Summary
Fluorescent
Abstract
L'adhérence des érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum (IE) à l'homme récepteurs endothéliaux au cours des infections de paludisme est médiée par l'expression de PfEMP1 variantes de protéines codées par les gènes var.
Le P. haploïde falciparum génome abrite environ 60 différents gènes var dont une seule a été soupçonnés d'être transcrit par cellule à la fois pendant la phase de l'infection du sang. Comment une telle réglementation mutuellement exclusif de la transcription des gènes var est atteint n'est pas claire, ainsi que l'identification des différents gènes var ou sous-groupes de gènes var associés aux différents récepteurs et les conséquences de la liaison différentielle sur les résultats cliniques de P. infections à P. falciparum. Récemment, le paradigme de la transcription mutuellement exclusive a été mise en doute par des essais de transcription individuelle sur la base de P. identification transcription falciparum chez inf uniqueète cellules érythrocytaires en utilisant l'ARN d'hybridation fluorescente in situ (FISH) de la transcription des gènes var par le parasite dans différents noyaux de P. falciparum IE 1.
Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la réalisation de la méthodologie ARN-FISH pour l'analyse de la transcription des gènes var dans un seul noyau de P. falciparum infection des érythrocytes humains. La méthode est basée sur l'utilisation de la digoxigénine marqué à la biotine et des sondes d'ARN antisens en utilisant la TSA plus Fluorescence Palette Système 2 (Perkin Elmer), des analyses microscopiques et fraîchement sélectionné P. falciparum IE. Dans le procédé d'hybridation in situ peut être utilisé pour contrôler la transcription et la régulation d'une variété de gènes exprimés au cours des différentes étapes du P. cycle de vie falciparum et est adaptable à d'autres espèces de parasites du paludisme et d'autres organismes et des types cellulaires.
Protocol
1. Génération de fraîchement sélectionnées érythrocytes infectés
Pour ce test, les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant des cultures fraîchement sélectionnés pour l'expression en surface de la protéine PfEMP1. Dans cette expérience particulière du P. 3D7 lignée falciparum a été sélectionné en utilisant des anticorps spécifiques, comme décrit précédemment 1.
Jour 1
- Récolte 200 ul de cellules sanguines emballés à partir d'un P. falciparum culture contenant 2-5% IE tardivement par centrifugation à 800 xg pendant 8 min à température ambiante.
- Remettre en suspension le culot dans 2 ml de sang de 37 ° C au chaud solution à 0,75% de gélatine dans un tube de 14 ml stérile et laisser reposer pendant 15-20 min à 37 ° C pour permettre l'IE non infectés et la bague au stade de sédiments.
- Récolter les IE au stade avancé, c'est à dire la phase supérieure, dans un nouveau tube 14 ml et laver deux fois avec 10 ml de 37 ° C chaudes RBC-lavage médias.
- Diluer 50 ul d'anticorps spécifiques anti-PfEMP1 anticorps dans 2 ml de 37 ° C chaudes RBC-lavage médias et filtre stérile.
- Mélanger la chaux stade avancé IE avec l'antisérum dilué stérilisé dans un tube de 14 ml stérile et incuber pendant 30 min à 37 ° C sous agitation douce.
- Centrifuger à 800 xg pendant 8 min à température ambiante, et laver deux fois avec 10 ml de 37 ° C chaudes RBC-lavage médias.
- Lavez 50 pi de la protéine Dynabead Une suspension à deux reprises avec RBC-lavage médias utilisant une DynaMaq-15 aimant.
- Remettre en suspension les Dynabeads dans 300 ul RBC-WASH pour les médias et les ajouter à la chaux stade avancé IE. Incuber pendant 30 min à 37 ° C sous agitation douce.
- Transférer le tube de l'aimant DynaMaq-15. Laissez-le pendant 1-2 min et éliminer tout le liquide.
- Remettre en suspension les Dynabeads dans 4-5 ml de RBC de lavage médias. Transfert à l'arrière du tube sur l'aimant et le laisser pendant 1-2 min avant de retirer tout le liquide. Répéter l'étape de lavage une fois.
- Transférer les billes lavées à un 25 cm 2 f de culture stérilelask contenant 200 ul fraîchement concentré de globules rouges. Ajouter 5-6 ml de Albumax médias dans la culture. Stockez nuit à 5% de CO 2 à 37 ° C.
Jour 2
- Supprimer les Dynabeads de la culture lorsque la ré-envahi IE a sélectionné les cellules rouges du sang frais, en transférant toute la culture dans un tube de 14 ml stérile. Placer le tube sur le DynaMaq-15 aimant et laisser reposer pendant 1-2 min. Ensuite, versez tout le retour du liquide dans un flacon de culture.
- La culture pour que les cycles possible jusqu'à une parasitémie de 5-10% et les parasites sont à l'ringstage.
- IE doivent être analysés par FACS pour s'assurer que le phénotype de surface correcte, à savoir l'expression des protéines soit and/orPF11_0008 PFD1235w a été obtenue 1.
2. Préparation des sondes
Les sondes antisens d'ARN ont été générés à partir des régions les plus variables du PFD1235w et le var PF11_0008 </ Em> des gènes de P. l'ADN génomique falciparum 3D7. L'ADN a été amplifié par PCR et cloné dans le vecteur pSPT18 ou 19 pour la transcription, respectivement selon la description du fabricant (Roche). Les sondes (580 paires de bases (pb) et 590 pb de longueur) ont été marqués par la digoxigénine (DIG) ou biotine en utilisant un kit de marquage DIG ARN ou une biotine ARN étiquetage Mix, respectivement. Nous avons confirmé la spécificité des sondes à la fois par des analyses par Northern blot et par une seule partie analyse FISH 1.
3. Frottis mince et fixation des parasites Avant hybridation in situ
Jour 1
Toutes les étapes sont réalisées dans un environnement exempt de RNase et tous les réactifs sont sans RNase ou pré-traitées avec diéthyl pyrocarbonate (DEPC) ou RNase Zap (Invitrogen). Les diapositives et les lamelles couvre-objets doivent être nettoyés avec de l'alcool pour enlever la graisse de résidu de fabrication. Il est important d'effectuer le protocole sans aucune pause entre les étapesafin de minimiser le risque de contamination nucléase.
- Faire un frottis sanguin par la méthode standard propagation 3. Utilisation de la lentille de l'objectif 100x du microscope, compter l'IE et de calculer le pourcentage d'IE dans la culture. Vérifiez que les stades parasitaires sont en synchronie approximative, dans l'anneau et les premiers stades trophozoïtes du cycle de IE. Il s'agit de la pré-réplication, uni-nucléés étapes, exprimant l'ARNm du gène var et adapté à des dosages de cellules simples de transcription POISSONS de ce type.
- Transférer 50 ul de la culture du parasite, à une parasitémie de 5-10%, 1,5 ml d'une RNase-free tube Eppendorf. Centrifuger pendant 1 min à 2.000 tours par minute à température ambiante.
- Retirez le support et ajouter 50 ul de PBS pH 7,2 en eau traitée au DEPC. Agiter doucement le tube. Répétez l'étape sédimentation centrifuge à deux reprises pour laver les cellules libres de médias et les débris cellulaires.
- Faites quatre frottis minces de bonne qualité. Pour chaque frottis, faire un frottis surun 11 mm de diamètre et d'une diapositive 4 Les diapositives de verre soit quatre au total, dans une hotte sans RNase (une étape critique). Vague glisse brièvement en l'air pour sécher. Faire trois lames supplémentaires pour les contrôles négatifs tiroir-une sonde de marquage unique pour tout autre gène pertinent à l'aide d'une sonde spécifique, une autre lame pour le traitement RNase et un troisième chariot contenant IE n'exprimant pas le gène d'intérêt. Laisser les lames sécher sur le banc pendant 10-20 min.
- Fixer les couches minces en ajoutant 60 pl de solution de fixation contenant du paraformaldéhyde à 4% et 5% d'acide acétique glacial dans le puits. Laisser reposer 10 minutes sur le banc à la température ambiante.
- Laver les lames dans un tampon 2x SSPE pendant 5 minutes par agitation douce à température ambiante. Retirez brièvement l'excès de liquide en touchant les puits contenant les cellules délicatement avec un mouchoir en papier.
- Couvrir les lames avec de la pepsine 0,01% à 0,01 M HCl pendant 2 min à 37 ° C (une étape extrêmement critique). Laver les lames en 2x SSPE pendant 5 min à température ambiante.
- Diluer la solution RNase à une concentration finale de 10 pg / ml. Recouvrir le frottis de contrôle négatif avec 60 ul de la solution de RNase. Incuber pendant 30 min à 37 ° C, puis laver les lames en 2x SSPE pendant 5 min à température ambiante.
- Procéder immédiatement à l'étape d'hybridation.
4. L'hybridation des sondes d'ARN aux diapositives fixes
Jour 1
- Préparer la chambre d'hybridation, comme un ThermoStar 100 HC4 ou une boîte vide pipette pointe mis dans un four propre, par pulvérisation avec de la RNase Zap et essuyant le nettoyer avec un mouchoir en papier. Remplir les canaux de la chambre d'hybridation ou le fond de la boîte à eau traitée au DEPC à faire en sorte que les lames ne sèche pas pendant l'hybridation. Fermer la chambre et préchauffer à 48 ° C.
- Diluer les sondes dans la solution d'hybridation à une concentration finale de 12 ng / pl. Dénaturer la solution de sonde à 65 ° C pendant 5 min dans un bloc de chauffage. Immédiatement refroidir sur glace.
- En bref l'air sécher les lames après le lavage 2x SSPE. Retirez délicatement l'excès de liquide dans le puits avec un mouchoir en papier.
- Ouvrez la chambre d'hybridation et placer les lames dans la chambre. Appliquer une ou deux sondes dans un volume total de 60 ul par puits. Couvrez soigneusement la goutte de liquide avec une lamelle RNase-free à l'aide des pinces stériles.
- Fermer la chambre et l'hybridation des lames à 48 ° C pendant au moins 16 heures pendant la nuit.
5. Conjugaison d'anticorps et d'amplification de fluorescence
Jour 2
Les étapes suivantes sont basées sur le CST Plus System Palette de fluorescence de Perkin Elmer. Toutes les étapes sont réalisées à température ambiante.
- Laver les lames 3 fois dans du tampon TNT pendant 5 min sous agitation douce.
- Bloquer le puits dans 150 ul de tampon TNB pendant 30 min.
- Diluer le conjugué HRP-α-DIG anticorps dans un tampon TNB dans un rapport de 1:100 et le conjugué HRP-α-biotine dans du tampon TNB, selon un rapport de 1:500. Retirez tout excès de tampon TNB les lames avec un mouchoir en papier. Lors de la détection deux transcrits simultanément, les deux anticorps peut aller à la fois. Appliquer un montant total de 100 ul de la solution d'anticorps-TNB par puits et soigneusement couvrir avec une lamelle. Incuber les lames pendant 2 h.
- Retirez les lamelles avec précaution. Laver les lames dans du tampon TNT 3 fois pendant 5 min.
- Diluer le FITC-fluorophore dans le réactif d'amplification tyramide à un ratio de 1:500 et appliquer 100 ul de la solution dans chaque puits. Couvrir les puits avec lamelles et laisser incuber pendant 12 min.
- Retirez le couvercle glisse avec précaution et laver les lames 3 fois pendant 5 minutes dans le tampon TNT par agitation douce.
- Diluer le Cyan3-fluorophore dans le réactif d'amplification tyramide à un rapport de 1:500. Ajouter 100 ul paret de cette solution. Couvrir les puits avec lamelles et laisser incuber pendant 12 min.
- Retirez le couvercle glisse soigneusement puis rincez rapidement les diapositives par immersion dans du tampon TNT.
- Laver les lames 3 fois avec du tampon TNT pendant 5 min.
- Immerger les lames rapidement en eau traitée au DEPC.
- Laisser les lames sécher à l'air. Monter les préparations anti-décoloration réactif contenant du DAPI. Sceller les coins des lamelles avec du vernis à ongles.
- Les diapositives sont maintenant prêts pour la microscopie. Gardez les lames recouvertes d'une feuille d'aluminium et conserver à 4 ° C si l'expérience doit être rempli le jour suivant. Une étanchéité complète des faces des lames peut être effectuée 24 heures après l'application du réactif anti-décoloration. Cela permettra aux diapositives à numériser jusqu'à une semaine après le protocole a été complété.
6. Visualisation des sondes hybridées
- Allumez le microscope. Un microscope standard immunofluorescence est sufficient pour ce genre d'expérience, mais si vous avez accès à un microscope confocal, vous pouvez également l'utiliser pour des images en 3D ou pour obtenir des vidéos de vos cellules colorées. Laissez microscope pour se réchauffer pendant 15-30 min. Allumez l'ordinateur et le logiciel.
- Vérifier la qualité de la coloration au microscope par immunofluorescence. Choisissez un endroit contenant quelques parasites.
- Ajuster le gain de chaque laser manuellement. Ajuster le séjour de pixels à 4-6 m -1 -1 s et les étapes à 512 x 512 pixels.
- Prenez une photo de test en utilisant Cadre Lambda. Réajuster le gain laser.
- Prenez un minimum de 20 bonnes photos de fluorescence des cellules individuelles. Au moins 2-5 photos d'un champ contenant 5-20 parasites sont nécessaires afin d'obtenir une vue d'ensemble juste le pourcentage des parasites positifs.
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Representative Results
La figure 1 illustre un organigramme des principales étapes et pendant la durée de la méthodologie FISH ARN.
Une série d'images représentatives de bien et mal conservés tachées expériences FISH ARNm en utilisant unique P. falciparum IE sont présentés dans la figure 2. Ce protozoaire intracellulaire a une petite (1-1.5 um de diamètre) dans le noyau qui est coloré en bleu au DAPI. Vingt-quatre heures après l'invasion érythrocytaire de P. falciparum le processus de schizogonie, c'est à dire la division nucléaire, commence. Détection optimale des poissons de la transcription des gènes var se produit aux alentours de 10-22 heures en 48 heures cette intra-érythrocytaire du cycle lytique. Sondes généralement s'hybrider à l'ARNm espèces qui apparaissent à côté du corps principal nucléaire, dans ce qui est probablement associé à enveloppe nucléaire réticulum endoplasmique. Les images de bonne qualité dans la rangée Un spectacle FITC (vert) et Cyan3-(rouge) des sondes marquées correspondant à la PFD1235w et PF11_0008 gènes var, respectivement, dans le double P. sélectionné falciparum sous-ligne, 3D7 PFD1235w/PF11_0008. Co-localisation des gènes est apparent, mais non absolue. Ligne B montre l'hybridation des deux sondes pauvres à des parasites qui ont dégradé ou en grande partie cessé de transcrire l'ARNm var. Dans la ligne C, une hybridation FISH on obtient une bonne, mais la préservation cellulaire est médiocre, comme le montre mal répartis et l'agrégation des parasites.
Figure 1. Organigramme ARN expérience FISH. L'organigramme illustre les points principaux et le calendrier de la procédure FISH.
Figure 2. Images confocales de l'ARN-FISH en double choisis P. falciparum indiquant simultanous mRNA transcription de deux gènes différents var étiquetés soit avec FITC (vert) ou Cyan3 (rouge) du signal. Coloration au DAPI (bleu) indique l'ADN parasite nucléaire. La ligne verticale a1, b1 et c1 montrer les images de transmission des parasites. Barre d'échelle 5 microns.
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Discussion
Analyse FISH ARN, contrairement aux méthodes telles que Northern blot et RT-PCR, permet la discrimination des transcrits d'ARNm spécifiques au niveau de la cellule unique. Cela permet de faire la distinction entre les cellules transcriptionnellement actifs et inactifs, dans cet exemple, P. falciparum protozoaires parasites à l'intérieur des globules rouges humains. Ces cellules entières observations sont souvent nécessaires et peuvent percer importantes et nouvelles tendances de la transcription 1.
Bien que d'autres méthodes FISH ARN ont été décrits 4-10, il ya eu une nécessité pour le développement d'un nouveau protocole et raffiné pour l'étude de la transcription de l'ARNm simultanée var dans P. falciparum. À l'aide de sondes asRNA comme outils de détection, les motifs spéciale-temporelles de l'activité d'ARNm peut être facilement localisée dans les cellules. En outre, les sondes asRNA peut également être utilisé dans d'autres systèmes expérimentaux qui appuient leur spécificité 1. Autre critiquegiques paramètres qui sont importants lors de l'élaboration d'un nouveau protocole comprend la fixation et permeabilzation des cellules. Ces étapes ont été définies empiriquement en testant divers réactifs chimiques comme suggéré par d'autres auteurs 5. Nous avons conclu que, en combinant la lenteur paraformaldéhyde agissant réticulant avec l'acide acétique coagulant fixateur nous avons pu obtenir une bonne conservation de la morphologie des tissus. En outre, nous avons constaté que de pré-blocage des cellules avant d'ajouter les sondes n'était pas nécessaire, comme pour les autres protocoles FISH ARN décrit 5. En outre, dans le présent protocole, nous utilisons lavages doux, une protéase doux (pepsine) en fonction des montants faibles et une période d'incubation courte pour permettre la sonde et les anticorps pour diffuser dans le noyau et s'hybrider avec l'ARNm fixé sur l'urgence, en minimisant le dégâts aux membranes environnantes (figure 2a1-2a4).
En outre, le FISH ARN et les images haute résolution générée par le camerune joint au microscope confocal permet de déterminer si une cellule particulière est positif pour la coloration ou non, et donne également des informations précieuses sur les relations spatiales entre l'ARN antisens taché et le noyau coloré au DAPI. Comme l'a décidé dans les images de la figure 2a4, l'ARNm semble être fixé à côté du noyau, probablement dans le réticulum endoplasmique, et non sur le dessus de celui-ci, comme prévu dans une image d'ADN-FISH 11-12.
Des études sur des cellules individuelles nécessitent des observations de nombreux parasites et à des moments différents pour obtenir un résultat statistiquement significatif. Ainsi, l'analyse FISH ARN est une technique assez de temps qui exige de la patience et beaucoup expérimentation par essais et erreurs pour calibrer la technique. Comme FISH ARN est une technique de nombreux paramètres d'un guide de dépannage pour les principales étapes de ce protocole sont donnés dans le tableau 1.
| Problème | Possibilité de prudencesoi | Recommandation |
| Signal faible ou pas de signal |
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| Mauvais cellulaire préservation |
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| Contexte grande |
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| Le contrôle est positif traité à la RNase |
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| Fausse détection positive des parasites témoins négatifs |
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Tableau 1. Troobleshooting d'orientation.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Michael Alifrangis et Ulla Abildtrup pour le génotypage des parasites et Christina Holm pour l'assistance technique excellente. Ce travail a été financé par Howard Hughes Medical Institute (subvention 55.005.511), la Fondation Lundbeck (subvention R9-A840) et par la Fondation Niels Bohr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma/Aldrich | 338826-100ml | |
| Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution |
| Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate 50 ml Albumax-solution |
| Albumax-solution: Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | 0.8 g Hypoxanthine |
| Albumax-solution: AlbuMAX II | Invitrogen | 11021-037 | 200 g Albumax |
| Albumax-solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 4 liter RPMI 1640 Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Amberlite | Sigma | A5710-110G | Resin to deionize formamide. |
| Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate | Calbiochem | 203206 | |
| Anti-Dig antibody | Novus biologicals | NB100-41330 | |
| Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely. |
| Biotin RNA Labeling Mix | Roche | 11685597910 | |
| Camera digital | Nikon digital sight DC-F11 | ||
| Coverslips | Menzel-glaser | 631-1570 | |
| culture flask 25 cm2 Nunclon surface | Nunc | 156340 | |
| DEPC | Fluka/Sigma | 32490-100ml | 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min. |
| Digital camera | Nikon digital sight DC-F11 | ||
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| DynaMaq-15 Magnet | Invitrogen | 123-01D | |
| Formamide bioultra 99 % | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper. |
| Gelatine 0.75% solution: Gelatine | Sigma-Aldrich | G2500 | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
| Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
| Glutamine solution: L-glutamin | Sigma-Aldrich | G3126 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Glutamine solution: HCl | Sigma | H1758 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide |
| Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate | Sigma | D2532 | 5 ml 20xSSC |
| Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent | Sigma | R-6750 | 2 ml 50x Denhardt's 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA |
| Hybridization solution: Salmon sperm DNA | Fluka/Sigma | 31149-106GF | 0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution) |
| Hybridizer ThermoStar 100 HC4 | Quantifoil Instruments GmbH | 1004-0011 | Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water. |
| Immersion oil UV transparent fluorescence free | Sigma | 10976-1EA | |
| Immunofluorescence or confocal microscope | Nikon D-Eclipse TE2000C | ||
| Nailpolish | Available in any drugstore | ||
| PBS 20x:NaCl KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O |
Ajust pH to 7.4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l |
||
| Paraformaldehyde 4 % | Fluka/chemika | 76240 | 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % | 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid | ||
| Pepsin | Sigma/Aldrich | P7000 | |
| Peroxidase-conjugated anti-biotin | Calbiochem | 203206 | |
| RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution |
| RBC-wash media: Gentamycin sulfate | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate |
| RNase | Sigma/Aldrich | Make a 10 mg/ml stock solution. | |
| RNase free 1.5 ml tube | Ambion | AM12450 | |
| RNase Zap | Ambion | AM9780 | |
| Slides 4 wells 11 mm | Thermo Scientific | MENZXER306W | |
| SSC 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
| SSC 20x: Sodium citrate dehydrate | Sigma/aldrich | W302600 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
| SSPE 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 175.3 g NaCl |
| SSPE 20x: NaH2PO4 | Sigma/Aldrich | S0751 | 27.6 g NaH2PO4. |
| SSPE 20x:4 EDTA powder | 9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min |
||
| TNB buffer: TNT buffer | 10 ml TNT buffer | ||
| TNB buffer: Blocking reagent | 0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
||
| TNT buffer: Tris/HCl | Sigma | T1503 | 1M Tris/HCl, pH 8.0 |
| TNT buffer: NaCl | Sigma Aldrich | S9625 | 100 ml |
| TNT buffer: Tween20 | Sigma | 93773 | 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
| TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL753000IKT | Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment. |
| Tubes 14 ml sterile | Almeco - CM LAB Aps | 91016 |
References
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