تحليل النسخ الجيني وحيدة الخلية التي كتبها نيون RNA Published: October 7, 2012 doi: 10.3791/4073

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Elena Ronander^1,2, Dominique C. Bengtsson^1,2, Louise Joergensen^1,2, Anja T. R. Jensen^1,2, David E. Arnot^1,2,3

¹Centre for Medical Parasitology, Department of International Health, Immunology & Microbiology, Faculty of Health Sciences, University of Copenhagen, ²Department of Infectious Diseases, Copenhagen University Hospital (Rigshospitalet), ³Institute of Infection and Immunology Research, School of Biology, University of Edinburgh

Summary

فلوري

Abstract

وتوسطت التصاق الكريات الحمراء المنجلية من المصابين (IE) لمستقبلات البطانية الإنسان خلال الإصابة بمرض الملاريا بنسبة التعبير عن المتغيرات البروتين المشفرة بواسطة PfEMP1 الجينات فار.

وفرداني P. المنجلية الجينوم تؤوي ما يقرب من 60 جينات مختلفة من فار الذي يعتقد الشخص الوحيد الذي كتب في الخلية في وقت الدم خلال المرحلة العدوى. كيف يتم تحقيق مثل هذه اللائحة يستبعد بعضها بعضا من النسخ الجيني فار غير واضح، كما هو تحديد الجينات الفردية أو فار مجموعات فرعية من الجينات المرتبطة فار المستقبلات المختلفة، وذلك من الربط الفرق على نتائج السريرية لP. المنجلية العدوى. مؤخرا، تم استدعاء النموذج النسخ يستبعد بعضها بعضا في شك من المقايسات النسخ يعتمد على الفردية P. تحديد نص في المنجلية واحد INFخلايا الدم الحمراء ected باستخدام RNA الفلورسنت في الموقع التهجين (FISH) تحليل النسخ الجيني فار من الطفيل في نوى الفردية P. IE المنجلية ^1.

هنا، نقدم بروتوكول مفصلة لتنفيذ منهجية RNA-FISH لتحليل النسخ الجيني فار في نوى وحيد من P. المنجلية المصابة الكريات الحمراء الإنسان. وتستند هذه الطريقة على استخدام digoxigenin والبيوتين التي تحمل علامات مضاد تحقيقات RNA باستخدام TSA زائد الإسفار لوح النظام ² (بيركن إلمر)، P. التحليلات المجهرية وتحديد طازجة IE المنجلية. يمكن استخدام أسلوب التهجين في الموقع لمراقبة النسخ وتنظيم مجموعة متنوعة من الجينات التي أعرب عنها خلال مراحل مختلفة من P. المنجلية دورة الحياة، وقابلة للتكيف مع الأنواع الأخرى طفيل الملاريا وغيرها من الكائنات وأنواع الخلايا.

Protocol

1. جيل من تبدي الكريات الحمر المصابة مختارة فرشلي

لهذا الفحص، ويتم الحصول على أفضل النتائج عند استخدام الثقافات اختيار طازجة للتعبير سطح PfEMP1 البروتين. في هذه التجربة سيما P. 3D7 وقد تم اختيار النسب المنجلية باستخدام الاجسام المضادة المحددة كما هو موضح سابقا ^1.

يوم 1

1. حصاد 200 ميكرولتر من خلايا الدم معبأة من P. المنجلية الثقافة التي تحتوي على 2-5٪ IE مرحلة متأخرة بواسطة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. إعادة تعليق بيليه الدم في 2 مل من 37 ° C الحارة حل الجيلاتين 0.75٪ في أنبوب العقيمة 14 مل، ويترك لمدة 15-20 دقيقة في C ° 37 للسماح للIE غير مصاب وخاتم المرحلة إلى الرواسب.
3. حصاد IE في وقت متأخر من المرحلة، أي مرحلة العليا، في أنبوب جديد 14 و مل يغسل مرتين مع 10 مل من 37 ° C الحارة RBC غسل وسائل الإعلام.
4. تمييع 50 ميكرولتر من PfEMP محددة المضادة1 الأجسام المضادة في 2 مل من 37 ° C الحارة RBC غسل وسائل الإعلام وتصفية العقيمة.
5. مزج غسلها في وقت متأخر من مرحلة IE مع أمصال مضادة للتعقيم المخفف في أنبوب العقيمة 14 مل واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف.
6. تدور باستمرار في 800 x ج لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرتين مع 10 مل من 37 ° C الحارة RBC غسل وسائل الإعلام.
7. يغسل 50 ميكرولتر من البروتين Dynabead A مرتين مع التعليق RBC غسل وسائل الإعلام باستخدام DynaMaq-15 المغناطيس.
8. إعادة تعليق على Dynabeads في 300 RBC وسائل الإعلام غسل ميكرولتر وإضافتها إلى IE وقت متأخر من مرحلة غسلها. احتضان لمدة 30 دقيقة في C ° 37 مع الإثارة لطيف.
9. نقل أنبوب إلى المغناطيس DynaMaq-15. ترك لمدة 1-2 دقيقة، وإزالة جميع السائل.
10. إعادة تعليق على Dynabeads في مل 4-5 من RBC غسل وسائل الإعلام. نقل مرة أخرى إلى أنبوب المغناطيس وترك الأمر لمدة 1-2 دقائق قبل إزالة كل السائل. كرر الخطوة غسل مرة واحدة.
11. نقل الخرز غسلها إلى 25 سم ² F الثقافة عقيمةاسك تحتوي على 200 ميكرولتر معبأة طازجة خلايا الدم الحمراء. إضافة 5-6 مل من وسائل الإعلام Albumax في الثقافة. بين عشية وضحاها في تخزين 5٪ CO ₂ في 37 ° C.

يوم 2

12. إزالة Dynabeads من الثقافة عندما IE اختيار واعادة احتلالهما في خلايا الدم الحمراء الطازجة عن طريق نقل كل ثقافة لأنبوب العقيمة 14 مل. وضع أنبوب على المغناطيس-15 DynaMaq وترك لمدة 1-2 دقيقة. ثم، من أجل عودة جميع السائل إلى قارورة الثقافة.
13. ثقافة ودورات أقل عدد ممكن حتى تطفلن الدم من 5-10٪ والطفيليات هي في ringstage.
14. وينبغي تحليل IE من FACS للتأكد من أن النمط الظاهري سطح الصحيح، لقد تم الحصول على البروتين من أي تعبير إما and/orPF11_0008 PFD1235w ^1.

2. إعداد مجسات

تم إنشاء RNA تحقيقات العقاقير من أكثر المناطق متغير من PFD1235w وفار PF11_0008 </ م> من الجينات P. المنجلية DNA 3D7 الجيني. تم تضخيم الحمض النووي عن طريق PCR والمستنسخة في ناقلات أو 19 لpSPT18 النسخ، على التوالي وفقا لوصف الشركة المصنعة (شركة روش). وصفت تحقيقات (أزواج قاعدة 580 (بي بي) و 590 BP في الطول) مع Digoxigenin (DIG) أو البيوتين باستخدام RNA DIG وضع العلامات كيت أو مزيج البيوتين وضع العلامات RNA، على التوالي. اكدنا على خصوصية كل من تحليلات تحقيقات طخة الشمالية وحيد التسمية تحليل FISH ^1.

3. رقيقة مسحة من الطفيليات وتثبيت قبل في التهجين الموضعي

يوم 1

يتم تنفيذ جميع الخطوات في بيئة خالية من ريبونوكلياز وجميع الكواشف ريبونوكلياز خالية أو ما قبل المعالجة مع pyrocarbonate اثيل (DEPC) أو ريبونوكلياز زاب (إينفيتروجن). يجب تنظيف الشرائح وتغطية زلات مع الكحول لإزالة الشحوم المتبقية التصنيع. من المهم لأداء بروتوكول دون أي توقف في الخطوات بينمن أجل تقليل مخاطر التلوث نوكلياز.

1. تقديم فيلم رقيقة الدم بواسطة الطريقة المعيارية نشر ^3. باستخدام عدسة 100X من النفط الهدف المجهر، عد IE وحساب النسبة المئوية من IE في الثقافة. تأكد من أن الطفيلي في مراحل التزامن التقريبي، في حلقة ومراحل مبكرة من أتروفة دورة IE. هذه هي مرحلة ما قبل النسخ المتماثل، مراحل أحادي nucleate، معربا عن الجينات مرنا فار واحد ومناسبة لفحوصات الخلية النسخ FISH من هذا النوع.
2. نقل 50 ميكرولتر من ثقافة الطفيلي، في تطفلن الدم من 5-10٪، إلى أنبوب 1.5 مل إيبندورف ريبونوكلياز خالية. الطرد المركزي ل1 دقيقة في 2،000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. إزالة وسائل الإعلام وإضافة 50 ميكرولتر PBS درجة الحموضة 7.2 في DEPC المعالجة المائية. تستنهض الهمم الأنبوب بلطف. كرر الخطوة الترسيب الطرد المركزي مرتين لغسل خلايا خالية من وسائل الإعلام والحطام الخلية.
4. تقديم أربعة جيدة مسحات رقيقة الجودة. لكل التشويه، تشويه جعل واحدة على1 قطرها 11 ملم جيدا من الشريحة 4 جيدا، والشرائح الزجاجية أي أربعة في المجموع، في هود ريبونوكلياز خالية (خطوة حاسمة). موجة الشرائح لفترة وجيزة في الهواء لتجف. جعل ثلاث شرائح إضافية لشريحة السلبية الضوابط واحد لتلطيخ واحد لتحقيق الجينات أي صلة أخرى باستخدام مسبار محددة، شريحة أخرى لتلقي العلاج وريبونوكلياز شريحة ثالث يتضمن IE لا يعبر عن الجينات في المصالح. ترك الشرائح لتجف على مقاعد البدلاء لمدة 10-20 دقيقة.
5. إصلاح الأغشية الرقيقة من يضيف 60 ميكرولتر من محلول يحتوي على تثبيت بارافورمالدهيد 4٪ و 5٪ حمض الخليك الجليدية في الآبار. يترك لمدة 10 دقيقة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة.
6. غسل 2X الشرائح في SSPE العازلة لمدة 5 دقائق بواسطة التحريض في درجة حرارة الغرفة لطيف. إزالة السائل الزائد لفترة وجيزة عن طريق لمس الآبار التي تحتوي على الخلايا بلطف بمنديل ورق.
7. تغطية الشرائح مع البيبسين 0.01٪ في حمض الهيدروكلوريك M 0.01 عن 2 دقيقة عند 37 ° C (خطوة حرجة للغاية). غسل 2X الشرائح في SSPE لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
8. تمييع الحل ريبونوكلياز إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل. تغطية مسحات المراقبة السلبية مع 60 ميكرولتر من محلول ريبونوكلياز. احتضان لمدة 30 دقيقة في C ° 37 وتغسل ثم الشرائح في SSPE 2X لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
9. الشروع فورا في الخطوة التهجين.

4. التهجين تحقيقات RNA على الشرائح الثابتة

يوم 1

1. إعداد غرفة التهجين، مثل ThermoStar 100 HC4 أو تلميح ماصة فارغة مربع وضعت في فرن نظيفة، عن طريق الرش مع زاب ريبونوكلياز ومسحه بمنديل تنظيف الورق. ملء قنوات للغرفة التهجين أو الجزء السفلي من مربع مع DEPC المياه المعالجة للتأكد من أن الشرائح لن تجف خلال التهجين. إغلاق الغرفة وسخن إلى 48 ° C.
2. يخفف من تحقيقات في حل التهجين إلى تركيز النهائي من 12 نانوغرام / ميكرولتر. تفسد الحل التحقيق في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كتلة التدفئة. البرد على الفور على الجليد.
3. الهواء الجاف لفترة وجيزة الشرائح بعد غسل 2X SSPE. إزالة السائل الزائد بعناية حول الآبار بمنديل ورق.
4. فتح غرفة التهجين ووضع الشرائح في الغرفة. تطبيق أحد أو كلا تحقيقات في وحدة تخزين ما مجموعه 60 ميكرولتر لكل بئر. تغطية بعناية قطرة السائل مع زلة غطاء ريبونوكلياز خالية باستخدام ملقط معقم.
5. إغلاق الغرفة وهجن الشرائح في C ° 48 للا يقل عن 16 ساعة خلال الليل.

5. اقتران الأجسام المضادة والتضخيم الإسفار

يوم 2

وتستند الخطوات التالية على نظام TSA زائد الإسفار لوح من إلمر بيركن. تتم جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة.

1. غسل الشرائح 3 مرات في المخزن المؤقت TNT لمدة 5 دقائق مع التقليب لطيف.
2. منع الآبار في 150 ميكرولتر من العازلة TNB لمدة 30 دقيقة.
3. تمييع HRP، مترافق α-DIG الأجسام المضادة في المخزن المؤقت TNB في نسبة 1:100 وHRP، مترافق الضد α-البيوتين في المخزن المؤقت TNB، بنسبة 1:500 من. إزالة أي العازلة TNB الزائدة من الشرائح بمنديل ورق. عندما كشف في وقت واحد 2 النصوص، يمكن كل من الأجسام المضادة تذهب في آن واحد. تطبيق بمبلغ إجمالي قدره 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة في TNB جيدا وبعناية مع تغطية زلة غطاء. احتضان لمدة 2 ساعة الشرائح.
4. إزالة تغطية زلات بعناية. غسل العازلة TNT الشرائح في 3 مرات لمدة 5 دقائق.
5. تمييع FITC-fluorophore في التضخيم كاشف tyramide في نسبة 1:500 وتطبيق 100 ميكرولتر من حل كل بئر. تغطية الآبار مع تغطية زلات واحتضان لمدة 12 دقيقة.
6. إزالة الغطاء ينزلق بعناية وغسل الشرائح 3 مرات لمدة 5 دقائق في المخزن المؤقت بواسطة TNT التحريض لطيف.
7. تمييع Cyan3-fluorophore في التضخيم كاشف tyramide في نسبة 1:500. إضافة 100 ميكرولتر فيكذلك من هذا الحل. تغطية الآبار مع تغطية زلات واحتضان لمدة 12 دقيقة.
8. إزالة الغطاء ينزلق بعناية وثم شطف الشرائح بسرعة عن طريق الغمر في المخزن المؤقت TNT.
9. غسل الشرائح 3 مرات مع العازلة TNT لمدة 5 دقائق.
10. تزج الشرائح بسرعة في DEPC المعالجة المائية.
11. ترك الشرائح للهواء الجاف. تحميل الشرائح مع مكافحة تتلاشى كاشف تحتوي على دابي. ختم زوايا تغطية زلات بطلاء الأظافر.
12. الشرائح جاهزة الآن للفحص المجهري. الحفاظ على الشرائح مغطاة رقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 درجات مئوية إذا كان التجربة هي ان تنجز في اليوم التالي. يمكن أن يتم الختم A كاملة من الجانبين من الشرائح يعمل 24 ساعة بعد تطبيق كاشف مكافحة تتلاشى. وهذا سوف يسمح ليمكن تصوير الشرائح لمدة تصل إلى أسبوع واحد بعد الانتهاء من البروتوكول.

6. التصور من مجسات تهجين

1. بدوره على المجهر. A المجهر القياسية المناعي هو sufficient لهذا النوع من التجربة، ولكن إذا كان لديك الوصول إلى المجهر متحد البؤر يمكنك أيضا استخدام هذه الصور ل3D أو للحصول على مقاطع الفيديو الخاصة بك من الخلايا الملون. تسمح المجهر في عملية الاحماء ل15-30 دقيقة. التبديل على جهاز الكمبيوتر والبرمجيات.
2. التحقق من جودة تلطيخ على المجهر المناعي. اختيار بقعة تحتوي على طفيليات قليلة.
3. ضبط الربح من كل الليزر يدويا. ضبط بكسل يسكن إلى 4-6 م ^-1 ق ^-1 و الخطوات إلى 512 بكسل 512 ×.
4. التقاط صورة لامدا الاختبار باستخدام الإطار. إعادة ضبط كسب الليزر.
5. اتخاذ الحد الادنى من 20 صورة جيدة واحدة من الخلايا الفلورسنت. وهناك حاجة إلى ما لا يقل عن 2-5 صور حقل يحتوي 5-20 الطفيليات من أجل الحصول على لمحة العادلة لنسبة الطفيليات إيجابية.

Representative Results

الشكل 1 يوضح المخطط الانسيابي من الخطوات الرئيسية والمدة الزمنية للمنهجية FISH RNA.

هذه سلسلة من الصور ممثل بشكل جيد والحفاظ سيئة الملون التجارب FISH مرنا باستخدام واحد P. وتظهر المنجلية IE في الشكل 2. هذه الخلايا لديها الأوالي صغيرة (1-1.5 ميكرون قطر) النواة التي اتسخت الأزرق مع دابي. أربع وعشرين ساعة بعد الغزو في كرات الدم الحمراء P. المنجلية عملية تكاثر انشطاري، أي تقسيم النووية، ويبدأ. الكشف الأمثل FISH من النسخ الجيني يحدث في حوالي فار 10-22 ساعة في هذه دورة 48 ساعة داخل كريات الدم الحمراء التحللي. تحقيقات هجن عموما مرنا الأنواع التي تظهر بجوار جثة النووي الرئيسي، في ما هو على الارجح النووية المغلف المرتبطة الشبكة الإندوبلازمية. الصور ذات نوعية جيدة في الصف A-عرض FITC (الخضراء) وCyan3-(الحمراء) تحقيقات صفت المقابلة لPFD1235w وPF11_0008 الجينات فار، على التوالي، في اختيار P. مزدوجة المنجلية الفرعي الخط، 3D7 _{PFD1235w/PF11_0008.} شارك في الترجمة من الجينات ولكن من الواضح المطلقة لا. B الصف يظهر التهجين الفقراء على حد سواء تحقيقات للطفيليات التي المتدهورة أو توقف إلى حد كبير الاختزال مرنا فار. في الصف C، يتم الحصول على التهجين FISH جيدة ولكن الحفاظ الخلوية والفقراء، كما هو موضح من قبل انتشار بشدة وتجميع الطفيليات.

الشكل 1. RNA سير التجربة FISH. ومخطط يوضح النقاط الرئيسية وتوقيت إجراء FISH.

الشكل 2. الصور متحد البؤر من RNA-FISH في اختيار مزدوجة P. يشير السيد المنجلية متزامنNA النسخ من الجينين فار مختلفة إما المسمى مع FITC (أخضر) أو Cyan3 إشارة (أحمر). تلوين دابي (الأزرق) إلى DNA الطفيليات النووية. العمودي الصف A1، B1 و C1 عرض الصور انتقال الطفيليات. مقياس بار 5 ميكرون.

Discussion

تحليل FISH RNA، وعلى النقيض من الأساليب مثل النشاف الشمالية وRT PCR-، يسمح التمييز النصوص مرنا محددة على المستوى خلية واحدة. هذا يجعل من الممكن التمييز بين الخلايا النشطة وغير النشطة transcriptionally، في هذا المثال، P. البروتوزوا الطفيلية المنجلية داخل خلايا الدم الحمراء. مثل خلية كاملة الملاحظات اللازمة وغالبا ما تكون قد كشف أنماط الترانسكربتي مهمة وجديدة ^1.

على الرغم من أن وصفت غيرها من وسائل FISH RNA ^4-10، كان هناك حاجة لوضع بروتوكول جديد والمكرر لدراسة متزامنة النسخ مرنا في فار P. المنجلية. باستخدام مجسات الكشف asRNA كأدوات، يمكن الأنماط الخاصة الزمني للنشاط مرنا المترجمة بسهولة في الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم asRNA تحقيقات في النظم التجريبية الأخرى التي من شأنها أن تدعم خصوصيتها ^1. الأخرى الحرجةكال المعلمات التي تعتبر مهمة عند وضع بروتوكول جديد يشمل التثبيت وpermeabilzation من الخلايا. وقد تم تحديد هذه الخطوات تجريبيا عن طريق اختبار الكواشف الكيميائية المختلفة على النحو المقترح من قبل مؤلفين آخرين ^5. خلصنا إلى أن من خلال الجمع بين العمل عبر رابط بطيء بارافورمالدهيد جنبا إلى جنب مع حمض الخليك تخثر مثبت نتمكن من الحصول على الحفاظ جيدا للمورفولوجيا الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن ما قبل منع الخلايا قبل إضافة تحقيقات ليست ضرورية، على غرار غيرها من البروتوكولات وصف FISH RNA ^5. وعلاوة على ذلك، في هذا البروتوكول نستخدم يغسل طيف، وخفيف البروتيني (البيبسين) وكميات قليلة في فترة حضانة قصيرة للسماح للتحقيق والأجسام المضادة لنواة نشر في وهجن مع مرنا تعلق على ER، والتقليل من الأضرار التي لحقت الأغشية المحيطة (2A1-2A4 الشكل).

بالإضافة إلى ذلك، FISH RNA وصور عالية الدقة التي تم إنشاؤها بواسطة CAMERوتعلق المجهر متحد البؤر يكشف ما إذا كان خلية معينة لتلطيخ إيجابية أم لا، وأيضا يعطي معلومات قيمة عن العلاقات المكانية بين RNA مضاد الملون والمعشق نواة دابي. حل كما في الصور في الشكل 2A4، ومرنا ويبدو أن تعلق بجانب النواة، وربما في الشبكة الإندوبلازمية، وليس على أعلى من ذلك، كما هو متوقع في صورة DNA-FISH ^11-12.

دراسات من الخلايا وحيدة تتطلب من الملاحظات العديدة والطفيليات في نقاط زمنية مختلفة للحصول على نتيجة ذات دلالة إحصائية. وهكذا، RNA تحليل FISH هو أسلوب الوقت بدلا المستهلكة التي تتطلب الصبر والتجريب كبيرة التجربة والخطأ لمعايرة هذه التقنية. كما RNA FISH هو أسلوب من المعلمات العديد من إعطاء دليل حل المشاكل إلى الخطوات الرئيسية لهذا البروتوكول في الجدول 1.

مشكلة	ممكن كاوSE	توصية
ضعف إشارة أو إشارة لا	انخفاض مرنا التعبير. تدهور مرنا. التحقيق هو المتدهورة، في بكفاءة المسمى أو منخفضة جدا في التركيز. درجة حرارة مرتفعة للغاية التهجين. طويلة جدا البيبسين العلاج. لا permeabilized الخلايا بما فيه الكفاية.	تحقق من البروتين التعبير من قبل FACS. العمل في ظل ظروف ريبونوكلياز مجانا واستخدام حلول الطازجة فقط. القيام فحص نوعية التحقيق المسمى على هلام وقارن بين الحمض النووي الريبي التحكم المسمى. جعل سلسلة المعايرة للتركيز التحقيق في الأسماك. خفض درجة حرارة التهجين تدريجي. تقليص مدة العلاج البيبسين. إطالة trea البيبسينطول tment أو محاولة أخرى المنظفات.
الفقراء الخلوية المحافظة	الطفيليات في الدم مرتفعة جدا أو الطفيليات شدد. سميكة جدا الأفلام. تنظيف سيئة الشرائح. وdeattached الخلايا على الشرائح.	ثقافة استخدام طفيل صحية تطفلن الدم عن طريق الحفاظ على أقل من 10٪ وتغيير وسائل الإعلام خلية كل يوم. تمييع الثقافة الطفيلي. تنظيف الشرائح مع الكحول والانتظار على الأقل 10 دقيقة للشرائح لتجف. استخدام الطازجة شبه الفورمالديهايد و / أو زيادة طول الحضانة بارافورمالدهيد.
ارتفاع الخلفية	مرتفعة للغاية تحقيق التركيز. عدم كفاية غسلالطفيليات. انفجار shizonts. عدم كفاية الغسيل آخر التهجين. ملوثة عازلة تمنع أو غير فعالة.	جعل سلسلة المعايرة للتركيز التحقيق في الأسماك. غسل الطفيليات مرتين قبل إعداد الأغشية الرقيقة. مزامنة الثقافة أكثر إحكاما. زيادة عدد و / أو طول يغسل. إعداد جديدة عازلة حظر. محاولة عرقلة كاشف أخرى، أو التركيز إطالة فترة حظر
سيطرة ريبونوكلياز المعالجة الإيجابية	الحل ريبونوكلياز غير نشط. منخفض جدا ريبونوكلياز التركيز. كان حضانة قصيرة جدا.	إعداد جديدة ريبونوكلياز سولونشوئها. زيادة التركيز. جعل سلسلة المعايرة. إطالة فترة العلاج ريبونوكلياز.
إيجابية كاذبة من الطفيليات الكشف المراقبة السلبية	وهذا التحقيق هو غير محددة. الطفيليات لا تعبر عن مرنا الكشف عنها من قبل لجنة التحقيق.	تحقق من خصوصية تحقيقات. تأكد من أن تستخدم خط الطفيلي هو حق واختيار طازجة.

الجدول 1. Troobleshooting التوجيه.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic Acid	Sigma/Aldrich	338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution	Lonza	BE02-012E	2.5 ml gentamycin sulphate 50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II	Invitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 liter RPMI 1640 Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite	Sigma	A5710-110G	Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate	Calbiochem	203206
Anti-Dig antibody	Novus biologicals	NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931	The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix	Roche	11685597910
Camera digital	Nikon digital sight DC-F11
Coverslips	Menzel-glaser	631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface	Nunc	156340
DEPC	Fluka/Sigma	32490-100ml	1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera	Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Magnet	Invitrogen	123-01D
Formamide bioultra 99 %	Fluka/Sigma	47671-1l-F	Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine	Sigma-Aldrich	G2500	3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin	Sigma-Aldrich	G3126	14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl	Sigma	H1758	14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x	Fluka/Sigma	47671-1l-F	Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate	Sigma	D2532	5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent	Sigma	R-6750	2 ml 50x Denhardt's 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA	Fluka/Sigma	31149-106GF	0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free	Sigma	10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope	Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish	Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O			Ajust pH to 7.4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldehyde 4 %	Fluka/chemika	76240	4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 %			950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin	Sigma/Aldrich	P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin	Calbiochem	203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate	Lonza	BE02-012E	2.5 ml gentamycin sulphate
RNase	Sigma/Aldrich		Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube	Ambion	AM12450
RNase Zap	Ambion	AM9780
Slides 4 wells 11 mm	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma/Aldrich	S9625	3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate	Sigma/aldrich	W302600	3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl	Sigma/Aldrich	S9625	175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4	Sigma/Aldrich	S0751	27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder			9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer			10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent			0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl	Sigma	T1503	1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
TNT buffer: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile	Almeco - CM LAB Aps	91016