Summary
本文介绍了单细胞海藻的遗传转化
Abstract
阻碍植物科学的快速进步的共同问题，包括细胞，组织和整个生物体的复杂性，尤其是高层次的基因冗余影响在高等植物中的简单的遗传学研究。新模型的有机体Ostreococcus金牛是迄今已知最小的自由生活真核生物，拥有大大降低的基因组大小和细胞复杂1,2，表现的只是其中的大多数细胞器（线粒体，叶绿体，高尔基栈）每存在细胞，只有约8000个基因的基因组。此外，结合unicellularity和易于文化提供了一个平台，适合化学生物学方法。最近，Ostreococcus已成功地采用了以研究昼夜报时3-6的基本机制。从这个模型有机体的结果，这不仅影响植物科学，但也哺乳动物生物学7。这个例子强调如何在一个快速实验从简单的真核生物的绿色系可以加速在更复杂的生物体产生可验证的假设使用技术上是可行的，只有在这个背景降低复杂性的方法研究。在任何模式物种基因组和基因修改的可能性的知识是必不可少的工具。转录基因组1，8，9蛋白质组学这一物种的信息是免费提供的，而以前报道的方法6,10到基因改造Ostreococcus的被称为世界各地的一些实验室。
在这篇文章中，实验方法，以基因改造与过度新型模式生物电建设中概述的细节，以及列入在低百分比琼脂糖转化细胞的方法，允许选择转换线从原产单细胞。继成功Ostreoco应用日益增长的兴趣在Ostreococcus昼夜研究ccus到，可以预计从不同的研究领域内，外植物科学，包括生物技术领域。研究人员从一个保守的生化途径的生物学和医学科学的范围广泛，可考虑追求在Ostreococcus的研究，从更大的模式物种的基因组和生物体的复杂性。
Protocol
1。藻类材料的制备
- ostreococcus细胞在人工海水（ASW）的培养。海盐（通常约40克每升）溶解在去离子水的盐度30个百分点，作为衡量使用盐度米。富集培养基11,12，微量金属元素和维生素的添加，如表1-3中所述。媒体过滤灭菌，然后通过0.22μm的过滤器。
- 维修，应变OTTH95 Ostreococcus细胞分培养无菌稀释新鲜反潜每7天在1/100光与月光蓝过滤器安装在植物生长培养箱不断生长。光的强度应接近为20μmol米-2 S -1，温度保持在20°C细胞并不需要不断搅拌，但动摇一次，每2至3天，以防止聚合。
- 对于每个改造，50毫升的细胞需要在一个单元格的nsity的20-30×10 6 mL -1时 ，应达 到5-7天，继子培养。可确定近似细胞密度和axeny的的最小的X40倍率要么使用流式细胞仪或血球。
2。电
- 准备改造的DNA。对于每一个转变，5微克纯，线性化的质粒DNA在浓度为1μg/μL无菌去离子水。为了得到这种DNA，作者建议使用Qiagen公司的MIDI准备套件，尽管其他方法可能同样出色工作。消化酶减少所用的载体的骨干，但不是在转基因或选择基因产品。进一步净化和集中所产生的线性DNA，乙醇沉淀和悬浮的产品在适当的音量高品质的无菌去离子水。
- 准备改造为每个含有5微克DNA的离心管。一个contro没有DNA l是必要的，每个细胞线进行改造。这些管子置于冰上，再加上每个转换为2毫米电试管。
- 准备2.2毫升悬浮缓冲每改造。山梨糖醇溶解到1 M在DDH 2 O的解决方案，添加0.1％聚醚酸F68和过滤消毒。
- 嵌段酸F68，加入终浓度为0.1％的细胞，颗粒8000XĞ10分钟在10°C，在50 ml管锥底。吸取了立即在1毫升的悬浮液悬浮细胞，转移到离心管。 10分钟，在10°C在8000 XG降速，迅速工作，再次重复此清洗步骤。
- 用切尖，悬浮每个最终颗粒的悬浮液在40μL。加入40μL重悬细胞，每管上冰的线性化的DNA，轻轻混匀，转移到电试管。
- 放在electrop在试管祭文机。将设置更改为6千伏，600厘米-1Ω，25μF的。 Electroporate的细胞。
- 孵育10分钟的试管在室温electoporated的细胞，并利用这段时间来准备组织培养瓶中。标记并添加30毫升新鲜反潜每个。取1毫升，每个烧瓶，并轻轻将它添加到相应的试管。孵育2分钟，轻轻地取出反潜，现在含有细胞球，轻轻地，慢慢地吸取到的反潜直接在培养瓶中。
- 细胞通常保持在一个球。请注意，不要动摇或扰乱聚合的细胞，在这一刻。让细胞在孵化器中恢复1-2小时，然后通过摇动烧瓶的悬浮。在这个时候，细胞悬浮自由和无团块应该是可见的。离开文化的孵化器在一夜之间恢复。
3。列入板细胞在半固体培养基
- 从孵化器收集的转化细胞。在无菌flowhood工作，加1毫升煮沸的低熔点琼脂糖管9毫升。关闭管，由相混合。再加入0.5毫升的新鲜转化细胞，迅速拌匀，倒入盘。重复这个过程中，与其余7支试管，然后进行下变换瓶。
- 离开板打开了一个小时的流罩，琼脂糖设置。然后关闭板块和它们传送到大广场的培养皿中，将举行各4板。密封方形板机智Ĥ封口膜。请注意该板块将不会设置完全，因此，凝胶是非常脆弱的。不打破凝胶处理板时，应小心。将所有方板的孵化器。
4。转化殖民地的选择
- 菌落出现后10至21天的转换板，而不是模拟转换板。挑选菌落停产关闭提示使用200微升移液器。只需选择自由的殖民地，并吸出绿色的殖民地。照顾不包括任何细胞从邻近的殖民地。
- 转移细胞至2毫升的液体介质中含有的选择，在24孔板。当，使用Nourseothricin，使用1.75毫克/毫升。混合上下吹打起来。选择24-50％转化菌落。封口膜转移到孵化器密封板。
- 一个星期后，转移100μl每口井的2毫升新鲜反潜选择在24孔板和成长为additionaL 7天。幸存的细胞株可用于进一步的研究。稳定整合到基因组和插入号码应使用PCR和Southern分析。可以为这些目的使用任何规模下的植物DNA的提取标准方法获得基因组DNA。
5。代表结果
细胞分裂后7天增长达到1/100毫升2500万个细胞的密度。导致细胞与相应的设置电时间常数的10至14毫秒。当细胞被转移到培养基培养瓶中，细胞球形成。当一个小时后轻轻动摇，应该很容易悬浮细胞。 0.2％低熔点琼脂1毫升细胞转化纳入应导致在一个一致的，但只有半固态凝胶。殖民地后，应该会出现10至21天。当线性化的DNA转化5微克以上使用的协议，每50-100殖民地改造板是典型的预期，与阴性对照板。 〜80％回升殖民地积极选择在液体培养基中的抗生素耐药性，并在随后的研究中使用。
| 终浓度 | 原液 | 1公升体积 | |
| NANO 3 | 8.83×10 -4 M时 | 75 g / L的DH 2 O的 | 1毫升 |
| NH 4 CL | 3.63×10 -5 M时 | 2.68克/ L，DH 2 O的 | 1毫升 |
| β-甘油 | 1×10 -5 M时 | 2.16克/ L，DH 2 O的 | 1毫升 |
| H 2 SEO 3 | 1×10 -8 M | 1.29 mg / L的DH 2 O的 | 1毫升 |
| Tris碱（pH值7.2） | 1×10 -3 M | 121.1克/ L，DH 2 O的 | 1毫升 |
| ķ微量金属解决方案 | 表2 | 1毫升 | |
| f / 2的维生素解决方案 | 表3 | 0.5毫升 |
表1。 野生稻生长的培养基成分金牛 11，12。以总量1公升的人工海水盐度30个百分点，表明添加上述股票解决方案的组成部分。过滤，消毒，在一个星期内的介质和使用。汇集的维生素解决方案以外的所有化合物的股票可以添加6毫升这一解决方案，为每公升介质。
| 终浓度 | 原液 | 1公升金额 | |
| 娜2 2 O | 1×10 -4 M时 | 41.6克 | |
| 三氯化铁3•6H 2 O | 1×10 -5 M时 | 3.15克 | |
| 的Na 2 MOO 4•2H 2 O的 | 1×10 -8 M | 6.3 g / L的DH 2 O的 | 1毫升 |
| 一水硫酸锌4•7H 2 | 1×10 -9 M | 22.0克/ L，DH 2 O的 | 1毫升 |
| CoCl 2•6H 2 O | 1×10 -9 M | 10.0 g / L的DH 2 O的 | 1毫升 |
| MnCl 2·4H 2 O的 | 1×10 -8 M | 180.0克/ L，DH 2 O的 | 1毫升 |
| 硫酸铜4·5H 2 O | 1×10 -8 M | 9.8克/大号DH | 1毫升 | |
表2。微量金属溶液11,12。弥补共1升，在DH 2 O的热溶解。等分存储解决方案，并冻结。最终浓度指最终的介质中，微量金属溶液。
| 终浓度 | 原液 | 1公升金额 | |
| 维生素B 12 | 1×10 -10米 | 1 g / L的DH 2 O的 | 1毫升 |
| 素 | 1×10 -9 M | 0.1 g / L的DH 2 O的 | 10毫升 |
| 硫胺素•盐酸 | 1×10-7 M | 200毫克 |
表3。 F / 2维生素解决方案11。化妆到1公升，过滤，消毒，分装，并冻结在DH 2 O的总。最终浓度指最终介质，而不是维生素解决方案。
图1。的转型过程中的图形概览。基因改造电Ostreococcus金牛的过程示意图。
图2。文化增长。细胞分培养无菌稀释新鲜反潜的1/100，每7天，并不断与月光蓝过滤器安装在植物生长培养箱，种植。光的强度应为20μmol接近米-2 s -1及温度保持在20°C细胞并不需要不断搅拌，但有s哈肯每2至3天，以防止聚合。
图3。集落形成于0.2％低熔点琼脂糖。传输4板，一个大广场的培养皿中，用封口膜密封（左上）。已经形成的殖民地时，只需选择免费（理想锥形）殖民地（右上）和板与P200移液器吸出来。应该有阴性对照组（右下）没有殖民地。
Discussion
细胞状态和文化axeny是至关重要的转型过程中。虽然细胞通常保持在12小时光照周期，12小时黑暗，被发现在这些条件下生长的细胞转化效率不足。在重复制粒/再悬浮步骤，细胞总是容易悬浮。如果细胞聚集，或粘液样物质存在，它是更好的再次从头开始的过程。通常情况下，50殖民地，可以预计在每个转换板，与阴性对照板没有。转化效率低的情况下，应改变培养条件，以确保细胞在最佳状态。影响转化效率的变量，包括在实验室的环境温度（应该接近到20°C）和处理速度（制粒细胞[2.3]恢复[2.7]程序应采取〜1小时）。同样重要的是，所有的解决方案重新取得了新的前每个转换。列入对于板块中，低熔点琼脂糖的浓度是至关重要的。Ostreococcus细胞不会生长在高琼脂糖浓度，并会在低浓度扩散。
三个转化载体Ostreococcus已发表 过6，预计将产生更多的载体，短期内公布。现有的矢量吕克6罐允许结合的启动子的选择与使用的C-末端的萤火虫荧光素酶标记允许更快的转基因株系的选择加听话的表达模式，而进行的Potox载体6强诱导13启动子从的Ostreococcus采取高亲和磷转运（HAPT）感兴趣的基因表达的基因。 Potox吕克载体派生从Potox，携带一个额外的过度线的间接选择可以使用的荧光素酶标记
虽然过程中出现的效率低下，在此过程所需的细胞和质粒DNA的大量不构成重大障碍。每产生抗性选择标记的线，是需要单独进行分析检查，整个结构的DNA相结合，是一个较大的限制。我们观察到的例子，在选择标记的成功表达不符合利益的实际基因插入;即部分的集成可以发生。由此可见，随机插入到基因组也意味着，有没有使用此方法插入网站的控制，方法B同源重组的层次正在开发。然而，该方法这里描述的是，我们所知，目前只有特点的方法来产生转基因Ostreococcus细胞。
正如金牛Ostreococcus最近才被作为实验模式生物，大多数这些细胞的方法很可能被越来越多的研究涉及社会发展和细化。该协议旨在帮助人发起与Ostreococcus工作，但绝不声称来形容，有了解这微藻基因改造。作者的信任，读者将这个协议能够适应自己的需求小的差异，在孵化器（光水平或质量）和其他参数会存在，并有可能在每一个人的实验室进行了优化，获得此需要的健康文化协议。这里描述后掌握的技术，可以构造向量产生发光，荧光或其他标记的融合线，在控制的范围助剂。这个令人振奋的新的实验平台，将是有益的探讨如何降低复杂性，在药理方法非常方便3真核生物解决复杂的生化问题。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
SynthSys 1由BBSRC和EPSRC的奖D019621资助结合系统生物学中心。欧盟FP6的卓越“海洋生物功能基因”的拨款，以FYB网络已资助的遗传转化方法的发展。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium constituents | |||
| Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
| NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
| NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
| H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
| Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
| Na2EDTA∙2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
| FeCl3∙6H2O | 157740 | Sigma | |
| Na2MoO4∙2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
| ZnSO4∙7H2O | Z0251 | Sigma | |
| CoCl2∙6H2O | 31277 | Sigma | |
| MnCl2∙4H2O | 203734-5G | Sigma | |
| CuSO4∙5H2O | C8027 | Sigma | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
| Biotin | 47868 | Sigma | |
| Thiamine ∙ HCl | T4625 | Sigma | |
| Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
| Neomycin | N6386 | Sigma | |
| Kanamycin | K4000 | Sigma | |
| Consumables for culturing | |||
| Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
| TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
| Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon | |
| Chemicals for transformation | |||
| D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma | |
| Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma | |
| ClonNat | 51000 | Werner | |
| Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen | |
| Consumables for transformation | |||
| Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
| Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO | |
| Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad | |
| Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International | |
| Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific | |
| Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |
References
- Derelle, E. Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).
- Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. 3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell. PLoS One. 2, e749 (2007).
- O'Neill, J. S. Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote. Nature. 469, 554-558 (2011).
- van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle. Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).
- Troein, C. Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms. Plant. J. 66, 375-385 (2011).
- Corellou, F. Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus. Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).
- O'Neill, J. S., Reddy, A. B. Circadian clocks in human red blood cells. Nature. 469, 498-503 (2011).
- Monnier, A. Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles. B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).
- Le Bihan, T. Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri. J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).
- Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. Corellou, F., Bouget, F. -Y. , 201001174050 (2010).
- Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).
- Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton. J. Phycol. 23, 633-638 (1987).
- Djouani-Tari, elB. A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis. PLoS One. 6, e28471 (2011).
- Moulager, M. Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus. PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).
