Analys av encelliga gentranskription av RNA-lysrör Published: October 7, 2012 doi: 10.3791/4073

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Elena Ronander^1,2, Dominique C. Bengtsson^1,2, Louise Joergensen^1,2, Anja T. R. Jensen^1,2, David E. Arnot^1,2,3

¹Centre for Medical Parasitology, Department of International Health, Immunology & Microbiology, Faculty of Health Sciences, University of Copenhagen, ²Department of Infectious Diseases, Copenhagen University Hospital (Rigshospitalet), ³Institute of Infection and Immunology Research, School of Biology, University of Edinburgh

Summary

Lysrör

Abstract

Vidhäftning av Plasmodium falciparum-infekterade erytrocyter (IE) till humana endotelceller receptorer under malariainfektionerna förmedlas genom uttryck av PfEMP1 proteinvarianter kodade av VAR generna.

Den haploida P. falciparum genomet hyser ungefär 60 olika VAr gener av vilka endast en har tros vara transkriberas per cell vid en tidpunkt under blod skede av infektionen. Hur sådana ömsesidigt uteslutande reglering av var gentranskription uppnås är oklart, liksom att identifiera enskilda Var gener eller undergrupper av VaR gener associerade med olika receptorer och följden av differentierad bindande för kliniska utfallet av P. falciparum infektioner. Nyligen har ömsesidigt uteslutande transkription paradigm kallats in tvivel genom transkription analyser baserade på individuella P. falciparum avskrift identifiering enda infected erytrocytiska celler med användning av RNA-fluorescent in situ hybridisering (FISH) analys av var gentranskription av parasiten i enskilda kärnor av P. falciparum IE ^1.

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att genomföra RNA-FISH metodik för analys av var gentranskription i singel-kärnor av P. falciparum infekterade humana erytrocyter. Metoden är baserad på användning av digoxigenin-och biotin-märkt antisens-RNA-prober med hjälp av TSA Plus Fluorescens Palett System ² (Perkin Elmer), mikroskopiska analyser och nyligen valda P. falciparum IE. In situ-hybridisering metod kan användas för att övervaka transkription och reglering av ett flertal gener uttrycks under de olika stadierna av P. falciparum livscykel och kan anpassas till andra arter malariaparasiten och andra organismer och celltyper.

Protocol

1. Generering av nyligen valda infekterade erytrocyter

För denna analys är de bästa resultaten då nyligen utvalda odlingar för ytexpression av PfEMP1 protein. I detta speciella experiment 3D7 P. falciparum härstamning valdes med användning av specifika antikroppar som tidigare beskrivits ^1.

Dag 1

1. Skörd 200 pl packade blodkroppar från en P. falciparum kultur innehållande 2-5% sent stadium IE genom centrifugering vid 800 xg under 8 minuter vid rumstemperatur.
2. Återuppslamma blodet pelleten i 2 ml 37 ° C varmt 0,75% gelatinlösning i en 14 ml sterilt rör och låt stå 15-20 minuter vid 37 ° C för att tillåta den oinfekterade och ring steg IE att sedimentera.
3. Skörda det sena IE, dvs övre fasen, i en ny 14 ml tub och tvätta två gånger med 10 ml 37 ° C varmt RBC-tvätt medier.
4. Späd 50 | il av specifika anti-PfEMP1-antikroppar i 2 ml av 37 ° C varm RBC-tvätt media och sterila filter.
5. Blanda den tvättade sena IE med den steriliserade utspädda antisera i en 14 ml sterilt rör och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C med försiktig omrörning.
6. Centrifugera ner vid 800 x g under 8 minuter vid rumstemperatur, och tvätta två gånger med 10 ml 37 ° C varmt RBC-tvätt medier.
7. Tvätta 50 il Dynabead protein En suspension två gånger med RBC-tvätt media med en DynaMaq-15 magnet.
8. Resuspendera Dynabeads i 300 pl RBC-tvätt media och lägga till dem i den tvättade sena IE. Inkubera under 30 minuter vid 37 ° C med försiktig omrörning.
9. Överför röret till DynaMaq-15 magnet. Låt stå 1-2 minuter och ta bort all vätska.
10. Återsuspendera Dynabeads i 4-5 ml av RBC-tvätt medier. Överför röret tillbaka till magneten och låt den 1-2 minuter innan du tar bort all vätska. Upprepa tvättsteget gång.
11. Överför de tvättade pärlorna till en 25 cm ² steril kultur fLASK innehållande 200 ul nyligen packade röda blodkroppar. Lägg 5-6 ml Albumax medier i kulturen. Lagra över natten vid 5% CO ₂ vid 37 ° C.

Dag 2

12. Avlägsna Dynabeads från kulturen när den valda IE har reinvaded de färska röda blodkropparna genom att överföra all kulturen till en 14 ml sterilt rör. Sätt röret på DynaMaq-15 magnet och låt stå i 1-2 minuter. Sedan, häll all vätska tillbaka till en odlingskolv.
13. Kultur för så få cykler som möjligt tills en parasitemi på 5-10% och parasiter är på ringstage.
14. IE bör analyseras med FACS för att säkerställa att rätt ytan fenotypen har alltså proteinuttryck av antingen PFD1235w and/orPF11_0008 erhållits ^1.

2. Framställning av prober

Antisens-RNA-prober genererades från de mest variabla regionerna i PFD1235w och PF11_0008 var </ Em> gener från P. falciparum 3D7 genomiskt DNA. DNA amplifierades genom PCR och klonades in i pSPT18 eller 19 vektor för transkription, respektive enligt tillverkarens beskrivning (Roche). Sonderna (580 baspar (bp) och 590 bp i längd) märktes med digoxigenin (DIG) eller biotin med användning av en RNA-DIG märkning Kit eller en biotin-RNA märkning Mix, respektive. Vi bekräftade specificiteten av sonderna både genom Northern blot-analyser och genom en enda-etikett FISH-analys ^1.

3. Tunt lager och fixering av parasiter Före in situ hybridisering

Dag 1

Alla steg utförs i en RNas-fri miljö och alla reagenser är RNas-fri eller förbehandlade med dietylpyrokarbonat (DEPC) eller RNas Zap (Invitrogen). Bilderna och ympkvistar cover bör rengöras med alkohol för att avlägsna kvarvarande tillverkning fett. Det är viktigt att utföra protokollet utan någon paus mellan stegFör att minimera risken för kontamination nukleas.

1. Gör en tunn blodfilm av standarden sprida metoden ^3. Använda 100x olja objektiv med mikroskopet, räkna IE och beräkna andelen IE i kulturen. Kontrollera att parasiten stegen är i ungefärlig synkroni, i ringen och tidiga trofozoit skeden av IE cykeln. Dessa är före replikering, uni-kärnbildande stadier, uttrycker var gen-mRNA och lämpliga för enkel transkription celler FISH analyser av denna typ.
2. Överför 50 ul av parasiten kulturen, vid en parasitemi av 5-10%, till en 1,5 ml RNas-fri Eppendorf-rör. Centrifugera under 1 min vid 2.000 rpm vid rumstemperatur.
3. Ta bort materialet och tillsätt 50 ul PBS pH 7,2 i DEPC-behandlat vatten. Skaka röret försiktigt. Upprepa centrifugal sedimentering steget två gånger för att tvätta cellerna fria från media och cellrester.
4. Gör fyra god kvalitet tunna utstryk. För varje fläck, gör en smeta påen 11 mm diameter och en 4 väl bild, dvs fyra glasskivor totalt i en RNas-fri huva (ett kritiskt steg). Våg glider kort i luften för att torka. Gör tre extra bilder för negativa kontroller-en bild för enstaka prob färgning för alla andra ovidkommande genen genom användning av en specifik prob, en annan bild för RNas behandling och en tredje slid innehållande IE inte uttrycka genen av intresse. Låt bilderna torka på bänken under 10-20 minuter.
5. Fäst tunna filmer genom tillsats av 60 | il av fixeringslösning innehållande 4% paraformaldehyd och 5% isättika i brunnarna. Låt stå 10 minuter på bänken vid rumstemperatur.
6. Tvätta objektglasen i 2x SSPE-buffert under 5 min genom försiktig omrörning vid rumstemperatur. Kortfattat avlägsna överskottsvätska genom att trycka på brunnarna innehållande cellerna försiktigt med en pappersnäsduk.
7. Täck objektglasen med 0,01% pepsin i 0,01 M HCl under 2 minuter vid 37 ° C (extremt kritiska steg). Tvätta objektglasen i 2x SSPE under 5 minuter vid rumstemperatur.
8. Späd RNas lösningen till en slutlig koncentration av 10 pg / ml. Täck de negativa kontroll utstryk med 60 ul av RNas lösningen. Inkubera under 30 minuter vid 37 ° C, och sedan tvätta glasen i 2x SSPE under 5 minuter vid rumstemperatur.
9. Genast fortsätta till hybridiseringssteget.

4. Hybridisering av RNA-prober till fasta Slides

Dag 1

1. Förbered hybridisering kammare, såsom en THERMOstar 100 HC4 eller en tom pipettspets rutan sätta i en ren ugn, genom besprutning med RNas Zap och torka den ren med en pappersnäsduk. Fyll kanalerna i hybridiserings kammaren eller botten av lådan med DEPC-behandlat vatten för att säkerställa att bilderna inte torkar ut under hybridisering. Stäng kammaren och förvärma till 48 ° C.
2. Späd proberna i hybridiseringslösningen till en slutlig koncentration av 12 ng / pl. Denaturera prob lösningen vid 65 ° C under 5 min i ett värmeblock. Omedelbart kyla på is.
3. Kortfattat Lufttorka glasen efter 2x SSPE tvätten. Försiktigt bort överskottsvätska runt brunnarna med en pappersnäsduk.
4. Öppna hybridisering kammare och placera glasen i kammaren. Tillämpa en eller båda sonderna i en total volym av 60 | il per brunn. Försiktigt täcka den flytande droppe med en RNas-fri täckremsa med steril pincett.
5. Stäng kammaren och hybridiserar glasen vid 48 ° C under minst 16 timmar över natten.

5. Antikropp Konjugering och Fluorescens förstärkning

Dag 2

Följande steg är baserade på TSA Plus Fluorescens Palett system från Perkin Elmer. Alla steg utförs vid rumstemperatur.

1. Tvätta objektglasen 3 gånger i TNT-buffert under 5 min med försiktig omröring.
2. Blockera brunnarna i 150 pl TNB buffert under 30 minuter.
3. Späd HRP-konjugerad α-DIG-antikropp i TNB buffert vid ett förhållande av 1:100 och HRP-konjugerade α-biotinantikroppar i TNB buffert, vid ett förhållande av 1:500. Avlägsna överflödigt TNB buffert från bilderna med en pappersnäsduk. När detektering två transkript samtidigt kan båda antikropparna gå på en gång. Applicera en total mängd av 100 pl av antikropp-TNB-lösning per brunn och noggrant täcka med ett täckglas. Inkubera glasen för 2 timmar.
4. Ta bort täckglas försiktigt. Tvätta objektglasen i TNT-buffert 3 gånger under 5 min.
5. Späd FITC-fluoroforen i tyramid amplifieringsreagens i ett förhållande av 1:500 och applicera 100 | il av lösningen till varje brunn. Täck brunnarna med täckglas och inkubera under 12 min.
6. Ta bort locket glider noggrant och tvätta sliderna 3 gånger under 5 minuter i TNT-buffert genom försiktig skakning.
7. Späd Cyan3-fluoroforen i tyramid amplifieringsreagens vid ett förhållande av 1:500. Tillsätt 100 | il perbrunn av denna lösning. Täck brunnarna med täckglas och inkubera under 12 min.
8. Ta bort locket glider försiktigt och skölj glasen snabbt genom nedsänkning i TNT-buffert.
9. Tvätta sliderna 3 gånger med TNT-buffert under 5 min.
10. Sänk glasen snabbt i DEPC-behandlat vatten.
11. Låt bilderna lufttorka. Montera bilderna med anti-fade reagens innehållande DAPI. Försegla hörn täckglas med nagellack.
12. Objektglasen är nu redo för mikroskopi. Håll glasen täckta med aluminiumfolie och förvara vid 4 ° C om experimentet ska fyllas nästa dag. En fullständig tätning av sidorna av skivorna kan utföras 24 timmar efter applicering av anti-fade reagens. Detta kommer att tillåta objektglasen som skall avbildas i upp till en vecka efter det att protokollet har fullbordats.

6. Visualisering av hybridiserade prober

1. Slå på mikroskopet. En standard immunofluorescens mikroskop är sufficient för denna typ av experiment, men om du har tillgång till en konfokalmikroskop kan du också använda detta för 3D-bilder eller få videor av dina färgade celler. Låt mikroskop för att värma upp i 15-30 minuter. Slå på datorn och programvaran.
2. Kontrollera kvaliteten på färgningen på immunfluorescens mikroskop. Välj en plats som innehåller några parasiter.
3. Justera förstärkningen hos varje laser manuellt. Justera pixel bo till 4-6 m ^-1 s ^-1 och steg till 512 x 512 pixlar.
4. Ta en testbild med Ram Lambda. Justera lasern vinst.
5. Ta minst 20 bra bilder av fluorescerande enstaka celler. Minst 2-5 bilder av ett fält som innehåller 5-20 parasiter behövs för att få en rättvisande översikt av andelen positiva parasiter.

Representative Results

Figur 1 illustrerar ett flödesschema av de viktigaste stegen och tidslängden av RNA-FISH metoden.

En serie representativa bilder av bra och dåligt bevarade färgade experiment mRNA fiskar med enkel P. falciparum lE visas i figur 2. Denna intracellulära protozoer har en liten (1-1,5 nm diameter) kärna, som färgas blå med DAPI. Tjugofyra timmar efter erytrocyt invasionen i P. falciparum processen schizogony, dvs kärnkraft division börjar. Optimal FISK detektion av var gentranskription sker vid cirka 10-22 h i detta 48 h inom erytrocytiska lytisk cykel. Prober hybridiserar allmänhet mRNA arter som står intill de viktigaste kärn kroppen, i vad som troligen är kärnhöljet-associerad endoplasmatiska retiklet. God kvalitet bilder i rad A visar FITC-(grön) och Cyan3-(röd) märkta sönder motsvarar PFD1235w och PF11_0008 Var gener, respektive i den valda dubbla P. falciparum sub-line, 3D7 _{PFD1235w/PF11_0008.} Samlokalisering av generna är uppenbart men inte absolut. Rad B visar dålig hybridisering av båda sonderna till parasiter som har antingen ned eller i stort sett upphört transkribera var mRNA. I rad C är en god fisk hybridisering erhålls, men det cellulära bevarande är dålig, vilket framgår av dåligt sprids och aggregera parasiter.

Figur 1. RNA-FISH experiment flödesschema. Flödesschemat illustrerar de viktigaste punkterna och tidpunkten för FISH förfarandet.

Figur 2. Konfokala bilder av RNA-FISH i dubbel valt P. falciparum visar simultanous mRNA transkription av två olika Var gener märkta med antingen FITC (grön) eller Cyan3 (röd) signal. DAPI-färgning (blå) indikerar parasiten nukleärt DNA. Den vertikala raden A1, B1 och C1 visar transmissionsdata bilder av parasiterna. Skala bar 5 um.

Discussion

RNA-FISH-analys, i motsats till metoder såsom Northern blotting och RT-PCR, möjliggör diskriminering av specifika mRNA-transkript på en enda cell nivån. Detta gör det möjligt att diskriminera mellan transkriptionellt aktiva och inaktiva celler, i detta exempel, P. falciparum parasitiska protozoer inuti humana röda blodkroppar. Sådana hel-cell observationer är ofta nödvändiga och kan reda ut viktiga och nya transkriptionella mönster ^1.

Fastän andra RNA FISH metoder har beskrivits ^4-10, har det funnits ett behov av utveckling av en ny och raffinerad protokoll för studier av samtidig var mRNA-transkription i P. falciparum. Genom att använda asRNA prober som undersökningsverktyg, kan de särskilda temporala mönster av mRNA-aktivitet lätt lokaliseras i cellerna. Dessutom kan asRNA sonder också användas i andra experimentella system som skulle stödja deras specificitet ^1. Andra kritka parametrar som är viktiga när man utvecklar ett nytt protokoll innehåller fixering och permeabilzation av cellerna. Dessa steg empiriskt definierad genom att testa olika kemiska reagenser som föreslagits av andra författare ^5. Vi drog slutsatsen att genom att kombinera den långsamma agerar paraformaldehyd tvärbindare tillsammans med koaguleringsmedel fixativ ättiksyra vi kunde få en bra bevarande av vävnaden morfologi. Dessutom fann vi att pre-blockerar cellerna innan du lägger sonderna inte var nödvändigt, i likhet med andra beskrivna RNA-FISH protokoll ^5. Vidare, i det nuvarande protokollet använder vi mjuka tvättar, en mild proteas (pepsin) vid låga belopp och en kort inkubationstid för att möjliggöra för sonden och antikropparna att diffundera in i kärnan och hybridiserar med mRNA fäst på ER, minimerar skador på omgivande membran (Fig. 2A1-2A4).

Dessutom, RNA fisk och högupplösta bilder som genereras av cameren fäst vid konfokalmikroskop avslöjar huruvida en särskild cell är positivt för färgning eller inte och ger också värdefull information om de rumsliga förhållandena mellan färgade antisense-RNA och DAPI-färgade kärnan. Som beslutades på bilderna i figur 2A4 tycks mRNA fästas bredvid kärnan, förmodligen i det endoplasmatiska nätverket, och inte på toppen av det, som väntat i en DNA-FISH bild ^11-12.

Studier av enstaka celler kräver observationer av många parasiter och vid olika tidpunkter för att få ett statistiskt signifikant resultat. Således är RNA-FISH analys en ganska tidskrävande teknik som kräver tålamod och stor trial-and-error experiment för att kalibrera tekniken. Eftersom RNA-FISH är en teknik av många parametrar en felsökning snabbguide till de viktigaste stegen i detta protokoll anges i tabell 1.

Problem	Möjligt Cause	Rekommendation
Svag signal eller ingen signal	Låg mRNA-expression. mRNA nedbrytning. Probe bryts ned, märkta i-effektivt eller för låg koncentration. För hög hybridiseringstemperatur. För lång Pepsinbehandling. Celler inte permeabiliseras tillräckligt.	Kontrollera proteinexpression genom FACS. Arbeta under RNAse fria betingelser och använd endast nyberedda lösningar. Gör en kvalitetskontroll av den märkta proben på gel och jämföra till en märkt kontroll-RNA. Gör en titrering serie av sonden koncentrationen i fisk. Minska hybridiseringstemperaturen stegvis. Minska Pepsinbehandling längd. Förläng pepsin Treatment längd eller prova en annan rengöringsmedel.
Dålig cellulär bevarande	För hög parasitemin eller stressade parasiter. För tjocka filmer. Dåligt rengjorda diabilder. Cellerna på bilderna är deattached.	Använd en sund parasit kultur genom att hålla parasitemi under 10% och ändra cellmediet varje dag. Späd parasiten kulturen. Rengör glasen med alkohol och vänta minst 10 minuter för bilderna att torka. Använd nyberedda para-formaldehyd och / eller öka paraformaldehyd inkubationstiden längd.
Hög Bakgrund	För hög probkoncentration. Otillräcklig rengöring avparasiter. Spräng shizonts. Otillräckliga post hybridisering tvättar. Blockering buffert förorenat eller ineffektiva.	Gör en titrering serie av sonden koncentrationen i fisk. Tvätta parasiterna två gånger innan förbereda tunna filmer. Synkronisera kulturen hårdare. Öka antalet och / eller längden av tvättningar. Förbered ny blockeringsbuffert. Prova andra blockeringsreagens, koncentration eller förlänga blockeringsperioden
RNas behandlad kontroll är positiv	RNas lösningen är inaktiv. Alltför låg koncentration RNas. Inkubationen var alltför kort.	Förbered en ny RNas lösningning. Öka koncentrationen. Gör en titrering serie. Förläng RNAse behandlingsperioden.
Falsk positiv detektering av negativa kontrollceller parasiter	Sonden är inte specifik. Parasiter uttrycker inte mRNA detekteras av sonden.	Kontrollera specificitet sonderna. Kontrollera att parasiten linje som används är den rätta och nyligen vald.

Tabell 1. Troobleshooting vägledning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic Acid	Sigma/Aldrich	338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution	Lonza	BE02-012E	2.5 ml gentamycin sulphate 50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II	Invitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 liter RPMI 1640 Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite	Sigma	A5710-110G	Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate	Calbiochem	203206
Anti-Dig antibody	Novus biologicals	NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931	The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix	Roche	11685597910
Camera digital	Nikon digital sight DC-F11
Coverslips	Menzel-glaser	631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface	Nunc	156340
DEPC	Fluka/Sigma	32490-100ml	1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera	Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Magnet	Invitrogen	123-01D
Formamide bioultra 99 %	Fluka/Sigma	47671-1l-F	Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine	Sigma-Aldrich	G2500	3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin	Sigma-Aldrich	G3126	14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl	Sigma	H1758	14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x	Fluka/Sigma	47671-1l-F	Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate	Sigma	D2532	5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent	Sigma	R-6750	2 ml 50x Denhardt's 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA	Fluka/Sigma	31149-106GF	0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free	Sigma	10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope	Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish	Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O			Ajust pH to 7.4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldehyde 4 %	Fluka/chemika	76240	4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 %			950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin	Sigma/Aldrich	P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin	Calbiochem	203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate	Lonza	BE02-012E	2.5 ml gentamycin sulphate
RNase	Sigma/Aldrich		Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube	Ambion	AM12450
RNase Zap	Ambion	AM9780
Slides 4 wells 11 mm	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma/Aldrich	S9625	3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate	Sigma/aldrich	W302600	3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl	Sigma/Aldrich	S9625	175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4	Sigma/Aldrich	S0751	27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder			9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer			10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent			0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl	Sigma	T1503	1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
TNT buffer: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile	Almeco - CM LAB Aps	91016