Summary
इस आलेख की अनेक जीवकोष समुद्री alga की आनुवंशिक परिवर्तन का वर्णन
Protocol
1. Algal सामग्री की तैयारी
- Ostreococcus कोशिकाओं कृत्रिम समुद्री जल (ASW) में सभ्य हैं. सागर लवण (आमतौर पर के बारे में 40 ग्राम प्रति लीटर) deionised पानी में 30 की लवणता को भंग कर रहे हैं. Ppt, के रूप में मापा एक लवणता मीटर का उपयोग कर. संवर्धन 11,12 मध्यम, का पता लगाने धातु तत्व और विटामिन 1-3 तालिकाओं में वर्णित के रूप में जोड़ रहे हैं. मीडिया तो एक .22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर निष्फल है.
- रखरखाव के लिए, तनाव Ostreococcus OTTH95 कोशिकाओं उप सुसंस्कृत aseptically ताजा ASW हर 7 दिनों में 1/100 की एक कमजोर पड़ने पर और एक संयंत्र विकास इनक्यूबेटर में लगातार प्रकाश चाँदनी ब्लू फिल्टर के साथ लगे अधीन हो. प्रकाश तीव्रता के करीब 20 μmol मीटर -2 एस -1 और तापमान 20 डिग्री सेल्सियस पर रखा है कोशिकाओं लगातार आंदोलन की आवश्यकता नहीं है, लेकिन एक बार हर 2 से 3 दिनों के एकत्रीकरण को रोकने के लिए कर रहे हैं हिल.
- प्रत्येक परिवर्तन के लिए, कक्षों की 50 मिलीलीटर एक सेल डे पर आवश्यक हैंnsity 20-30 एक्स 10 6 -1 मिलीलीटर, जो 5-7 दिनों के संवर्धन के बाद उप प्राप्त किया जाना चाहिए. लगभग सेल घनत्व और axeny के के x40 बढ़ाई की एक न्यूनतम पर या तो प्रवाह cytometry या एक रुधिरकोशिकामापी के के का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है.
2. Electroporation
- डीएनए परिवर्तन के लिए तैयार करते हैं. प्रत्येक परिवर्तन के लिए, शुद्ध, linearised है प्लास्मिड डीएनए के 5 μg 1 / बाँझ deionised पानी में μg μl के एक एकाग्रता की आवश्यकता है. यह डीएनए को प्राप्त करने के लिए, लेखक क्विएज़न midi किट तैयार करने का उपयोग करने की सलाह देते हैं, हालांकि अन्य तरीकों समान रूप से अच्छी तरह से काम हो सकता है. एक एंजाइम है कि इस्तेमाल किया वेक्टर की रीढ़ की हड्डी में कटौती, लेकिन transgene या चयन जीन में नहीं के साथ उत्पाद डाइजेस्ट. इसके अलावा शुद्ध और इथेनॉल घन द्वारा परिणामस्वरूप रैखिक डीएनए ध्यान केंद्रित है, और उच्च गुणवत्ता बाँझ deionised पानी की उचित मात्रा में उत्पाद resuspend.
- Microcentrifuge प्रत्येक परिवर्तन के लिए जिसमें 5 μg डीएनए के शामिल ट्यूबों तैयार करते हैं. एक विवादके लिए प्रत्येक कोशिका लाइन तब्दील किया जा करने के लिए कोई डीएनए के साथ मैं आवश्यक है. बर्फ पर इन ट्यूबों रखें, एक साथ एक 2 मिमी प्रत्येक परिवर्तन के लिए electroporation क्युवेट के साथ.
- परिवर्तन के प्रति मेजबान बफर के 2.2 मिलीग्राम तैयार. 1 DDH 2 हे एम समाधान Sorbitol भंग करने के लिए, 0.1% pluronic F68 एसिड और फिल्टर जीवाणुरहित जोड़ें.
- शंक्वाकार नीचे के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 0.1% की कोशिकाओं के लिए एक अंतिम एकाग्रता, और उन्हें 8000X जी पर 10 मिनट के लिए 10 ° गोली सी pluronic F68 एसिड, जोड़ें. तुरंत मेजबान बफर के 1 मिलीग्राम में pipetting और नीचे कोशिकाओं, resuspend और एक microfuge ट्यूब को हस्तांतरण. 10 डिग्री सेल्सियस पर 8000 XG पर 10 मिनट के लिए नीचे, स्पिन और जल्दी से काम, इस धोने कदम एक बार और दोहराना.
- एक कटौती टिप के साथ, मेजबान बफर के 40 μl में प्रत्येक अंतिम गोली resuspend है. Resuspended कोशिकाओं के 40 μl बर्फ पर linearised डीएनए के हर ट्यूब में जोड़ें, धीरे मिश्रण और electroporation क्युवेट करने के लिए स्थानांतरण.
- क्युवेट electrop में रखोभाषण मशीन. 6 केवी -1 सेमी, 600 Ω, और 25 μF सेटिंग्स बदलें. कोशिकाओं Electroporate.
- 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर cuvettes में electoporated कोशिकाओं को सेते हैं, और उस समय का उपयोग करने के लिए टिशू कल्चर बोतल तैयार. उन्हें लेबल और प्रत्येक के लिए ताजा ASW की 30 मिलीलीटर जोड़ें. 1 मिलीग्राम प्रत्येक कुप्पी से बाहर ले जाओ और धीरे इसी क्युवेट को जोड़ने. 2 मिनट के लिए सेते हैं और धीरे ASW हटाने के, अब कोशिकाओं का छोटा गोला युक्त और धीरे और धीरे धीरे ASW में सीधे संस्कृति कुप्पी में पिपेट.
- कोशिकाओं को आमतौर पर एक छोटा गोला में रहते हैं. हिला या इस पल में एकत्रित कोशिकाओं परेशान परवाह नहीं है ले लो. कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में 1-2 घंटे के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें, तो बोतल मिलाते द्वारा resuspend. इस समय, कोशिकाओं आज़ादी resuspend clumps को नहीं दिखाई जानी चाहिए चाहिए. इनक्यूबेटर में रात भर ठीक संस्कृतियों छोड़ दें.
3. प्लेट्स पर कक्ष की अर्ध ठोस मध्यम में शामिल
- इनक्यूबेटर से बदल कोशिकाओं को ले लीजिए. एक बाँझ flowhood में कार्य करना, ट्यूबों के 9 मिलीलीटर उबलते LMP से agarose के 1 मिलीग्राम जोड़ें. ट्यूब बंद करें, और inverting के द्वारा मिश्रण. तो हौसले से बदल कोशिकाओं के 0.5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, जल्दी मिश्रण और प्लेट में डाल देना. शेष 7 ट्यूबों के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएँ और फिर अगले परिवर्तन कुप्पी के लिए आगे बढ़ना.
- प्लेटों को एक घंटे के लिए प्रवाह हुड में खोलते हैं, agarose स्थापित करने के लिए छोड़ दें. तो प्लेटों को बंद करें और उन्हें बड़े वर्ग पेट्री डिश है, जो 4 प्रत्येक प्लेट का आयोजन करेगा करने के लिए स्थानांतरण. वर्ग प्लेटें बुद्धि सीलघंटे parafilm. ध्यान दें कि प्लेटों को पूरी तरह से सेट नहीं होगा, और एक परिणाम के रूप में, जेल बहुत नाजुक है. देखभाल के लिए जेल नहीं तोड़ जब प्लेट से निपटने के लिए लिया जाना चाहिए. इनक्यूबेटर में सभी वर्ग प्लेट रखें.
4. परिवर्तित कालोनियों का चयन
- कालोनियों परिवर्तन प्लेटों पर 10 से 21 दिनों के बाद, लेकिन नकली तब्दील प्लेटों पर नहीं दिखाई देनी चाहिए. लेने कालोनियों कटौती बंद सुझावों के साथ एक 200 μl विंदुक उपयोग. बस मुक्त कालोनियों का चयन करें और बाहर हरे कॉलोनी चूसना. पड़ोसी कालोनियों से कोई कोशिकाओं को शामिल नहीं करने के लिए ध्यान रखना.
- तरल चयन युक्त मध्यम 2 मिलीलीटर कोशिकाओं को एक 24 कुओं थाली में स्थानांतरण. जब Nourseothricin का उपयोग, 1.75 मिलीग्राम / एमएल का उपयोग करें. Pipetting और नीचे मिश्रण. परिवर्तन प्रति 24-50 कालोनियों का चयन करें. प्लेटें सील parafilm और इनक्यूबेटर करने के लिए स्थानांतरण के साथ.
- एक सप्ताह के बाद, 2 मिलीलीटर ताजा ASW 24 कुओं थाली में चयन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से 100 μl और हस्तांतरण एक additiona के लिए वृद्धिएल 7 दिनों. जीवित कोशिका लाइनों आगे के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जीनोम और प्रविष्टि संख्या में स्थिर एकीकरण का उपयोग पीसीआर और दक्षिणी ब्लाट विश्लेषण किया जाना चाहिए. जीनोमिक डीएनए के इन प्रयोजनों के लिए किसी भी नीचे पहुंचा संयंत्र डीएनए निष्कर्षण के लिए मानक पद्धति का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
कोशिकाओं को विभाजित 1/7 दिनों के लिए बढ़ रहा है के बाद 100 मिली लीटर प्रति 25 लाख कोशिकाओं के घनत्व पर पहुंच गया. उचित सेटिंग्स के साथ कोशिकाओं के electroporation एक समय लगातार 10 और 14 के बीच मिलीसेकेंड में हुई. जब कोशिकाओं संस्कृति बोतल में माध्यम से स्थानांतरित कर रहे हैं, कोशिकाओं का एक छोटा गोला फार्म चाहिए. जब हल्के ढंग से एक घंटे के बाद हिल, कोशिकाओं को आसानी resuspend चाहिए. 1 मिलीग्राम बदल कोशिकाओं के 0.2% LMP से अगर में शामिल एक सुसंगत लेकिन केवल अर्द्ध ठोस जेल में परिणाम चाहिए. कालोनियों के 10 से 21 दिनों के बाद दिखाई देनी चाहिए. जब 5 linearised डीएनए के μg बदलने प्रोटोकॉल ऊपर का उपयोग, परिवर्तन प्रति 50-100 कालोनियोंथाली आम तौर पर नकारात्मक नियंत्रण प्लेट पर कोई बनाम उम्मीद थी. ~ उठाया कालोनियों के 80% सकारात्मक तरल माध्यम में एंटीबायोटिक प्रतिरोध के द्वारा चयन किया गया था और बाद के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया.
| अंतिम एकाग्रता | स्टॉक समाधान | एक लीटर के लिए वॉल्यूम | |
| 3 नैनो | 8.83 x 10 -4 एम | 75 ग्राम / एल DH 2 हे | 1 एमएल |
| 4 सीएल राष्ट्रीय राजमार्ग | 3.63 x 10 -5 एम | 2.68 ग्राम / एल DH 2 हे | 1 एमएल |
| β-glycerophosphate | 1 एक्स 10 -5 एम | 2.16 छ / एल DH 2 हे | 1 एमएल |
| एच 2 3 एसईओ | 1 एक्स 10 -8 एम | 1.29 मिलीग्राम / एल DH 2 हे | 1 एमएल |
| Tris आधार (7.2 पीएच) | 1 एक्स 10 -3 एम | 121.1 छ / एल DH 2 हे | 1 एमएल |
| कश्मीर का पता लगाने धातु समाधान | तालिका 2 | 1 एमएल | |
| / च विटामिन समाधान 2 | तालिका 3 | 0.5 एमएल |
तालिका 1. ओ के विकास के लिए मध्यम घटक 11 tauri, 12. 30 ppt की लवणता को कृत्रिम समुद्री जल के 1 लीटर की कुल मात्रा और शेयर समाधान से ऊपर घटकों को जोड़ने के रूप में संकेत दिया. फ़िल्टर और एक सप्ताह के भीतर मध्यम उपयोग बाँझ. विटामिन समाधान को छोड़कर सभी यौगिकों का स्टॉक करने के लिए माध्यम के हर लीटर के लिए इस समाधान के 6 मिलीग्राम जोड़ने के लिए जमा किया जा सकता है.
| अंतिम एकाग्रता | स्टॉक समाधान | 1 लीटर के लिए राशि | |
| दो ना 2 हे | 1 एक्स 10 -4 एम | 41.6 छ | |
| 3 FeCl • 6 ओ 2 | 1 एक्स 10 -5 एम | 3.15 छ | |
| ना Moo 2 4 • 2H 2 हे | 1 एक्स 10 -8 एम | 6.3 छ / एल DH 2 हे | 1 एमएल |
| 4 ZnSO • 7 2 हे | 1 एक्स 10 -9 एम | 22.0 छ / एल DH 2 हे | 1 एमएल |
| 2 CoCl • 6 2 हे | 1 एक्स 10 -9 एम | 10.0 छ / एल DH 2 हे | 1 एमएल |
| 2 MnCl • 4H 2 हे | 1 एक्स 10 -8 एम | 180.0 छ / एल DH 2 हे | 1 एमएल |
| 4 CuSO • 5H 2 हे | 1 एक्स 10 -8 एम | 9.8 छ / एल DH | 1 एमएल | |
तालिका 2. धातु 11,12 समाधान ट्रेस. 1 लीटर की कुल DH 2 हे, और भंग करने के लिए गर्मी के लिए तैयार करें. अशेष भाजक और भंडारण समाधान के लिए फ्रीज. अंतिम सांद्रता संकेत दिया अंतिम नहीं मध्यम, धातु का पता लगाने के समाधान के लिए देखें.
| अंतिम एकाग्रता | स्टॉक समाधान | 1 लीटर के लिए राशि | |
| विटामिन 12 B | 1 एक्स 10 -10 एम | 1 जी / एल DH 2 हे | 1 एमएल |
| बायोटिन | 1 एक्स 10 -9 एम | 0.1 छ / एल DH 2 हे | 10 मिलीलीटर |
| Thiamine • एचसीएल | 1 एक्स 10 -7 एम | 200 मिलीग्राम |
तालिका 3. च / 2विटामिन 11 समाधान DH 2 हे, फिल्टर बाँझ बनाना, अशेष भाजक और फ्रीज में 1 लीटर की कुल करने के लिए सुनिश्चित करें. अंतिम सांद्रता संकेत दिया अंतिम मध्यम, विटामिन समाधान नहीं करने के लिए देखें.
आकृति 1. परिवर्तन प्रक्रिया की आलेखीय सिंहावलोकन के लिए आनुवंशिक electroporation द्वारा Ostreococcus tauri को बदलने की प्रक्रिया के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.
चित्रा 2. संस्कृति विकास. कक्ष उप सुसंस्कृत aseptically ताजा ASW में 1/100 के कमजोर पड़ने के हर 7 दिनों में और एक संयंत्र विकास इनक्यूबेटर में लगातार प्रकाश चाँदनी ब्लू फिल्टर के साथ लगे अधीन हो. प्रकाश की तीव्रता करीब 20 μmol -2 मीटर -1 है और तापमान 20 डिग्री सेल्सियस कक्ष लगातार आंदोलन की आवश्यकता नहीं है बनाए रखा है होना चाहिए, लेकिन एस रहे हैंहर 2 से 3 दिन में एक बार haken करने के लिए एकत्रीकरण को रोकने के लिए.
चित्रा 3. 0.2% LMP से agarose पर कॉलोनी के गठन के एक बड़े वर्ग पेट्री डिश में 4 प्लेटों के स्थानांतरण, और parafilm (ऊपर छोड़ दिया) के साथ सील. जब कालोनियों का गठन किया है, बस मुक्त कालोनियों (आदर्श शंकु के रूप में आकार) (शीर्ष सही) का चयन करें और उन एक P200 विंदुक के साथ थाली के बाहर चूसना. नकारात्मक नियंत्रण (नीचे सही) पर कोई कालोनियों होना चाहिए.
Discussion
सेलुलर राज्य और संस्कृति axeny परिवर्तन की प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है. हालांकि कोशिकाओं को आम तौर पर 12 प्रकाश घंटे के चक्र में रखा जाता है, 12 घंटे अंधेरे, इन परिस्थितियों में विकसित कोशिकाओं में परिवर्तन दक्षता के लिए अपर्याप्त होना पाया गया. दोहराया / pelleting मेजबान चरणों के दौरान, कोशिकाओं हमेशा आसानी से resuspend चाहिए. यदि कोशिकाओं, कुल, या बलगम की तरह पदार्थ मौजूद है, यह बेहतर है शुरू से ही प्रक्रिया फिर से शुरू. आमतौर पर, ~ 50 कालोनियों प्रत्येक परिवर्तन थाली पर उम्मीद की जा सकता है, नकारात्मक नियंत्रण प्लेट पर कोई भी बनाम. कम परिवर्तन दक्षता के मामले में, संवर्धन शर्तों कोशिकाओं इष्टतम राज्य में कर रहे हैं करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए अलग किया जाना चाहिए. चर कि परिवर्तन दक्षता प्रभावित प्रयोगशाला में परिवेश तापमान (20 डिग्री सेल्सियस के करीब होना चाहिए) और हैंडलिंग गति (कोशिकाओं वसूली के लिए [2.7] [2.3] pelleting से प्रक्रिया ~ 1 घंटा लेना चाहिए) शामिल हैं. यह भी महत्वपूर्ण है कि सभी एक समाधानफिर प्रत्येक परिवर्तन से पहले ताजा कर दिया. प्लेटों में शामिल करने के लिए, LMP से agarose की एकाग्रता महत्वपूर्ण है Ostreococcus कोशिकाओं. उच्च agarose सांद्रता में विकास नहीं होगा, और कम मात्रा में फैलाना होगा.
तीन Ostreococcus के लिए परिवर्तन वैक्टर पहले 6 प्रकाशित किया गया है, और अधिक वैक्टर को उत्पन्न करने और शीघ्र ही प्रकाशित की उम्मीद कर रहे हैं. मौजूदा वेक्टर 6 पॉट ल्यूक सी टर्मिनल जुगनू luciferase तेजी से ट्रांसजेनिक लाइन चयन प्लस विनयशील अभिव्यक्ति पैटर्न की अनुमति टैग के साथ संयोजन में पसंद का एक promotor के उपयोग की अनुमति देता है, के जबकि Potox 6 वेक्टर मजबूत inducible 13 Ostreococcus से लिया promotor किया जाता है उच्च आत्मीयता हित के जीन की overexpression के लिए फास्फेट ट्रांसपोर्टर जीन (HAPT). वेक्टर Potox ल्यूक Potox से प्राप्त है, एक अतिरिक्त luciferase मार्कर है कि overexpression लाइनों की अप्रत्यक्ष चयन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के पेट
हालांकि प्रक्रिया अक्षम प्रकट होता है, कोशिकाओं और प्लाज्मिड इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक डीएनए के बड़ी संख्या में कोई महत्वपूर्ण बाधा बन गया है. एक बड़ी सीमा यह है कि हर उत्पन्न लाइन कि चयन मार्कर के लिए प्रतिरोधी है के लिए व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया जा जाँच करने के लिए की जरूरत है कि पूरे निर्माण डीएनए में एकीकृत है. हम उदाहरण में जो चयन मार्कर के सफल अभिव्यक्ति ब्याज की वास्तविक जीन की प्रविष्टि के अनुरूप नहीं था मनाया, यानी आंशिक एकीकरण हो सकता है. जाहिर है, जीनोम में यादृच्छिक प्रविष्टि भी मतलब है कि वहाँ इस पद्धति का उपयोग करके प्रविष्टि साइट की कोई नियंत्रण नहीं है, और विधियों खमुताबिक़ पुनर्संयोजन पर ased वर्तमान में विकसित किया जा रहा है. हालांकि, विधि यहाँ वर्णित है, हमारी सबसे अच्छा ज्ञान के लिए, वर्तमान में केवल विशेषता के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित Ostreococcus कोशिकाओं को उत्पन्न विधि.
के रूप में Ostreococcus tauri हाल ही में एक प्रयोगात्मक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है, ज्यादातर इन कोशिकाओं के साथ काम करने के तरीके विकसित करने और बढ़ती अनुसंधान शामिल समुदाय द्वारा परिष्कृत की संभावना है. इस प्रोटोकॉल के लिए मदद लोग Ostreococcus साथ काम आरंभ करना है, लेकिन किसी भी तरह से सभी इस microalga के जीनोमिक परिवर्तन के बारे में पता है का वर्णन का दावा है. लेखकों विश्वास है कि पाठकों के इन्क्यूबेटरों में छोटे मतभेदों (प्रकाश के स्तर या गुणवत्ता) और अन्य मानकों मौजूद होगा के रूप में अपनी जरूरतों के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूल है और संभावना के लिए हर व्यक्ति प्रयोगशाला में अनुकूलित किया जाना है इस के लिए की जरूरत है स्वस्थ संस्कृतियों प्राप्त करने में सक्षम हो जाएगा प्रोटोकॉल. माहिर के बाद तकनीक यहाँ वर्णित है,वैक्टर luminescent, फ्लोरोसेंट, या प्रवर्तक की एक श्रृंखला के नियंत्रण के तहत अन्य टैग संलयन लाइनों उत्पन्न करने के लिए निर्माण किया जा सकता है. इस रोमांचक उपन्यास प्रयोगात्मक मंच अध्ययन कैसे जटिल जैव रासायनिक समस्याओं को कम जटिलता, जिसमें औषधीय दृष्टिकोण अत्यधिक 3 मदद की है की एक यूकेरियोट में हल कर रहे हैं के लिए उपयोगी हो जाएगा.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
बीबीएसआरसी द्वारा वित्त पोषित और EPSRC D019621 पुरस्कार एकीकृत सिस्टम जीवविज्ञान के लिए केंद्र SynthSys. यूरोपीय संघ FP6 नेटवर्क उत्कृष्टता "समुद्री जीनोमिक्स" FYB करने के लिए अनुदान की आनुवंशिक परिवर्तन विधियों के विकास के वित्त पोषण किया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium constituents | |||
| Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
| NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
| NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
| H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
| Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
| Na2EDTA∙2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
| FeCl3∙6H2O | 157740 | Sigma | |
| Na2MoO4∙2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
| ZnSO4∙7H2O | Z0251 | Sigma | |
| CoCl2∙6H2O | 31277 | Sigma | |
| MnCl2∙4H2O | 203734-5G | Sigma | |
| CuSO4∙5H2O | C8027 | Sigma | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
| Biotin | 47868 | Sigma | |
| Thiamine ∙ HCl | T4625 | Sigma | |
| Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
| Neomycin | N6386 | Sigma | |
| Kanamycin | K4000 | Sigma | |
| Consumables for culturing | |||
| Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
| TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
| Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon | |
| Chemicals for transformation | |||
| D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma | |
| Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma | |
| ClonNat | 51000 | Werner | |
| Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen | |
| Consumables for transformation | |||
| Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
| Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO | |
| Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad | |
| Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International | |
| Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific | |
| Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |
References
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