Summary
绿色妖怪方法能够快速组装的多个标记的报道基因编码绿色荧光蛋白的缺失。这种方法是基于对驾驶酵母菌株通过各种各样的缺失性和携带更多的缺失的细胞的荧光为基础的浓缩的重复循环。
Abstract
只有当测试是在一个特定的遗传背景或环境条件1,2的突变表型基因缺失往往发现。有这样的例子，许多基因需要被删除，揭露隐藏的功能基因3,4。尽管有潜在的重要发现，主要涉及三个或更多的基因的遗传相互作用的探索。多突变体相互作用的穷举搜索将是不切实际的因缺失可能的组合数量之多。然而，研究选定的几套基因，如套旁系同源具有更大的先验机会共享一个共同的功能，将信息。
酵母中的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中 ，是通过更换通过同源重组的可选择标记基因与基因敲除。由于标记的数目是有限的，方法已被开发用于除去和重用的sam Ë标记5,6,7,8,9,10。然而，依次工程多个突变，使用这些方法是耗时的，因为所需要的时间以产生缺失的数量呈线性变化关系。
在这里，我们描述了常规工程酵母11多个缺失的绿色怪物的方法。在该方法中，绿色荧光蛋白（GFP）报告用于定量标签菌株缺失纳入根据每种菌株中所含的缺失（ 图1）的数量。各种各样的GFP-标记的缺失通过酵母交配和减数分裂反复多轮耦合与流式细胞富集携带更多的这些缺失导致的积累缺失株（ 图2）的菌株。并行执行多个进程，与每个每轮将一个或多个缺失的方法，可以减少应变施工所需要的时间。
内容“>的第一个步骤是，以制备单倍体单突变体被称为'ProMonsters，其中每个执行在一个已删除的位点和”工具箱“位点之一的GFP记者要么绿色妖怪GMToolkit-a或GMToolkit-α在can1Δ位点（ 图3），使用从酵母缺失集合12株，GFP标记的缺失可以方便地产生取代共同KanMX4盒中存在的一个普遍GFP - URA3片段与这些菌株。包含每个GMToolkit：无论是一个 -或α-交配型特定单倍体选择标记1，准确的两个标记，当两个GMToolkits是本，统称允许二倍体选择之一。第二个步骤是进行性循环通过的随机分类并/或减数分裂RECOMB的的缺失位点，通过它可以结合在一个单一的细胞ination，伴随着每一个周期的交配和产孢。
Protocol
1。生成ProMonsters
- 准备通用GFP替换盒扩增TETO 2-GFP标记和URA3标记从质粒pYOGM012的（氨苄青霉素抗性）使用引物序列：
：GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG和GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT（粗体地区提供磁带允许的KanMX4有针对性的更换侧翼区的同源性）。应进行的PCR反应Phusion聚合酶，HF缓冲液，和3％的二甲亚砜（New England Biolabs公司）与模板DNA浓度为0.5 ng /μl的开始。 PCR程序为98℃30秒，35个循环的98℃，持续10秒，49℃下30秒，和72℃1.5分钟。反应总体积50μl到每个转换实验提供足够的DNA。我们净化使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen公司）的产品与〜50微升的PCR反应，每列处理，但跳过的纯化步骤可能会增加转化体的产率。
另外，释放的片段，含有2-GFP的TETO和URA3标记，以及同源区KanMX4的定位中，通过使用的限制酶EcoRI（New England Biolabs公司）消化质粒pYOGM057个（氨苄青霉素抗性）。在该反应中的DNA浓度应为〜30纳克/微升。反应总体积34μL。
对于集成的GFP的盒式录像带插入的区域以外KanMX4，调整上面的相应的同源序列的PCR引物的同源性区域。 - 变换的普遍GFP缺失盒与一个单倍体的应变从该KanMX4的酵母基因敲除收集12。伍兹和Gietz 13 0.34μl的协议DNA样品（纯化的PCR产物或非纯化的限制性内切酶消化）应该用于每个变换实验。板的五分之一的转化混合物到民航局-URA板（0.67％酵母氮基，2％葡萄糖，0.6％酪蛋白氨基酸，腺嘌呤硫酸盐0.0025％，0.005％色氨酸，和2％琼脂）。
- 数列转化上一个新的CAA-市建局板获得分离菌落。
- 细胞从一个殖民地转移到YPDA板含有200μg/ ml的G418确认缺乏增长。确认成功GFP融合，进行菌落PCR步骤（1.5） - （1.9）。
- 添加取自菌落到2微升的裂解缓冲液（0.1M磷酸钠，pH值7.4，1的单元ZYMOLYASE从ZymoResearch）在0.2毫升的PCR管或96孔板的孔中的细胞。混合，通过移液的溶液中的移液管尖，满分。
- 覆盖与一滴（约20微升）的矿物油使用P200 PIPETMAN（吉尔森）。
- 在37℃孵育混合物C为20分钟，然后在95℃下进行10分钟。
- 稀释的溶胞产物用50μl水。混合该溶液通过移液和10倍。
- 1微升的溶胞产物与（A）退火上游侧翼区的正向引物配对的引物的序列CCTGAGAAAGCAACCTGACC（285 bp的从一开始的磁带盒）使用10微升的PCR反应，（B）一种反向分析引物退火到配对的引物的序列GCATTGGGTCAACAGTATAG（375 bp的从端部）的下游区域，（C）的两个引物退火到KanMX4与序列CGTACTCCTGATGATGCATG和GACGAAATACGCGATCGCTG（181 bp）的，和（D）的两个引物退火的靶基因（ 图4）的野生型序列。 （D）是很重要的，因为在删除集合约8％的菌株是已知的含有非整倍体14。正确的转化体应该是正与（A）和（B），和负的（C）和（D）。
- 要引入到的转化体的GMToolkit成1.6-ml Eppendorf管中，添加大约250,000细胞从转化菌株和250000细胞的任一RY0146（含有GMToolkit-α）或RY0148（含有GMToolkit-α）。涡街流量计。 RY0146和RY0148的基因型是MATαlyp1Δhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0can1Δ:: GMToolkit 一个 [CMVpr rtTA KanMX4 STE2pr SP-his5的]和MATαlyp1Δhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0can1Δ:: GMToolkit-α[CMVpr rtTA NatMX4 STE3pr LEU2。 Pr表示启动。细胞数，应当估计前述文化从光学密度。
- 离心800×g离心2分钟。
- 除去上清液。
- 为了允许空气交换，使使用图钉用70％乙醇处理的盖子上的孔。
- 加入50μlYPDA培养基（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，0.003％腺嘌呤hemisulfatE）。涡街流量计。
- 800×g离心5分钟离心。
- 将管在湿布框中。这可以创建一个空的提示框，一个小技巧的立场，并用湿纸巾。
- 过夜孵育箱30°C。
- 选择交配二倍体第一个裸奔的细胞在CAA浦板。板在30℃温育一天。
- 以细胞从本体区域，条纹出来，使分离的集落YPDA板（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，0.003％腺嘌呤半硫酸盐，和2％琼脂），含有200微克/毫升的G418选择二倍体含有GMToolkit-a或100微克/毫升nourseothricin（纳特）15选择二倍体含有GMToolkit-α的。
- 板在30℃温育3天。
- 从开始一个孤立的菌落，大多数的细胞转移至500微升GNA介质没有琼脂（1％酵母提取物，3％Difco公司营养肉汤，和5％葡萄糖，高压釜中的葡萄糖和其余的t他组件分别为2×的解决方案，以避免焦糖）在5毫升的培养管与盖松开。
- 水平旋转管五个小时，在30℃下旋转的轴线的需要是在管的纵向轴线平行。
- 确认所用的殖民地（1.21）市建局+的裸奔出来在CAA浦板。
- 离心管中于800×g离心2分钟。弃上清。
- 加入500μl的最小产孢培养基（1％的醋酸钾，0.005％醋酸锌;过滤灭菌）。涡街流量计。
- 离心管中于800×g离心2分钟。弃上清。
- 重复（1.25） - （1.26）的两倍。
- 加入1毫升补充有7.5微克/毫升赖氨酸，7.5微克/毫升5微克/毫升组氨酸，亮氨酸，5微克/毫升的蛋氨酸和1.25微克/毫升尿嘧啶（提高的营养缺陷型菌株的孢子形成率的最小的产孢培养基） 。涡街流量计。
- 旋转管，在室温下为一天。
- 旋转管，在30℃，2天。
- 离心机125微升该混合物在1.6-ml Eppendorf管中，在800×g离心2分钟。弃上清。
- 加入50μl的ZYMOLYASE液（100mM磷酸钠缓冲液，pH值7.4，1 M山梨糖醇，和2单位ZYMOLYASE从ZymoResearch）。混合，通过移液的溶液中的移液管尖，满分。
- 在30℃孵育1小时。
- 加入50μl0.02％NP-40。混合，通过移液的溶液中的移液管尖，满分。
- 将离心管在室温下五分钟。
- 加入500μl的水。
- 管放置在冰上。
- 超声波清洗两次这种混合物在输出设置为1（最弱的设置），使用3.2毫米的微尖SONIFIER 450（布兰森），持续15秒。在两轮之间的超声，把管上的冰〜0°C的温度返回到
- 离心管，在800×g离心5分钟。弃上清。
- 加入200μlSC-URA-（a）或SC-URA-亮氨酸（α）的介质，这取决于是否交叉为纳入GMToolkit-a或GMToolkit-α。要准备媒体，使SC-URA-的His-亮氨酸培养基（0.67％酵母氮基，2％葡萄糖，0.01％的精氨酸，天门冬氨酸0.01％，0.01％的谷氨酸，0.01％异亮氨酸，0.01％赖氨酸，0.01％蛋氨酸，苯丙氨酸0.01％，0.08％，丝氨酸，0.04％的苏氨酸，0.002％酪氨酸，0.03％缬氨酸，0.0025％腺嘌呤，0.005％色氨酸，0.003％腺嘌呤，0.005％色氨酸）和补充用无菌组氨酸或亮氨酸的使用前的最终浓度为0.01％。
- 请使用图钉用70％乙醇处理的盖子上的孔。
- 水平旋转管在30℃，2天。旋转的轴线的需要是在管的纵向轴线平行。
- 出的细胞上的SC-URA-His或SC-URA-Leu取代琼脂平板上（与上述相同的成分加2％琼脂，苏氨酸和天门冬氨酸的连胜后，必须添加utoclaving添加组氨酸，亮氨酸在浇注前）的ProMonster株的分离菌落。
2。性别骑自行车
- 旋转一个既定的GFP的缺失在100μl的SC-His的（a）或SC-亮氨酸（α）在30取决于交配型菌株的培养℃下保温过夜使用了1.6-ml Eppendorf管中。进行空气交换，使一个洞，用70％的乙醇使用图钉。水平旋转管。旋转的轴线的需要是在管的纵向轴线平行。它可以跨越多株，通过集体交配。当一个排序的试样直接用于这个目的，培养细胞在30℃在200μl2天。为了制备介质，SC-URA-His的亮氨酸培养基中添加尿嘧啶（终浓度：0.0025％）和组氨酸（0.01％）或亮氨酸（0.01％）。
- 在1.6毫升EPPE单倍体细胞250,000以及250,000的α-单倍体细胞的GFP缺失菌株混合ndorf管。涡街流量计。
- 交配这些细胞，按下面的步骤（1.11） - （1.17）。
- 配合混合物10微升转移到500μlGNA中的5毫升的培养管中的介质含有200微克/毫升的G418和100微克/毫升纳特松开盖。 OD 600起大约是0.1。
- 在30°C，24小时旋转的文化。这允许为二倍体的选择，因为只有在二倍体包含两个KanMX4的 GMToolkit-，a和NatMX4在GMToolkit-α可以生长在G418和Nat的存在（ 图3）。
- 20微升的为期一天的文化转移到500μl新鲜的GNA含G418和NAT的。 OD 600起大约是0.2。
- 旋转管在30℃，5小时，使细胞对数生长期（OD 600为〜1）。
- 按照下列步骤（1.24） - （1.38）形成孢子的二倍体和隔离孢子。
- 暂停孢子化的细胞分割成两个300微升份，并把每一个到一个单独的1.5 ml Eppendorf管中。
- 离心管，在800×g离心5分钟。弃上清。
- 一个试管中的沉淀，加入100μl的SC-他的媒介选择单倍体。其他管沉淀，加入100μlSC-Leu的培养基中，选择α-单倍体。
- 旋转管于30℃下过夜。最终OD 600应该是小于0.5。如果OD 600会变得过高的倾向，尝试在室温下培养。
- 为了诱导GFP，加入100μl新鲜的SC-（a）或SC-亮氨酸（α）中含20微克/毫升强力霉素。多西环素的最终浓度是10微克/毫升。涡街流量计。
- 旋转管在30℃下2天。
3。流式细胞仪
- 加入900μl的预滤波的TE缓冲液（pH 7.5）中含10微克/毫升多西环素的5毫升的聚丙烯管（BD猎鹰＃352063），与帽交换与细胞从5毫升的聚苯乙烯管滤网盖（BD猎鹰＃352235）。聚丙烯管中是适合流式细胞仪分析。需要去除大颗粒滤网盖。
- 轻轻地放置75微升TE缓冲液中，用强力霉素细胞滤网盖。
- 帽上的诱导后的细胞的溶液中加入25μl。
- 虽然按提示PIPETMAN对网格，拍摄的联合解决方案通过过滤器。
- 按下滤网盖和涡管。
- 准备填充用200μl的SC-His或SC-Leu的收集管（1.6毫升Eppendorf管中）。
- 启动细胞分选和调整设置，根据制造商手册。
- 涡收集管涂在墙上介质和管含有细胞，然后再装入到细胞分选仪。
- 采集的样品的流式细胞术数据。不含有GFP的应变是一种消极的控制。
- 绘制门进行排序。 （A）为了避免细胞聚集体，具有较高的GFP强度，丢弃的离群值不成比例的大脉冲宽度，前向散射（FSC）FSC高度和FSC的阴谋阴谋的脉冲宽度和脉冲高度MoFlo分拣机或小得不成比例FSC高度FACSAria分拣机的区域（ 图5，顶左面板）。 （B）由于大的FSC（地区）的预期的细胞聚集体，只需要在FSC的低20％的细胞中，同时避免与最低FSC和侧向散射（SSC）的值，其中的细胞碎片常常发现的区域（ 图5中 ，右上角面板）。 （C）SSC（区）和GFP信号（区）往往呈正相关。因为简单地把给定上面的栅极最亮的细胞也将丰富细胞与高SSC值，绘制的人口的周边使用的曲线图的GFP强度和SSC采取类似的百分比的最亮的细胞从每个点的栅极沿着的SSC的轴（ 图5，博特OM-左图）。在（C）中选择的人口，应该是0.1-1％的（B）中选择的人口。
- 200个细胞分类收集管中的标准（3.10）。对于一个集体过程或其他项目需要一个更复杂的人口，更多的细胞进行排序。
- 涡收集管细胞中等。
- 板上YPDA板用于基因分型的细胞的一个子集（例如，50个细胞）。
- 板在30℃孵育2天。
- 〜12个殖民地的步骤（1.5） - （1.8）的裂解物。
- 的残余细胞的尖端（1.5）到的光斑在YPDA板的G418和Nat用刀尖轻轻抚摸板。选择单倍体，不应该让这个板块。二倍体可能有更多的绿色荧光蛋白的副本，因此可能是美好的。这个测试可以显示单倍体选择的效率。
- 用于基因分型，1微升溶胞产物进行分析，用10微升的PCRŕeaction用的正向引物，退火上游侧翼区的每个已删除的基因的引物的序列CCTGAGAAAGCAACCTGACC搭配。
（如果可能的多重PCR反应条件，可确定使用的单突变体的裂解）。 PCR可以在96 - 或384孔的格式。后者的格式是适用于低至5微升的反应体积。阵列PCR主混合不同的引物和这些混合物的细胞裂解物的添加，可以进行使用一个多通道移液管或液体处理机器人。提示的变化是可选的，不同的PCR混合时加入裂解液。 - 分析PCR产物。凝胶XL超V-2电泳系统（Labnet），是装样使用多道移液器兼容。
- 基于信息（3.16）和（3.18），所需的基因型，确定可能的单倍体。
- 建立一个新的板（YPDA，CAA，市建局，或SC-Ura-His/Leu的的）这些菌株。此外，冻结他们在25％甘油在-80℃下建议的附加试验，如野生型序列的情况下，删除的基因和脉冲场凝胶电泳确认。
- 性循环重复（2.1），提供有用的菌株。
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Representative Results
当携带4 GFP标记的缺失（ycl033cΔyer042wΔykl069wΔyol118cΔ） 的 a-单倍体菌株杂交的α-单倍体菌株携带四个缺失（ycl033cΔydl242wΔydl227cΔyer042wΔ），有两个缺失（ycl033cΔyer042wΔ）共享由两个菌株，代表结果得到的。培养的YPDA培养基中G418和NAT选择二倍体交配混合物。将得到的二倍体在孢子形成的介质中培养。将孢子分散治疗和超声ZYMOLYASE，，发芽在单倍体选择媒体。然后将细胞诱导表达GFP。使用流式细胞仪的门，人口的细胞被选中是不可能包含碎片或细胞聚集体（ 图5）。在这个人口中，最亮的1％的细胞进行了排序。排序细胞和未分选的细胞基因型键入后，他们在盘子上形成菌落。当随机选取殖民地划线上一个的YPDA板包含G418和网络地址转换（NAT），从16个殖民地成长为未排序的样品细胞和细胞由18个26对排序的样品菌落，一些二倍体获得的能力表达一个单倍体选择标记，在这个实验中在单倍体选择和GFP-诱导阶段传播。大概是由于大量复制它们所含的GFP在排序后的样本进一步丰富二倍体。当单倍体与PCR分析，在排序的细胞缺失的平均数目为5.1±0.4组（n = 8; SEM显示）。这些细胞缺失，缺失的最大可能为这个十字架。单倍体的未分类的样本平均3.4±0.2缺失组（n = 14）。
在另一项实验中， 一个单倍体菌株7个GFP标记的缺失（ 你们r042wΔyer108cΔyfr057wΔykl069wΔykr011cΔylr123cΔyol118cΔ）杂交，单倍体菌株携带8删除的α-（ycl033cΔydl227cΔydl242wΔyer042wΔyer108cΔyfr057wΔygl109wΔykr011cΔ），有四种常见的缺失（yer042wΔyer108cΔyfr057wΔykr011cΔ）中包含两个品系。当二倍体选择和随后在产孢培养基培养，大约20％的细胞形成孢子显微镜观察的基础上（> 100）。分散和发芽孢子后，将所得的单倍体诱导表达GFP和基于荧光排序如上。 61随机选定的单元格中只有一个生长在一个的YPDA板包含G418和NAT，表明排序的主要单倍体细胞。用PCR分析（ 图6）时，则排序后的细胞的平均删除数8.8±0.3（N = 12; SEM），其中5个细胞中含有10删除。未分类的细胞产生的随机隔离缺失的预期是7.5。
图1。绿色妖怪在显微镜下的荧光显微照片表明非突变菌株（左），ProMonster应变（中），和一个16-GFP怪物的株（右）。用于图像相同的曝光，亮度和对比度设置。
图2。该计划的绿色怪物的过程。单基因突变的单倍体（浅绿色）交配。减数分裂重组配合二倍体的孢子形成过程中产生0-GFP细胞（白色），1-GFP细胞（浅绿色），和2-GFP细胞（深绿色）的混合物。流流式细胞仪是用来选择最环保的细胞富集的2-GFP细胞。集成的分子工具启用一个单倍体（他+），α-单倍体（亮氨酸+），和二倍体（G418-和Nat电阻）的选择。重复这一过程，以丰富的菌株轴承的人数不断增加的改动。
图3。 GFP删除的磁带和GMToolkits。GFP删除磁带含有绿色荧光蛋白报告基因和酵母转化标记（URA3）。 TETO 2启动子是rtTA转录因子的作用，通过在培养基中添加强力霉素诱导。如果GFP的细胞，使蛋白或容忍任何毒性作用达到最大容量，可以拨打表达降低多西环素浓度下降（但是请注意，我们做了没有观察到这样的饱和度或毒性作用，甚至有16份GFP）。该纸盒可以有针对性的特异性同源序列，利用PCR任何基因或地区，通过附加。另外，普遍具有相同的同源序列的GFP缺失盒，可以方便有针对性地KanMX4的焊盘株酵母基因敲除集合。 YFG表示您最喜爱的基因。盒垂直线表示DNA条形码。 GMToolkits集成到CAN1轨迹。 STE2-his5标记和STE3 LEU2标记表示在交配型单倍体允许只有一个单倍体组氨酸和α-单倍体增长的亮氨酸的情况下，分别在没有生长的特定方式。选择抗G418和NAT的同时选择的KanMX4轨迹在1 GMToolkit的，在其他NatMX4轨迹，从而选择二倍体。
图4。确认正确整合的GFP盒。一个普遍的GFP盒可以用于转换任何KanMX4标记删除可在酵母删除集合的GFP标记的缺失。有了一个正确生成的GFP删除等位基因，PCR反应的正向引物退火的上游侧翼区的反向引物退火（PCR A的步骤1.9）的盒式磁带的开头应该使频带配对。 PCR扩增的反向引物退火的下游侧翼区的正向引物配对，退火结束的磁带盒（PCR B）应使产品的。 PCR KanMX4盒（PCR C）内，或用两个引物退火的靶基因（PCR D）野生型序列的两个引物退火不应该产生的频带。红色箭头表示PCR引物。布拉奇市场示出PCR反应扩增的区域。方块表示的GFP盒（绿色），KanMX4盒（黄色），或您最喜爱的基因（YFG，灰色）。黑线表示的酵母染色体中的侧翼序列。
图5。在本实验中，从两个菌株，具有基因型1的横单倍体后代的流式细胞仪。ycl033cΔyer042wΔykl069wΔyol118cΔ和其他具有基因型ycl033cΔydl242wΔydl227cΔyer042wΔ被诱导表达GFP。每个基因缺失有一个GFP磁带。通过门控细胞的基础上，前方散射区和前向散射的高度（P1），细胞聚集体（其中往往有不相称的大的前向散射区被排除。通过门控单元的基础上，前向散射和侧向散射光（P2）“，”侧“LLS在较低的20％，前向散射被接受，而排除以最低的前向散射和侧向散射光的碎片。细胞的侧向散射和GFP信号（P3）的基础上，通过选通，在那些在给定的侧方散射范围采取更多的荧光细胞。要进行比较的减数分裂混合和不表达GFP，用于选择在P3群体相同的栅极中的一项中所示的图的类似选择的细胞的阴性对照的阴性对照样品。
图6。基因分型的排序的菌株进行PCR，使用的反向引物退火的下游侧翼区的正向引物配对，退火结束的磁带盒。带的存在表明了GFP磁带盒的存在。另一项实验表明，所有的12个菌株CON添的yer042w的 ΔΔ缺失和ykr011c的删除。
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Discussion
我们开发的绿色怪物的方法，我们关注的不同的GFP更换磁带的可能性之间的重组，从而导致基因组重排。成功地进行了多轮交配和减数分裂的细胞，减轻对这种可能性是我们的选择。细胞重新排列的基因组预计将不太适合交配后的单元格不相同的重排。事实上，我们并没有观察到任何导致基因组不稳定之间的重组GFP箱11。但是，我们不能完全排除这种可能性，所以建议用户测试生成的株重排。脉冲场凝胶电泳法可以用来检测毛额异常。 PCR用引物退火的序列内删除，可以使用确认的情况下的野生型序列。
基于既定的菌株，GF上的荧光水平的P强度有缺失的数量接近线性关系，表明饱和度是没有问题的，在测试的范围为1至16的缺失11。然而，即使在许多互不重叠的缺失株的淘汰赛后，我们能够在人口只增加缺失的平均数量大约在每一轮，而理论上轴承的所有删除的工会在两个亲本细胞株可以合并在一次完善严格的GFP选择。的一个限制是同源细胞的细胞 - 细胞之间的GFP强度变化。在第二个例子中的代表性的结果，只有0.8％的人口中的单元格，预计将有所有11个缺失有可能在这个横（四11删除共享两个亲本单倍体）。然而，更丰富的10缺失株的GFP强度分布有重叠的11缺失STRA插件。因此，甚至更小的部分的人口必须选择，优先选择11-缺失株从11缺失菌株的GFP强度分布较高的尾部。一种解决方案可能是简单地提高阈值进行排序罕见的细胞具有较高的GFP强度。另一种解决方案可能是同时测量的内部标准，荧光蛋白记者一种不同的颜色，这是目前的单一副本，通过相同的TETO 2启动子表达。这种策略将预计取消外部噪声减少的细胞-细胞间的变化，由此标准化GFP强度测量16,17。
获得难得多突变体的困难，可加剧了这些菌株的潜在增长缓慢。多突变体的丰富，采用流式细胞仪，但他们，可能会outcompeted在休息的过程中，钳工兄弟姐妹。为了尽量减少多少代人酵母菌株进行，我们建议小培养体积，提供刚刚足够放大的细胞在每一步中选择所需的套数。
由于多个缺失可以获取每个周期的绿色怪物的方法可以用于组装多突变体的速度比序贯法11。如果缺失的特定子集合成致死的关系，“死角”，可能会遇到顺序的方法。此限制，可以规避绿色怪物的方法，样本的空间积累了一整套的缺失可能的路径走向。更多的并行集体版本的绿色怪物过程中发现的路径达到最大允许缺失证明是有用的。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国防部高级研究计划局的合同N66001-12-C-4039支持YS，RSL，Alfred P. Sloan基金会的资助和美国国立健康补助R01 HG003224和R21 CA130266 FPRFPR也从加拿大高级研究所的奖学金，由加拿大卓越研究教席计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| G418 | Sigma-Aldrich | A1720 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 200 mg/ml. Store at 4 °C. |
| ClonNAT (nourseothricin) | WERNER BioAgents | 5001000 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 100 mg/ml. Store at 4 °C. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Dissolve in 50% ethanol and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 10 mg/ml. Make fresh every four weeks. Shield from light using aluminum foil and store at 4 °C. |
| Zymolyase | ZymoResearch | E1005 | |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291940 | |
| Revolver (rotator for tubes) | Labnet | H5600 | |
| Enduro Gel XL electrophoresis unit | Labnet | E0160 | |
| Sonifier 450 | Branson | 101-063-198 | |
| Microtip for Sonifier 450 | Branson | 101-148-062 | |
| FACSAria cell sorter | BD | ||
| MoFlo cell sorter | Beckman-Coulter | ||
| Biomek FX or equivalent robot | Beckman Coulter | Optional. For setting up genotyping PCRs. |
References
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