Summary
グリーンモンスターメソッドは、緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子でマークされた複数の削除を迅速に組み立てることができます。このメソッドは、性的失の品揃えや、その他の欠失を保有する細胞の蛍光ベースの濃縮の繰り返しサイクルを通して酵母菌株を駆動に基づいています。
Abstract
遺伝子欠失のための表現型は、しばしば突然変異が特定の遺伝的背景や環境条件1,2でテストされているときにのみ明らかにされています。多くの遺伝子が隠された遺伝子の機能3,4のマスクを解除するために削除する必要がある例があります。重要な発見の可能性にもかかわらず、3つ以上の遺伝子が関与する遺伝的相互作用は、主に未踏されています。マルチ変異体の相互作用の網羅的な検索が欠失の可能な組み合わせの膨大な数のために現実的ではありません。しかし、このような共通機能を共有することの大きいアプリオリの確率でパラログのセットなどの遺伝子の選択セットの研究は、有益であろう。
酵母 Saccharomyces cerevisiaeにおいて、遺伝子ノックアウトは、相同組換えを介した選択マーカーと遺伝子を交換することによって達成されます。マーカーの数が限られているので、このメソッドでは、SAMを削除し、再利用のために開発されている電子マーカー5,6,7,8,9,10。時間が生成される削除の数に比例して直線的に必要なので、これらのメソッドを使用して順次工学複数の変異は時間がかかります。
ここでは、日常的に酵母11に複数の削除を工学のためのグリーンモンスター方法を説明します。この方法では、削除に統合された緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターが定量的に各菌株に含まれる削除の数（ 図1）に記載の菌株にラベルを付けるために使用されています。これらの欠失の多くを運ぶ株のフローサイトメトリー濃縮と相まって酵母の接合と減数分裂を経由して、GFP-著しい失の品揃えの繰り返しラウンドは株の欠失（ 図2）の蓄積につながる。各プロセスがラウンドごとに1つ以上の欠失を組み込むとともに、並行して複数のプロセスを実行し、ひずみ建設に必要な時間が短縮されます。
GFPの削除された遺伝子座でのレポーターや"ツールキット"座·どちらグリーンモンスターGMToolkitまたは少なくともGMToolkit-αの1を運びそれぞれのコンテンツは、 ">と呼ばれる最初のステップは、半数体、単変異体を作製することは'ProMonsters、' can1Δ軌跡（ 図3）酵母削除コレクション12から菌株を用い、GFP顕著な欠失が便利なユニバーサルGFPでこれらの株に存在する共通のKanMX4カセット交換することによって生成することができます- URA3断片を各GMToolkitが含まれています。どちらか-またはα接合型特異半数体選択マーカー1とその2つのマーカーのちょうど1つ、両方GMToolkitsが存在する場合に、一括して二倍体の選択を可能にする。第二段階は、欠失遺伝子座がランダムな組み合わせ、および/または減数recombにより単一細胞内で組み合わせることができるような性的サイクリングを実施することである交配と胞子形成の各サイクルを伴うもののみ。
Protocol
1。 ProMonstersの世代
- テト2-GFPマーカーおよび配列を有するプライマーを用いてプラスミドpYOGM012（アンピシリン耐性）からURA3マーカーを増幅することによって、普遍的なGFPの交換用カセットを準備します。
GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCGとGGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT（太字の地域をターゲットに交換できKanMX4カセットの隣接領域との相同性を提供してください）。 PCR反応は、0.5 ng /μLののテンプレートDNA濃度で始まるPhusionポリメラーゼは、HFバッファ、および3％ジメチルスルホキシド（New England Biolabs）で行われるべきである。 PCRプログラムは98 10秒30秒、98℃35サイクル℃で、49℃で30秒のC、1.5分間72℃である。反応容量は、各形質転換実験に十分なDNAを提供すること>を50μlにする必要があります。私たちは、浄化製品には、列ごとに処理PCR反応の〜50μlでQIAクイックPCR精製キット（Qiagen）を用いますが、精製工程を省略すると、形質転換体の収量を増加させることができる。
あるいは、制限酵素EcoRI（New England Biolabs）を用いてプラスミドpYOGM057（アンピシリン耐性）を消化することによって、標的テト2-GFPおよびKanMX4の相同URA3マーカーと同様、領域を含む断片を放出。この反応におけるDNA濃度は約30 ng /μlにする必要があります。反応容量は> 34μLである必要があります。
KanMX4以外の領域にGFPのカセットを統合するための、適切な相同配列に上記のPCRプライマーの相同領域を調整します。 - ユニバーサルGFPの削除カセットでKanMX4酵母ノックアウトコレクション12からA-ハプロイド株を形質転換。のウッズとGietz 13 0.34μlを別のプロトコルに続いてDNAサンプル（精製されたPCR産物または非精製制限消化）は、各形質転換実験に使用されるべきです。 CAA-裏プレートに形質転換混合物（0.67％酵母窒素ベース、2％グルコース、0.6％カザミノ酸、0.0025％アデニンヘミ、0.005％トリプトファン、2％寒天）のプレート5分の1。
- 単離されたコロニーを得るために新鮮なCAA-浦プレート上で形質転換体のうちストリーク。
- 成長の欠如を確認するために200μg/ mlのG418を含むYPDAプレート上にコロニー由来の細胞を移す。成功したGFPの統合を確認するには、手順（1.5）に従う - （1.9）コロニーPCRを行う。
- 0.2 mlのPCRチューブや96ウェルプレートのウェルに溶解緩衝液2μl（0.1Mリン酸ナトリウム、pH 7.4、ZymoResearchから1ユニットザイモリアーゼ）にコロニーから採取された細胞を追加します。ピペットチップの内と外液をピペッティング。
- P200ピペットマン（ギルソン）を使用してミネラルオイルを1滴（約20μL）をオーバーレイ。
- 37℃で混合物をインキュベート95℃で20分、その後のC℃で10分間。
- 50μlの水で溶解液を希釈します。 10回inとoutソリューションをピペッティングして混和します。
- 上流の隣接領域にアニールは、シーケンスCCTGAGAAAGCAACCTGACC（カセットの先頭から285 bp）のプライマーと組み合わせること、（A）フォワードプライマーと10μlのPCR反応を用いてライセート1μlを、（B）の逆を分析プライマーその一連GCATTGGGTCAACAGTATAG（端から375 bp）のプライマーと対下流領域にアニール（C）の二つの配列がCGTACTCCTGATGATGCATGと（181 bp）のGACGAAATACGCGATCGCTGとKanMX4にアニールするプライマー、及び（D）は、2つのプライマーをその標的遺伝子の野生型配列（ 図4）にアニールする。削除コレクションで株の約8％が14異数性を含むことが知られているので、（D）は重要です。正しい形質転換体は、正の（A）と（B）と（C）と（D）と負になります。
- 紹介する形質転換にGMToolkitは、形質転換株および1.6 mlのエッペンドルフチューブにRY0146（GMToolkit含有）またはRY0148（GMToolkit-αを含む）のいずれかの250,000個の細胞から約250,000個の細胞を追加します。渦。 RY0146 RY0148との遺伝子型はMATαlyp1Δhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0can1Δ:: GMToolkit-[CMVpr-rtTA KanMX4 STE2pr-SP-his5]とMATαlyp1Δhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0can1Δ:: GMToolkit-α[CMVpr-rtTA NatMX4 STE3pr·アールLEU2]、それぞれ。 prはプロモーターを意味する。細胞数は、前培養物の光学密度から推定されるべきである。
- 2分間、800×gで遠心分離します。
- 上清を取り除きます。
- 空気交換を可能にするために、70％エタノールで処理した画鋲を使用して蓋に穴を開ける。
- YPDA培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％グルコース、および0.003パーセントアデニンhemisulfat50μlを追加e）に示す。渦。
- 5分間800×gで遠心分離します。
- 湿ったボックスにチューブを置きます。これは、空のチップボックス、小さなチップスタンド、湿らせたペーパータオルを使用して作成できます。
- 30℃で一晩ボックスをインキュベート℃に
- 第一は、CAAの浦プレート上の細胞をストリーキングで交尾二倍体を選択してください。 1日のために30℃で静置します。
- 二倍体を選択するための200μg/ mlのG418を含むYPDAプレート上で単離されたコロニー（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％グルコース、0.003％アデニンヘミ、2％寒天）を作るためにバルク領域、ストリークからそれらを細胞を取り出す含むGMToolkit-GMToolkit-αを含む二倍体を選択するか、または100μg/ mlのnourseothricin（NAT）15。
- 3日間30℃で静置します。
- 隔離されたコロニーから始めて、寒天培地（1％酵母エキス、3％ディフコ栄養ブイヨン、5％ブドウ糖なしでGNA培地500μlに細胞の大部分を移す。オートクレーブグルコースとtの残り彼のコンポーネントは別々としてふたが付いている5mlの培養管でカラメル化を避けるために、2×ソリューション）を緩めた。
- 30℃で5時間、水平管を回転℃に回転軸は、管の長手方向軸に平行である必要があります。
- で使用されているコロニーを確認して（1.21）裏は、+ CAA-裏板の上にそれらをストリーキングで。
- 2分間、800×gでチューブを遠心分離します。上清を捨てる。
- 最小限の胞子形成培地（;フィルター滅菌を1パーセント酢酸カリウム、0.005％酢酸亜鉛）500μlを添加する。渦。
- 2分間、800×gでチューブを遠心分離します。上清を捨てる。
- リピート（1.25） - （1.26）倍。
- 7.5μg/ mlのリジン、7.5μg/ mlのロイシン、5μg/ mlのヒスチジン、5μg/ mlのメチオニン、および1.25μg/ mlのウラシル（栄養要求株の胞子形成率を高めるために）を補充した最小限の胞子形成培地1mlを追加。渦。
- 1日室温でチューブを回転させます。
- 2日間30℃でチューブを回転させます。
- 2分間800 xgで1.6 mlのエッペンドルフチューブに、この混合物の125μLを遠心分離します。上清を捨てる。
- ザイモリアーゼ溶液（100mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、1Mソルビトール、及びZymoResearchからザイモリアーゼ2単位）の50μlを添加する。ピペットチップの内と外液をピペッティング。
- 1時間30℃でインキュベートする。
- 0.02％NP-40の50μlを添加する。ピペットチップの内と外液をピペッティング。
- 5分間室温でチューブのままにしておきます。
- 水500μlを添加する。
- チューブを氷上に置きます。
- ソニファイアー450（ブランソン）と3.2 mmのマイクロチップを使用して15秒に1の出力設定（最弱設定）で二回、この混合物を超音波洗浄します。超音波処理の2ラウンドの間、〜0℃に温度を戻すためにチューブを氷上に置く
- 5分間、800×gで遠心する。上清を捨てる。
- SC-裏彼を200μl加え（a）またはクロスGMToolkitまたはGMToolkit-αを組み込むためのものであるかに応じて、SC-裏レイ（α）の媒体。メディアを準備するには、SC - 裏のHisレイ培地（0.67％酵母窒素ベース、2％グルコース、0.01％アルギニン0.01％、アスパラギン酸、0.01％グルタミン酸、0.01％イソロイシン0.01％、リジン、メチオニン0.01パーセント作る、0.01％フェニルアラニン、0.08％セリン、0.04％トレオニン、0.002％チロシン、0.03％バリン、0.0025％アデニン、0.005％トリプトファン、0.003％アデニン、0.005％トリプトファン）および滅菌ヒスチジンまたはロイシンでそれを補うために、使用前に最終濃度0.01％になる。
- 70％エタノールで処理した画鋲を使用して蓋に穴をあけます。
- 2日間30℃で水平にチューブを回転させます。回転軸は、管の長手方向軸に平行である必要があります。
- SC-裏彼またはSC-裏レイ寒天プレート（上記と同じ成分を加えた2％寒天上の細胞外ストリークは、トレオニンとアスパラギン酸の後に追加する必要がありutoclaving; ProMonster株の単離されたコロニーを作るために）注ぐ前にヒスチジンまたはロイシンを追加します。
2。性的サイクリング
- SC-HIS（）または°Cで一晩1.6 mlエッペンドルフチューブを用いて30℃で交配型に応じて、SC-レイ（α）を100μlの確立されたGFPの欠失株の培養物を回転させます。空気交換のために、70％エタノールで処理した画鋲を使って穴を開ける。水平チューブを回転させます。回転軸は、管の長手方向軸に平行である必要があります。 大挙して交配を介して複数の株を横断することが可能です。ソートされたサンプルは、直接2日間30℃で200μlのこの目的は、培養細胞に使用される場合。 SC-裏のHis-Leuの媒体へとヒスチジン（0.01％）またはロイシン（0.01％）：培地を調製し、ウラシル（0.0025％最終濃度）を追加します。
- 1.6ミリリットルEPPEで250,000半数体細胞とGFP欠失株25万のα-半数体細胞を混ぜるndorfチューブ。渦。
- （1.17） - 次の手順（1.11）によって、これらの細胞を交配。
- 緩め蓋を5mlの培養チューブに200μg/ mlのG418および100μg/ mlのナットを含む500μlのGNAの媒体に交配混合物10μlを転送します。出発OD 600がおよそ0.1である。
- 24時間30℃で培養を回転させます。 GMToolkit-αのGMToolkitとNatMX4でKanMX4両方を含む唯一の二倍体は、G418およびNAT（ 図3）の存在下で増殖することができるので、これは二倍体の選択を可能にする。
- G418とナットを含む新鮮なGNAの500μlに1日間培養液20μlを転送します。出発OD 600がおよそ0.2である。
- 対数期（〜1のOD 600）にセルを持って来るために5時間30℃でチューブを回転させます。
- 二倍体の胞子形成と胞子を分離するために（1.38） - ステップ（1.24）に従ってください。
- 2つの300-μLに胞子形成細胞の懸濁液を分割部品と別の1.5 mlのエッペンドルフチューブにそれぞれを置く。
- 5分間、800×gで遠心する。上清を捨てる。
- 1チューブのペレットに、-半数を選択するには、SC-Hisを100μlの培地を追加します。他のチューブのペレットには、α-半数を選択するために、SC-Leuの培地100μlを添加する。
- 30℃で一晩チューブを回転させます。最終OD 600が 0.5未満でなければなりません。 OD 600が高くなりすぎる場合は、室温で培養することを試みる。
- GFPを誘導するために、新鮮なSC-HIS（）または20μg/ mlのドキシサイクリンを含むSC-レイ（α）を100μlの培地を追加します。ドキシサイクリンの最終濃度は10μg/ mlである。渦。
- 2日間30℃でチューブを回転させます。
3。フローサイトメトリー
- キャップを5 mlのポリプロピレンチューブ（BDファルコン＃352063）に10μg/ mlのドキシサイクリンを含む事前にフィルタ処理されたTEバッファー900μlの液（pH 7.5）を入れると交換セル5 mLのポリスチレンチューブからストレーナーキャップ（BDファルコン＃352235）。ポリプロピレンチューブは、フローサイトメトリーに適しています。ストレーナーキャップは大きい粒子を除去するために望まれている。
- 優しくセルストレーナーキャップのドキシサイクリンをTE緩衝液75μlを置く。
- キャップで解決策に誘導された細胞の25μlを添加する。
- メッシュに対してピペットマンの先端を押しながら、ストレーナーを通して統合ソリューションのすべてを撃つ。
- ストレーナのキャップを押し下げて、ボルテックスチューブ。
- SC-HisまたはSC-Leuの200μlでフィルされたコレクションチューブ（1.6 mlのエッペンドルフチューブ）を用意します。
- セルソーターを起動し、メーカーの説明書に従って設定を調整します。
- 渦両方コレクションチューブ（コートに媒体と壁）とセルソーターにそれらをロードする前に細胞が入ったチューブ。
- サンプルのフローサイトメトリーデータを取得する。 GFPを含有していない株はネガティブコントロールすることができます。
- 並べ替えのためにゲートを描きます。 （）高いGFPの強度を発揮することができる細胞凝集を避けるために、FSCの高さのプロットとFSCを用いたパルス幅とパルス高MoFloソーター用または不釣り合いに小さいFSCの高さのプロットを用いて前方散乱（FSC）のために過度に大きなパルス幅の外れ値を破棄FACSAriaセルソーター（ 図5、左上のパネル）の領域。 （B）は大FSC（面積）を細胞凝集のために期待されているので、最低FSCおよび側方散乱（SSC）の細胞破片が頻繁に発見された値を使用して領域を回避しながら、唯一、FSCで下位20％に細胞を取る（ 図5、右上のパネル）。 （C）は、SSC（面積）とGFPシグナルは（面積）は、多くの場合、正の相関がある。単に上記ゲート与えられた最も明るい細胞を取っているので、高SSCの値を持つ細胞を濃縮するでしょう、各点から明るい細胞の同様の比率を取るために、GFP強度およびSSCのプロットを用いて人口の周囲に沿ってゲートを描くSSCの軸（ 図5、ボットのOM-左図）。 （C）で選択された集団は、（B）で選択された人口の0.1から1パーセントでなければなりません。
- （3.10）で与えられた基準とコレクションチューブに200個の細胞をソートします。必要に応じて一斉にプロセスについてや、より複雑な人口を必要とする他のプロジェクトのために、より多くの細胞をソートします。
- 渦コレクションチューブを培地で選別された細胞をカバーする。
- プレートジェノタイピング用YPDAプレート上の細胞のサブセット（例えば、50セル）。
- 2日間30℃で静置します。
- （1.8） - ステップ（1.5）以下〜12個のコロニーのための溶解液を作る。
- そっと先端を持つプレートに触れることにより、G418およびNATを含むYPDAプレート上のスポットにで使用されるチップ（1.5）上の残りの細胞を移す。選択された半数は、この板の上に育つべきではありません。二倍体はもっとGFPのコピーを持っていることがあるため、明るくなるかもしれません。このテストでは、半数体選択の効率を示すことができます。
- タイピングについては、10μlのPCR rを用いてライセート1μlを分析するシーケンスCCTGAGAAAGCAACCTGACCのプライマーと対になって削除された各遺伝子の上流隣接領域にアニールすることをフォワードプライマーとeaction。
可能であれば、多重PCR反応（条件は単一の変異体の溶解液を用いて決定することができる）。または384ウェルフォーマット - PCRは96で行うことができます。後者の形式は、わずか5μlの反応容量に適しています。マルチチャンネルピペットまたは液体ハンドリングロボットを用いて行うことができるPCRマスターのアレイ化するプライマー及びこれらの混合物に、細胞溶解物のほかに異なるミックス。異なるPCRミックスに同じライセートを追加するときにチップの変更は省略可能です。 - PCR産物を分析します。ジェルXLウルトラV-2の電気泳動システム（Labnet）は、マルチチャンネルピペットを用いて試料のローディングと互換性があります。
- からの情報（3.16）と（3.18）をもとに、遺伝子型を希望している可能性半数体を識別します。
- 新鮮なプレート（YPDA、CAAの浦、またはSC-Ura-His/Leu）にこれらの株を確立します。また、それらの凍結-80℃で25％グリセロール℃、そのような削除された遺伝子およびパルスフィールド·ゲル電気泳動のための野生型配列の有無の確認などの追加テストが推奨されています。
- 有用菌株と（2.1）から性的サイクルを繰り返します。
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Representative Results
4、GFP-著しい欠損を（ycl033cΔyer042wΔykl069wΔyol118cΔ）を運ぶのa-ハプロイド株は4失を運ぶのα-ハプロイド株と交配したとき（ycl033cΔydl242wΔydl227cΔyer042wΔ）、2つの欠失を持つ（ycl033cΔyer042wΔ）2系統、代表で共有結果が得られた。交配混合物は、二倍体を選択するには、G418およびNATを含むYPDA培地で培養した。結果として二倍体は、胞子形成培地で培養した。胞子はザイモリアーゼ治療、超音波処理により分散させ、半数選択培地で発芽させた。次いで、細胞を、GFPを発現するように誘導した。フローサイトメーターでゲートを使用して、細胞の集団は、残骸や細胞凝集体（ 図5）が含まれている可能性は低いことを選択しました。この集団内では、細胞の最も明るい1％がソートされています。選別された細胞とソートされていない細胞は遺伝だった彼らはプレート上のコロニーを形成した後に入力した。ランダムに選択されたコロニーは、いくつかの二倍の能力を得たことを示唆し、G418およびナット、ソートされていないサンプルに育った16コロニーのうち2つの由来の細胞、およびソートのサンプルについて育った26コロニーのうち18から細胞を含むYPDA板に出てストリークしたときハプロイド·選択マーカーを発現し、本実験では半数選択と、GFP-誘導フェーズで伝播する。二倍体は、さらにそれらが含まれているGFPのコピーをより多くの、おそらく原因ソートサンプルに富んでいた。半数体をPCRで解析した場合には、選別された細胞の欠失数の平均は0.4±5.1であった（n = 8; SEMが示されている）。これらの細胞のうちの4つは、このクロスのための6つの欠失、欠失の最大限可能な数を持っていた。ソートされていない試料の半数は3.4を持っていた±平均で0.2失（n = 14）で。
別の実験では、GFP-7著しい欠失（ がたを運ぶのa-ハプロイド株でr042wΔyer108cΔyfr057wΔykl069wΔykr011cΔylr123cΔyol118cΔ）8失を運ぶのα半数体系統と交配した（ycl033cΔydl227cΔydl242wΔyer042wΔyer108cΔyfr057wΔygl109wΔykr011cΔ）、4つの一般的な欠失を持つ（yer042wΔyer108cΔyfr057wΔykr011cΔ）は、2つの系統に含まれている。二倍体を胞子形成培地中で選択し、続いて培養すると、細胞の約20％は、顕微鏡観察（N> 100）に基づいて、胞子形成。胞子が分散して発芽させた後、得られた半数体はGFPを発現するように誘導し、上記のように蛍光に基づいてソートされた。 61ランダムに選択されたセルの一つだけが選別された細胞は、主に一倍だったことを示唆し、G418およびNATを含むYPDAプレート上に成長した。 PCR法（ 図6）を用いて分析した場合、ソートされた細胞は8.8の平均消去回数を持っていた±0.3（N = 12; SEMが示されている）、10の欠失を含む5つの細胞を含む。ランダム偏析に起因するソートされていないセルのための欠失の期待値は7.5であった。
図1。顕微鏡下で緑色のモンスター。蛍光顕微鏡写真では、非変異株（左）、ProMonster株（中央）、および16-GFPのモンスター株（右）を示しています。同じ露出、明るさ、コントラストの設定は、イメージのために使用された。
図2。グリーンモンスタープロセス。シングル変異ハプロイド（ライトグリーン） のスキームが交配されています。交尾二倍体の胞子形成時の減数分裂組換えは0-GFP細胞（オフホワイト）、1-GFP細胞（薄緑）、および2-GFP細胞（濃い緑）の混合物を生成します。流れサイトメトリーは2-GFP細胞について富化環境に配慮したセルを選択するために使用されます。統合された分子ツールは、半数体（のHis +）、α-ハプロイド（レイ+）、および二倍体（G418-とNAT-抵抗）の選択を有効にしてください。このサイクルは変化の数が増えて、軸受の株を濃縮するために繰り返されます。
図3。 GFPの削除カセットとGMToolkits。GFPの削除カセットは、GFPレポーター遺伝子および酵母形質転換マーカー（URA3）を含んでいます。 テト2プロモーターはrtTA転写因子の作用により培地中のドキシサイクリンを添加することによって誘導性である。 GFPのレベルは、タンパク質を作るために、またはそれから任意の毒性効果に耐えられるように細胞の最大容量に達した場合は、式はドキシサイクリンの濃度を下げることによってダウンしてダイヤルすることができます（私たちがやったことにも注意でも、GFPの16個のコピー）と、飽和または毒性作用を観察しない。このカセットは、PCRを用いて、特定の相同配列を付加することによって、任意の遺伝子または領域を標的とすることができる。あるいは、同一の相同配列を持つユニバーサルGFPの削除カセットは便利酵母ノックアウトコレクションの菌株におけるKanMX4 'ランディングパッド"を標的とすることができる。 YFGはあなたの好きな遺伝子を表します。縦線が付いたボックスは、DNAバーコードを表します。 GMToolkitsはCAN1遺伝子座に組み込まれています。 STE2-his5マーカーとSTE3-LEU2マーカーは専用半数がヒスチジン、それぞれ、ロイシンの非存在下で増殖する唯一のα-半数体の非存在下で増殖できるように半数体における交配型特異的に発現されています。 G418およびナットに対する抵抗性を選択すると、同時に1 GMToolkitでKanMX4軌跡およびその他の国におけるNatMX4座のために選択したので、二倍体のために選択されます。
図4。 GFPカセットの正しい統合を確認する。ユニバーサルGFPのカセットは、GFP-著しい削除に酵母の削除コレクションで利用可能な任意のKanMX4マークされ、削除を変換するために使用することができます。正しく生成されたGFPの欠失対立遺伝子は、そのカセットの先頭PCR（ステップ1.9）にアニールがバンドを作るべきだとリバースプライマーと対になって上流の隣接領域にアニールフォワードプライマーを用いたPCR反応を伴う。下流の隣接領域にアニールはカセットPCR（B）の終わりにアニールは、製品を作るべきであることをフォワードプライマーと対になっている逆方向プライマーを用いたPCR。 KanMX4カセットPCR（C）の内、あるいは標的遺伝子（PCR D）の野生型配列にアニールするプライマーを用いて、アニール2つのプライマーを用いたPCRはバンドを作り出すべきではありません。赤い矢印は、PCRプライマーを表す。ブラチ島KETは、PCR反応で増幅された領域を示しています。ボックスは、GFPカセット（緑）、KanMX4カセット（黄色）、またはお好みの遺伝子（YFG、灰色）を示します。黒い線は、酵母染色体におけるフランキング配列を示します。
図5。フローサイトメトリー。この実験では、2系統の交配から半数体子孫、遺伝子型1ycl033cΔyer042wΔykl069wΔyol118cΔと遺伝子型を持つ他のycl033cΔydl242wΔydl227cΔyer042wΔGFPを発現するように誘導した。各遺伝子の欠失は、GFPカセットを持っていた。前方散乱領域および前方散乱の高さ（P1）は、過度に大きな前方散乱領域が除外されていた持っている傾向があり、細胞凝集体（に基づいてゲー細胞による。前方散乱および側方散乱（P2）は、CEに基づいてゲーティング·セルによって最低前方散乱および側方散乱と破片を排除しながら前方散乱で下位20％のLLSが受け入れられた。側方散乱及びGFPシグナル（P3）に基づいてゲーティング·セルでは、与えられた側方散乱範囲のそれらの中の複数の蛍光細胞が採取された。 GFPを発現する、P3の人口を選択するために使用されるものと同一のゲートが陰性対照の同様に選択されたセルのための図で示されていません減数ミックスとネガティブコントロールサンプルの比較を可能にする。
図6。ソートされた菌株の遺伝子型。PCRは、下流の隣接領域にアニールがフォワードプライマーと対になっている逆方向プライマーを用いて行ったそのカセットの終わりにアニールする。バンドの存在は、GFPカセットの存在を示している。別の実験では、12株のすべてが消費することを示したyer042wΔの削除とykr011cΔの削除をTAIN。
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Discussion
我々はグリーンモンスターアプローチを開発したように、我々は、ゲノム再編成につながる、異なるGFPの交換カセット間の組換えの可能性に関心を持っていた。このような事態を軽減することに成功交配と減数分裂の複数のラウンドを受けた細胞のための私達の選択である。再配列ゲノムを持つ細胞は、同一の再調整なしに細胞に交配後少なくフィットすることが期待されています。実際、我々は、GFPカセット11との間の組換えに起因するいかなるゲノム不安定性を観察しなかった。しかし、我々はこの可能性を完全に除外することはできませんので、ユーザーが再配置のために生成された菌株をテストすることをお勧めします。パルスフィールドゲル電気泳動は、総異常を検出するために使用することができます。削除内の配列にアニールするプライマーを用いてPCRを野生型配列の有無を確認するために使用できます。
GF、確立された菌株の蛍光レベルに基づいて、Pの強度は飽和が1〜16の欠失11のテストした範囲内の問題ではないことを示唆している、削除の数とほぼ直線的な関係を持っていた。しかし、多くの非重複欠失を持つ株と後のラウンドで、私たちは親の二つにすべての削除の組合をもつ理論的にはセルに対し、各ラウンドで約2年には人口の欠失の平均数のみを増加させることができたGFPの選択のための完璧な緊縮が達成された場合、株を一度に組み合わせることができる。一つの制限は、同質の細胞の中でのGFP強度の細胞と細胞のバリエーションです。代表的な結果の2番目の例では、集団中の細胞のわずか0.8％が（11の欠失の4が両方の親の半数体によって共有されていました）は、このクロスに可能だった全11の欠失を有することが予想される。しかし、より豊富な10-欠失株は、GFPの強度の分布を持っているでしょう重なる11-Straの削除とイン。したがって、人口のさらに小さな部分は、優先的に11-欠失株のGFP強度分布の高い尾から11欠失株を選択するために選択する必要があります。一つの解決策は、単に高いGFPの強度で稀細胞を選別するためのしきい値を上げるかもしれません。別の解決策は、同時に同じテト2プロモーターを介して発現内部標準、単一のコピーに存在する異なる色の蛍光タンパク質レポーターを測定するかもしれません。この戦略は、このように正規化されたGFPの強度測定16,17の細胞と細胞の変動を低減するために外部ノイズを相殺することが予想される。
珍しいマルチ変異体を得ることの難しさは、これらの株の潜在的に遅い成長速度によって悪化する可能性がある。マルチ変異体は、フローサイトメトリーを用いて濃縮されていますが、フィッタの兄弟によって、プロセスの残りの間にoutcompetedすることができる。世代数を最小限に抑えるために、酵母菌株が受け、我々は、各ステップで選択されている目的の倍数性細胞のジャスト十分な増幅を提供する小型培養ボリュームをお勧めします。
複数削除はサイクルごとに取得することができるので、グリーンモンスターメソッドは、より迅速に、順次方法11よりも多変異を組み立てるために使用することができます。失の特定のサブセットが、合成致死の関係を持っている場合は、 "デッドエンド"は、シーケンシャルアプローチで発生する可能性があります。この制限は、欠失のフルセットを蓄積向かって可能なパスのスペースからなるサンプル緑モンスターのアプローチによって、回避することができます。グリーンモンスタープロセスのより並列大挙バージョンは、欠失の最大許容数に到達するためのパスを見つけるのに有用であることが分かるはずです。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品はFPRFPRにYSは、RSLにアルフレッド·P·スローン財団からの助成金、そして健康の助成金は、米国国立衛生研究所R01 HG003224とR21 CA130266に米国国防総省の国防高等研究計画庁契約N66001-12-C-4039でサポートされていたことだったまた、先端研究のためのカナダの研究所からの交わりによっておよびカナダの優秀研究チェアプログラムでサポートされている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| G418 | Sigma-Aldrich | A1720 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 200 mg/ml. Store at 4 °C. |
| ClonNAT (nourseothricin) | WERNER BioAgents | 5001000 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 100 mg/ml. Store at 4 °C. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Dissolve in 50% ethanol and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 10 mg/ml. Make fresh every four weeks. Shield from light using aluminum foil and store at 4 °C. |
| Zymolyase | ZymoResearch | E1005 | |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291940 | |
| Revolver (rotator for tubes) | Labnet | H5600 | |
| Enduro Gel XL electrophoresis unit | Labnet | E0160 | |
| Sonifier 450 | Branson | 101-063-198 | |
| Microtip for Sonifier 450 | Branson | 101-148-062 | |
| FACSAria cell sorter | BD | ||
| MoFlo cell sorter | Beckman-Coulter | ||
| Biomek FX or equivalent robot | Beckman Coulter | Optional. For setting up genotyping PCRs. |
References
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