverslipping.
- Dekkglass med standard teknikk. Tørk grundig og etiketten med en trykt etikett (se avsnitt 12).
3. IHC Set-up
- Velg Dako program for doble flekker og innspill tall av lysbilder. Forbered TBST og citrate buffere, antistoffer, og andre Reagentene i henhold til spesifiserte volumer (tabell 1). Legg reagens skuffen og lysbilder. Rotasjon av ren og avfall linjene er programmert i henhold til produsentens anbefalinger.
- Hvis du utfører disse analysene manuelt, forberede estimerte volumer. Inkuber lysbilder i en fuktet kammer for å unngå lysbilder uttørking ved noen trinn. Følg samme prosedyre for hver reagenser som når det brukes ved autostainer.
4. IHC Deparaffinization og Antigen henting
- Sett lysbilder i xylen i 5 minutter. Gjenta en gang. Ikke la lysbilder for å tørke ut når som helst senere punkt før angitt som dette vil resultere i overdreven bakgrunn og dårlig flekker.
- Overføring lysbilder til 100% etanol i 2 minutter. Gjenta en gang.
- Sett lysbilder i nylaget 3% H 2 O 2 i metanol i 10 minutter.
- Dyppglass i 90% etanol og deretter plassere i 90% etanol i 3 minutter.
- Overføring glir til70% etanol i 1 minutt.
- Skyll lysbilder i de-ionisert vann.
- Forvarm dampskip og citratbuffer i dampbåten i 5 minutter.
- Legg lysbilder til citratbuffer i dampbåten og damp i 30 minutter.
- Umiddelbart overføre lysbilder til vann og hold til glir avkjøles til romtemperatur (~ 20 minutter).
- Overfør lysbilder til Dako autostainer racks etter å farge sekvens (figur 1) og kjøre den doble farging programmet. De viktigste trinnene i autostainer programmet er listet slik at manuelle kjøringer kan duplisere.
5. Første primære antistoffer (Ki-67, CD3, bukspyttkjertelen polypeptid)
- Blokker lysbilder med Sniper løsning i 15 minutter. Vask to ganger med TBST.
- Inkuber lysbilder i primær antistoff i 30 minutter. Vask to ganger med TBST.
- Inkuber med Mach2 geit anti-mus (Ki-67) eller anti-kanin (CD3, bukspyttkjertelen polypeptid) pepperrot peroksidase (HRP) polymer for 30 minutes. Vask to ganger med TBST.
- Bruk 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) til slides for 4 minutter. Vask to ganger med vann.
- Lysbilder ruges med bukspyttkjertelen polypeptid holdes på Dako da blir analysert samtidig og TBST brukes for alle etterfølgende trinn mens de resterende lysbildene blir inkubert med den andre settet av primære antistoffer. Alternativt, for manuelle analyser, fortsett til punkt 6.
6. Second Primære antistoffer (Insulin, glukagon)
- Inkuber lysbilder i Deeb i 20 minutter. Vask to ganger med TBST.
- Blokk med 10% normal geit serum i 20% avidin stopperen i TBST (insulin) eller Sniper (glukagon) i TBST i 20 minutter. Vask to ganger med TBST.
- Inkuber med insulin eller glukagon primære antistoff i 15 minutter. Vask to ganger med TBST.
- Insulin: Inkuber lysbilder i biotinylated geit anti-marsvin på 1:300 fortynning i 30 minutter. Vask to ganger med TBST. Inkuber med standard vector ABC-AP reagens i 30 minutter. Vask to ganger med TBST.
- Glukagon: Inkuber lysbilder i buffer under i 30 minutter, etterfulgt av geit anti-mus alkalisk fosfatase (AP) polymer i 30 minutter. Vask to ganger med TBST.
- Mens lysbilder inkuberes i konjugater, varme LPR buffer til romtemperatur. Tilsett 1 dråpe væske permanent rød (LPR) per 3 mL buffer umiddelbar før bruk og plass i Dako reagens rack. Inkuber lysbilder i LPC i 4 minutter. Vask to ganger med vann.
- Inkuber lysbilder i hematoxylin i 1 minutt. Skyll to ganger med vann.
- Inkuber lysbilder i TBS pH 7,6 i 1 minutt. Skyll to ganger med vann.
- Losse lysbilder fra DAKO Autostainer.
- Umiddelbart dehydrere lysbilder farget for bukspyttkjertelen polypeptid. For alle doble beiset lysbilder, tørke i minst en time da dehydrerer.
7. Dehydrering
- Plasser glir i 80% etanol i 1 minutt.
- Dypp lysbilder i 95% etanol. Hold lysbilder i 95% etanol i 30 sekunder.
- Overføring lysbilder til 100% etanol og hold 1 minutt. Gjenta.
- Dyppglass i xylen.
- Hold lysbilder i xylen i 1 minutt. Gjenta.
- Umiddelbart montere Dekkglass på lysbilder ved hjelp cytoseal.
8. Slide Merking
- Angi saken identifikasjon informasjon, inkludert orgel og blokk nummer, beis, og dato og print. Serial seksjon nummer er valgfritt for første lysbilde flekker av hver blokk. Påfølgende nivåer er merket med nummerering.
- Plasser etiketter på lysbilder.
9. Slide Scanning
- Plasser beiset lysbilder i skanneren skuffen og skanne etter instrumentering.
- Organiser lysbilder av donor og vevstype (pancreas hode, kropp, hale, milt).
- Arkiv beiset lysbilder ved romtemperatur, og eventuelle gjenværende unstained lysbilder ved -20 ° C til det brukes.
10. Representative Resultater
Disse flekker prosedyrer ble utviklet for JDRF Nettverk for Bukspyttkjertelen organdonorer med Diabetes (nPOD) for å gi baseline karakterisering av parafin og friske frosne blokker. Hver donor har en baseline karakterisering utføres består av farging 2 kvartaler fra hver bukspyttkjertelen region (hode, kropp og hale) og milt (figur 1, se også sak innsending skjema, Vedlegg 1). H & E farging er utført ved en autostainer programmert som for en klinisk anlegg med klinisk-grade løsninger som brukes overalt. Som ekstra donor blokkene er seksjonert, har hver en lysbilde tatt for H & E å vise vev morfologi. Når blokkene er seksjonert igjen, som for distribusjon til etterforskere, vil dypere nivåer også har lysbilder tatt for representative H & E lysbilder å dokumentere hele blokken vev morfologi samt nummerering seriesnitt på hvert nivå. Stained lysbilder er merket medVed identifikasjon, bukspyttkjertel region, blokk nummer, beis og dato (figur 2) og skannet inn i den elektroniske patologi informasjon styringssystem. Representative bilder fra en kontroll donor er vist i figur 3 ved både lav og høy forstørrelse til å vise forventede resultater etter denne prosedyren. Raset beiset med bukspyttkjertelen polypeptid (D, H) ble analysert på en annen dag med analysen utføres manuelt og viser redusert flekker intensiteten av hematoxylin counterstain. Forskjeller i farging intensitet av primære antistoffer eller counterstain mellom analysene er å unngås spesielt hvis du bruker bildeanalyse ellers glir med krever individuell fargekorrigering for å oppnå samme celle områder eller teller.
Hvert laboratorium bør forvente å optimalisere antistoffkonsentrasjoner som lot til lot variasjon og andre reagenser og betingelser kan påvirke farging intensitet og spesifisitet. Med oppkjøpet av ny reaGents, er flekker prosedyrer valideres med kjente positive og negative kontrollprøver for å oppnå samme grad av flekken intensitet som med tidligere reagenser. Andre antistoffer optimalisert i nPOD patologi kjernen er gitt i tabell 2 som en referanse kilde og har blitt brukt for multilabeling immunfluorescens analyser for konfokalmikroskopi.
Figur 1. Dako farging rutenett. Dette skjematiske skildrer en rutine analyse fra en nPOD donor bukspyttkjertelen utført på en Dako autostainer. De nPOD givere er kodet med en 4-sifret identifikasjonsnummer. To lysbilde skuffene er vist med lysbilder i regi av flekken. Alternative lysbilde konfigurasjoner forventes avhengig antall donor lysbilder. Positive kontroller omfatter inkludering av en kjent positiv donor for de to doble flekker og donor milt for Ki-67 og CD3. Negative kontroller er todelt og omfatter to SLIdes fra en donor bukspyttkjertel blokk inkubert med immunglobulin (Ig) fra verten arter av de primære antistoffer og to sklier fra donor milt for insulin og glukagon.
Figur 2. Representant dobbel beiset lysbilde. En typisk ferdig bilde skal vises med sklie merking parametere og vev plassering før digital skanning utføres.
Figur 3. Representant H & E og IHC flekker i bukspyttkjertelen seksjoner. Seksjoner fra bukspyttkjertelen av en voksen kvinnelig organ donor (6096-04 Panhead) ble farget og digitale skanninger utført som beskrevet i protokollen. Bilder ble innhentet ved hjelp av ImageScope ser programmet for hele seksjonen (AD) og fra en holme (EH). De forventede holmen flekken intensitet for insulin, glukagon, og bukspyttkjertelen polypeptid erobservert for seksjoner BD som avsnitt D delineates at dette bukspyttkjertelen hodet blokken inneholder en liten del av uncinate regionen eller ventral bukspyttkjertelen lapp som alle holmer inneholde hovedsakelig bukspyttkjertelen polypeptid-positive celler. Merk at hematoxylin counterstain i panel D er for lys, mens hematoxylin counterstain intensiteter i B og C er optimal. Paneler EH viser en holme fra dorsal lapp med forventet fordeling av beta-celler og α-celler. Noen få bukspyttkjertelen polypeptid celler er funnet i nedre venstre del av holmen (H). A, E-H &E; B, F-Ki67 + Insulin, C, G-CD3 + Glukagon, D, H-bukspyttkjertelen polypeptid. AD, 0,2 x, EH-12.8x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standardisering av IHC prosedyrer er kritisk for bildeanalyse, spesielt når du bruker PC-baserte algoritmer over store mengder lysbilder over tid. IHC farging fremgangsmåten som er beskrevet i denne rapporten vil tillate batch analyse av en gitt donor prøver ved hjelp av en autostainer innenfor en 8-timers arbeidsdag og blir endret fra et tidligere rapport 5. Digitaliserte hele lysbildene av hver beiset lysbilde gjort tilgjengelig for nPOD-tilknyttede etterforskerne gjennom web-baserte online patologi system. Etterforskerne kan gjennomgå donor demografi, laboratorium data og annen relevant sykehistorie sammen med lysbildene og er i stand til å velge blokker passer best for sine studier (se http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php for mer informasjon) . Et slikt elektronisk patologi system fungerer som et "virtuelt biobank". En ytterligere forbedring til dette systemet vil bli implementert whereby lysbilde etiketter innlemme en strekkode for å spore seriesnitt og nivåer for hver blokk med en eventuell mål av 3-D rekonstruksjon av bukspyttkjertelen.
De to doble flekker prosedyrer ble primært valgt å bestemme holmen β-celle sammensetning (insulin) i konsert med mobilnettet replikering (Ki-67) gitt viktigheten av å forstå mekanismer for voksen β-celle regenerering ved type 1 diabetes 5,6. Som den nest dobbel IHC-analysen er utført på seriesnitt til den første, er hver holme karakterisert for både β-celle (insulin) og α-celle sammensetning (glukagon). I tillegg er forekomsten av T-lymfocytter (CD3) bestemmes i forbindelse med α-cellefarging for to hovedgrunner. Grunnlaget for T-celle mediert autoimmunitet i utviklingen av type 1 diabetes har blitt klart styrket ennå arten av de utløsende agenter (viral, bakteriell, inflammatoriske celler) eller sammensetningen av kronisk infiltrere med resulviktig β-celle dysfunksjon og død er ennå ikke definert (anmeldt i 7,8). Second, givere med type 1 diabetes har en godt karakterisert mangel av beta-cellene slik at kombinasjonen av CD3 og glukagon flekker sikrer identifisering av holmer selv når β-celle tap er alvorlig 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne takker givernes familiene og orgelet innkjøpsorganisasjoner involvert i denne forskningen og Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal, og Roshan Agarwal for sin eksperthjelp. Dette arbeidet ble finansiert av Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) i støtte av Nettverk for Bukspyttkjertelen organdonorer med diabetes.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | Fisher Scientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector Laboratories | AK-5000 | AP conjugate |
Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
Avidin blocker | Vector Laboratories | SP-2001 | Block endogenous biotin |
Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector Laboratories | BA-7000 | Secondary antibody |
Bluing Reagent | Fisher Scientific | 7301 | Leica autostainer |
Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
Clarifier 1 | Fisher Scientific | 7401 | Leica autostainer |
Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
DAB | Vector Laboratories | SK-4100 | HRP chromogen |
DEEB | Dako | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
Eosin Y Alcoholic | Fisher Scientific | 71204 | Leica autostainer |
Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | Fisher Scientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Hematoxylin | Dako | S3301 | Dako autostainer |
Hematoxylin 7211 | Fisher Scientific | 7211 | Leica autostainer |
IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
Liquid Permanent Red (LPR) | Dako | K0640 | AP chromogen |
Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
Methanol | Fisher Scientific | Various | H2O2 diluent |
Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | IHC blocking reagent |
Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
TBST 20X | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-999-TT | IHC buffer |
Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
Xylene | Fisher Scientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Table 1. Specific reagents. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Paraffin | |||
Amylase | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-46657 | Mouse |
Amylin | Serotec | MCA11267 | Mouse |
Carbonic anhydrase 19.9 | Abcam | ab15146 | Mouse |
Caspase-3, cleaved | Cell Signaling Technology | 9961 | Rabbit |
CD20 | Dako | M0755 | Mouse |
CD3 | Dako | A0452 | Rabbit |
CD34 | Cell Signaling Technology | 3569 | Mouse |
CD4 | Dako | M7310 | Mouse |
CD45 | Dako | M0754 | Mouse |
CD68 | Dako | M0876 | Mouse |
CD8 | Dako | M7103 | Mouse |
Chromogranin A | Dako | A0430 | Rabbit |
CK17 | Dako | M7046 | Mouse |
CK19 | Dako | M0772 | Mouse |
CK7 | Dako | M7018 | Mouse |
C-peptide | Cell Signaling Technology | 4593 | Rabbit |
Foxp3 | e Bioscience | 14-4776-80 | Rat |
Ghrelin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-10386 | Goat |
Ghrelin | Abcam | ab85104 | Rabbit |
Glucagon | Dako | A0565 | Rabbit |
Glucagon | Abcam | ab10988 | Mouse |
Glucagon | Bachem | T-5037 | Guinea Pig |
Glut-1 | Abcam | ab40084 | Mouse |
Glut-2 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9117 | Rabbit |
Insulin | Dako | A0564 | Guinea Pig |
Ki-67 | Dako | M7240 | Mouse |
Mafa | Novus Biological | NB400-137A | Rabbit |
Pancreatic polypeptide | Invitrogen | 18-0043 | Rabbit |
Pdx-1 | Abcam | ab47308 | Guinea Pig |
Proinsulin | Novocastra | NCL-proin-1G4 | Mouse |
Proinsulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Mouse |
Secretagogin | Sigma-Aldrich | HPA 006641 | Rabbit |
Smooth muscle actin | Abcam | ab5694 | Rabbit |
Somatostatin | Dako | A0566 | Rabbit |
Synaptophysin | Dako | M0776 | Mouse |
Fresh Frozen | |||
CD11b | Abcam | ab6332 | Rat |
CD11c | Serotec | AHP1226 | Rabbit |
CD25 | Novus Biological | NB 600-564 | Mouse |
CD94 | Abcam | ab61874 | Mouse |
GAD65 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-130569 | Mouse |
HLA-ABC | Dako | M0736 | Mouse |
Table 2. Primary antibodies. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Aperio Scanscope CS | Aperio Technologies | Digital slide scanner | |
DAKO Autostainer Plus | Dako | IHC stains | |
Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
Leica XL Autostainer | Leica Microsystems | H&E stains | |
Premium Coverglass | Fisher Scientific | 12-548-5J | Coverslip |
Spectrum Information Manager | Aperio Technologies | Scanner software | |
Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
Table 3. Specific supplies and equipment. |
References
- In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008).
- Saisho, Y. Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes. Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).
- Hruban, R. H. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).
- Campbell-Thompson, M. Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area. Diabetologia. 52, 262-270 (2009).
- Meier, J. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).
- Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. The pancreas in human type 1 diabetes. Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).
- Veld, I. n't, P, Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion. Islets. 3, 131-138 (2011).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).