Summary
이 문서는 단세포 해양 alga의 유전자 변형을 설명합니다
Abstract
식물 과학의 급속한 발전을 방해 일반적인 문제는 세포, 조직과 전체 유기체의 복잡하고 높은 식물의 간단한 유전자에 영향을 미치는 게놈 중복 특히 높은 수준을 포함합니다. 소설 모델 유기체 Ostreococcus 타우 리가 날짜로 알려진 작은 자유 생활 진핵세포 생물이며, 당 가장 organelles 중 하나 (mitochondrion, 엽록체, 잠돌군 Zz 스택)의 존재에 의해 나타냄 크게 감소 게놈의 크기와 셀룰러 복잡성 1,2를 가지고 셀, 오로지 ~ 8000 유전자를 포함하는 게놈. 또한, unicellularity 쉽게 문화의 결합 화학 생물 접근 의무가 플랫폼을 제공합니다. 최근 Ostreococcus이 성공적으로 circadian 측정 3-6 근본 기본적인 메커니즘을 연구하기 위해 고용되었다. 이 모델 생물의 결과는 또한 포유류의 생물학 7 식물 과학뿐만 아니라 영향을했지만. 이 예제에서 얼마나 빠른 실험을 강조녹색 혈통에서 간단한 진핵세포 생물은 낮은 복잡도의 배경으로 기술적으로 실현 가능한 방법을 사용 testable 가설을 생성하여보다 복잡한 유기체의 연구를 가속화할 수 있습니다. 게놈과 유전자를 수정하기위한 가능성에 대한 지식은 어떤 모형 수종에 필수적인 도구입니다. 유전자 Ostreococcus를 변환하기 이전에 보고된 방법 6,10가 전세계적으로 몇 가지 실험실로 알려진 반면 게놈 1, Transcriptomic 8이 종족에 대한 Proteomic 아홉 정보는 자유롭게 사용할 수 있습니다.
이 문서에서는 실험 방법은 유전자 electroporation에 의해 구조가 자세히 설명뿐만 아니라 변형 라인의 선택에서 발생하는 허용하는 낮은 비율 아가로 오스의 변형 세포를 포함하는 방법있다 overexpression로이 소설을 모델 유기체를 변환하는 방법 하나는 휴대폰을 바꾸었다. Ostreoco의 성공적인 응용 프로그램에 따라circadian 연구 ccus, Ostreococcus에 관심이 점점이 biotechnological 분야를 포함하여 식물의 과학, 내 및 외부의 다양한 연구 분야에서 기대할 수 있습니다. 보존 생화 학적 경로에서 작동 생물 학적 및 의료 과학의 광범위한 범위에서 연구가 더 큰 모델 종의 게놈과 organismal 복잡도에서 해방 Ostreococcus에서 추구하는 연구를하는 것이 좋습니다.
Protocol
1. Algal 재료의 준비
- Ostreococcus 전지는 인공 해수 (ASW)에서 배양해 있습니다. 바다 소금이 (리터당 일반적으로 약 40g) 30의 염분에 deionised 물속에 녹아있다 PPT 등 염도 측정기를 사용하여 측정. 1-3 테이블에 설명된대로 농축 매체 11,12, 미량 금속 원소와 비타민이 추가됩니다. 미디어는 0.22 μm의 필터를 통해 다음 필터 소독입니다.
- 유지 보수의 경우 Ostreococcus 변형 OTTH95의 세포는 신선한 ASW 매 7 일 이내에 1백분의 1의 희석에 무균 하위 교양이며, 문라이트 블루 필터를 들으며 식물 성장 배양기에서 지속적인 불빛 아래에서 성장. 광 강도 가까운 20 μmol m -2 s의 -1에 있어야하며 온도는 20 ° C.에서 관리하고 있습니다 세포는 지속적인 교반이 필요하지 않지만 모든 2-3일가 집계를 방지하기 위해 한 번 흔들리고있다.
- 각 변환의 경우 세포의 50 ML는 셀 드에 필요합니다하위 culturing 따라 5-7일 획득하여야 20-30 X 10 6 ML -1의 nsity. 대략 셀 밀도와 axeny는 x40의 배율의 최소한 유동세포계측법 또는 혈구계 중 하나를 사용하여 확인할 수 있습니다.
2. Electroporation
- 변환을 위해 DNA를 준비합니다. 각 변환의 경우 순수한 플라스미드 DNA를 linearised 5 μg은 멸균 deionised 물 1 μg / μl의 농도가 필요합니다. 다른 방법은 동일하게 잘 작동 수도 있지만이 DNA를 얻으려면, 저자, Qiagen MIDI 준비 키트를 사용하는 것이 좋습니다. 사용된 벡터의 중추에서 차단 된 것을 효소 아니라 transgene 또는 선택 유전자와 제품을 소화. 또한 정화 및 에탄올 침전에 의해 결과로 선형 DNA를 집중하고, 고품질 무균 deionised 물의 적절한 볼륨의 제품을 resuspend.
- 각 변형에 5 μg의 DNA를 포함하는 microcentrifuge 튜브를 준비합니다. contro각 세포주를 변환할 수 있도록없이 DNA와 나 필요합니다. 각각의 변환을위한 2 밀리미터의 electroporation cuvette과 함께 얼음이 튜브를 유지.
- 변환 당 resuspension 버퍼의 2.2 ML을 준비합니다. ddH 2 O에서 1 M 솔루션에 대한 Sorbitol 디졸브, 0.1 %의 pluronic 산 F68 및 필터 - 소독을 추가합니다.
- 원뿔 바닥과 50 ML 관에 최종 세포에 0.1 %의 농도 및 10에서 8000x g에서 10 분 펠릿 그들 ° C로 pluronic 산 F68을 추가합니다. 즉시 아래로 pipetting 및하여 resuspension 버퍼 1 ML에서 세포를 resuspend하고 microfuge 튜브로 전송할 수 있습니다. 10 ° C에서 8,000 XG에 10 분 동안 다운 던가, 그리고 신속하게 작업을 한번 더이 세차 단계를 반복하십시오.
- 컷 팁으로 resuspension 버퍼의 40 μl 각 최종 펠렛을 resuspend. 얼음 linearised DNA의 모든 튜브에 resuspended 세포의 40 μl를 추가, 부드럽게 믹스 앤 electroporation의 cuvette에 전송할 수 있습니다.
- electrop에 cuvette을 넣고연설 기계. 6 kV cm -1, 600 Ω, 25 μF로 설정을 변경합니다. 세포를 Electroporate.
- 10 분 동안 상온에서 cuvettes의 electoporated 세포를 부화하고, 조직 문화 flasks를 준비하는 그 시간을 사용합니다. 그들을 분류하고 각각 신선한 ASW의 30 ML에 추가합니다. 각 플라스크 1 ML을 타고 부드럽게 해당 cuvette에 추가합니다. 2 분 동안 품어 부드럽게 ASW을 제거, 지금 부드럽게 세포의 작은 구체를 포함하고 천천히 문화 플라스크에 ASW에 직접 피펫.
- 세포는 일반적으로 소구에 남아 있습니다. 이 순간 집계 세포를 흔들거나 방해하지 않도록주의를 기울입니다. 세포 1-2 시간 동안 인큐베이터에 복구하도록 허용 후 flasks 흔들어하여 resuspend. 이때 세포 자유롭게 resuspend해야하며 어떤 대단히 짧은 볼 수 없습니다. 배양기에서 하룻밤 복구하는 문화를 남겨주세요.
3. 세미 솔리드 중간에있는 접시에 세포의 포함
- 인큐베이터에서 변형 세포를 수집합니다. 멸균 flowhood에서 근무, 튜브 하나에 9 ML에 끓는 LMP 아가로 오스의 1 ML을 추가합니다. 튜브를 닫고 반전으로 섞는다. 그런 다음, 갓 변형 세포의 0.5 ML을 추가 신속하게 믹스 앤 접시에 붓는다. 나머지 7 튜브와 함께이 과정을 반복하고 다음 변환 플라스크로 진행합니다.
- 아가로 오스가 설정하기 위해 번호판, 1 시간 동안 유동 후드에서 열어 둡니다. 그런 다음 접시를 닫고 4 접시를 각각 개최됩니다 커다란 사각형 배양 접시에 그들을 전송합니다. 사각형 접시의 지혜를 밀봉H parafilm. 접시가 완전히 설정되지 않습니다, 그리고 그 결과로 젤은 매우 불안정합니다. 케어는 접시를 다룰 때 젤을 깰하지 않도록 촬영해야합니다. 인큐베이터에있는 모든 사각형 접시를 놓습니다.
4. 변환 콜로니의 선택
- 식민지가 변환 접시에 10~21일 후 아니라 모의 변형 접시에 나타납니다. 식민지 컷 - 오프 조언과 함께 200 μl 피펫을 사용하여 선택합니다. 간단하게 무료로 식민지를 선택하고 녹색 식민지를 빨아. 인근의 식민지에서 모든 세포를 포함하면 안됩니다.
- 24 우물 판에, 선택을 포함하는 액체 매질의 2 ML로 세포를 전송합니다. Nourseothricin을 사용할 때, 1.75 밀리그램 / ML을 사용합니다. 아래로 pipetting 및하여 섞는다. 변환 당 24-50 식민지를 선택합니다. parafilm 및 보육에 대한 전송과 함께 번호판을 밀봉합니다.
- 일주일 후, 24 웰스 플레이트의 선택과이 ML 신선한 ASW 각도 100 μl를 전송하고 additiona위한 성장리터 칠일. 살아남은 세포 라인들은 더욱 연구에 사용될 수 있습니다. 게놈 및 삽입 숫자로 안정적인 통합은 PCR 및 남부 얼룩을 사용하여 분석해야한다. 게놈 DNA가 식물의 DNA 추출을위한 다운 스케일 표준 방법을 사용하여 이러한 목적을 위해 얻을 수 있습니다.
5. 대표 결과
셀 1 / 100은 7 일 동안 성장 후 밀리리터 당 25,000,000 세포 밀도에 도달 나누었습니다. 적절한 설정으로 세포 Electroporation은 시간 상수를 10 ~ 14 밀리초 결과. 세포 배양 flasks의 매체로 전송하면, 세포의 소구가 형성됩니다. 가볍게 시간 이후에 떨면서 때, 세포는 쉽게 resuspend한다. 0.2 % LMP 한천 개를 1 ML 변형 세포의 포함은 일관되지만 세미 솔리드 겔을 초래한다. 식민지는 10-21일 후에 나타납니다. 변환 당 위의 프로토콜을 사용 linearised DNA 5 μg를 변형, 50-100 식민지번호판은 일반적으로 부정적인 컨트롤 플레이트 함 비해, 예상되었다. ~ 고른 식민지의 80 %가 긍정적으로 액체 매질에서 항생제 저항에 의해 선정되었으며 후속 연구에 사용되었다.
| 최종 농도 | 증권 솔루션 | 1리터위한 볼륨 | |
| 나노 3 | 8.83 × 10 -4 M | 75g / L DH 2 O | 한 ML |
| NH 4 망할 CIA | 3.63 × 10 -5 M | 2.68 G / L DH 2 O | 한 ML |
| β-glycerophosphate | 1 × 10 -5 M | 2.16 G / L DH 2 O | 한 ML |
| H 2 SEO 3 | 1 × 10 -8 M | 1.29 MG / L DH 2 O | 한 ML |
| 트리스베이스 (산도 7.2) | 1 × 10 -3 M | 121.1 g / L DH 2 O | 한 ML |
| K 추적 금속 용액 | 표 2 | 한 ML | |
| F / 2 비타민 용액에게 | 표 3 | 0.5 ML |
표 1. O에의 성장을위한 매체 성분 타우 리 11, 12. 30 PPT의 염분에 인공 해수 1 리터 총 볼륨을 확인하고 표시로 주식 솔루션에서 위의 구성 요소를 추가합니다. 주내 매체 및 사용을 필터링 - 소독. 비타민 솔루션을 제외한 모든 화합물의 주식은 매체의 모든 리터를 위해이 솔루션 중 6 ML을 추가할 풀링된 수 있습니다.
| 최종 농도 | 증권 솔루션 | 1리터에 대한 금액 | |
| 나이 2 O | 1 × 10 -4 M | 41.6 g | |
| FeCl 3 • 6H 2 O | 1 × 10 -5 M | 3.15 g | |
| 나 2 무 4 • 2 시간 2 O | 1 × 10 -8 M | 6.3 G / L DH 2 O | 한 ML |
| ZnSO 4 • 7H 2 O | 1 × 10 -9 M | 22.0 g / L DH 2 O | 한 ML |
| CoCl 2 • 6H 2 O | 1 × 10 -9 M | 10.0 g / L DH 2 O | 한 ML |
| MnCl 2 • 4H 2 O | 1 × 10 -8 M | 180.0 g / L DH 2 O | 한 ML |
| CuSO 4 • 5H 2 O | 1 × 10 -8 M | 9.8 G / L DH | 한 ML | |
표 2. 금속 용액 11,12를 추적. DH 2 O 1 리터의 총, 그리고 해산하는 열을까지합니다. 저장 나누어지는 솔루션 및 동결. 최종 농도는 최종 매체가 아닌 추적 금속 솔루션을 참조하십시오 지적했다.
| 최종 농도 | 증권 솔루션 | 1리터에 대한 금액 | |
| 비타민 B 12 | 1 × 10 -10 M | 1g / L DH 2 O | 한 ML |
| 비오틴 | 1 × 10 -9 M | 0.1 G / L DH 2 O | 10 ML |
| 티아민 • HCL | 1 × 10 -7 M | 200 MG |
표 3. F / 2비타민 용액 11. DH 2 O, 필터 소독, 나누어지는 및 동결 1 리터의 총까지합니다. 최종 농도는 최종 매체가 아닌 비타민 솔루션을 참조하십시오 지적했다.
1 그림. 변환 절차의 그래픽 개요가. 유전자 electroporation에 의해 Ostreococcus 타우 리를 변환하기위한 절차의 도식 표현.
그림 2. 문화의 성장. 세포는 신선한 ASW의 1백분의 1의 희석 매 7 일마다에서 무균 하위 교양이며, 문라이트 블루 필터를 들으며 식물 성장 배양기에서 지속적인 불빛 아래에서 성장. 광 강도 가까운 20 μmol m -2의 -1과 온도 ° C의 세포가 일정한 교반이 필요하지 않은 20에서 관리하고 있습니다 있겠지만의 위치해야합니다집합을 방지하기 위해 모든 2-3일 회 haken.
그림 3. 0.2 % LMP 아가로 오스의 콜로니 형성. 큰 사각형 배양 접시에 전송 4 접시, 그리고 parafilm (맨 왼쪽)과 인감. 콜로니가 형성되면, 단순히 무료 (이상적으로 conically 모양의) 식민지 (오른쪽 위)를 선택하고 p200의 피펫과 접시 밖으로 빨아. 부정적인 컨트롤 (오른쪽 하단)에는 식민지이 없어야합니다.
Discussion
세포 주 및 문화 axeny은 변환 과정에 중요한 중요하다. 세포는 일반적으로 빛의 12 시간주기에서 유지되고 있지만, 12 시간 어둡고, 이러한 조건 하에서 성장 세포의 변환 효율이 부족한 것으로 밝혀졌다. 반복 pelleting / resuspension 단계 동안, 세포는 항상 쉽게 resuspend한다. 세포의 집계, 또는 가래 같은 물질이 존재할 경우, 다시 처음부터 절차를 시작하는 것이 좋습니다. 일반적으로 ~ 50 콜로니는 부정적인 컨트롤 접시 없음 비해, 각 변환 접시에 기대할 수 있습니다. 낮은 변환 효율 경우에는 culturing 조건은 세포가 최적의 상태에 있도록 다양한되어야합니다. 변환 효율에 영향을 미치는 변수는 주위 실험실에서 온도 (주변 20 ° C로 함) 및 처리 속도를 (세포에게 [2.3] 회복에 대한 [2.7]을 pelleting의 절차 ~ 1 시간 정도 소요됩니다)가 있습니다. 그것은 또한 중요하다 모든 솔루션다시 각각의 변형 전에 신선했다. 접시에 포함시킬 경우, LMP 아가로 오스의 농도는 Ostreococcus 전지는 높은 아가로 오스의 농도에서 성장하지 않습니다. 중요하고, 낮은 농도로 확산됩니다.
Ostreococcus 위해 만세 변환 벡터는 이전에 다음 여섯 출판되었으며, 더 많은 벡터가 생성하고 곧 출판할 예정이다. Potox 벡터 6 Ostreococcus에서 촬영한 강력한 inducible 13 promotor를 전해준 반면 기존의 벡터 주전자 룩 6, 빠른 유전자 변형 라인 선택 플러스 다루기 쉬운 표현 패턴을 허용 C-단자 반딧불 루시페라제 태그와 함께 선택의 promotor의 사용을 허용 관심있는 유전자의 overexpression에 대한 고친 화성 인산 수송 (HAPT) 유전자. Potox 룩 벡터는 overexpression 라인 간접 선택에 사용할 수있는 추가 루시페라제 마커를 들고, Potox에서 유래
프로세스가 비효율적 보이지만 세포이 절차에 필요한 플라스미드 DNA의 다수는 더 큰 장애물을 포즈 없습니다. 큰 제한은 선택 마커에 강한있는 모든 생성된 라인 전체 구조는 DNA에 통합되어 있는지 확인하기 위해 개별적으로 분석해야한다는 것입니다. 우리는 선택할 수있는 마커를 성공적으로 표현 관심의 실제 유전자의 삽입에 해당하지 않은 것들에 예제를 감찰하러 온 적도, 즉 부분적인 통합이 발생할 수 있습니다. 결국, 게놈에 무작위로 삽입도이 방법을 사용하여 삽입 사이트에 대한 통제가 없다는 것을 의미하고, 방법 B동종 재조합에 ased 현재 개발되고있다. 그러나, 방법은, 우리의 가장 중요한 지식까지, 여기 유전자 변형 Ostreococcus 세포를 생성하는 현재 유일한 특성화 방법을 설명했다.
Ostreococcus 타우 리가 최근에 실험적인 모델 생물로 사용되고 마찬가지로,이 전지 작업에 대부분의 방법은 진화와 관련된 성장 연구 커뮤니티에 의해 세련되지 가능성이 높습니다. 이 프로토콜은 사람들이 Ostreococcus 함께 작업을 시작할 수 있도록하기위한, 그런데 방법으로이 microalga의 게놈 변이에 대해 알고있다 모두를 설명하는 데 있다고 주장한다. 독자가 작은 incubators의 차이 (조명 수준이나 품질) 및 기타 매개 변수가 존재합니다로서 자신의 요구에이 프로토콜을 적응하고 가능성이 필요한 건강한 문화를 얻기 위해 모든 개별 연구실에 최적화해야 할 수있을 것이라고 저자 신뢰 프로토콜. 습득 후 기술, 여기에 설명된벡터는 promotors의 범위의 통제하에 발광, 형광 또는 기타 태그가 퓨전 라인을 생성하는 건설 수 있습니다. 이 흥미 진진한 소설의 실험 플랫폼은 복잡한 생화 학적 문제 pharmacological 접근은 고도 3 촉진되는 감소 복잡도의 진핵세포 생물에서 해결하는 방법을 공부하는 것이 유용할 것이다.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
BBSRC과 EPSRC 수상 D019621에 의해 자금 지원 통합 시스템 생물학을위한 센터 SynthSys. FYB에 우수 '마린 지노 믹스 "보조금의 유럽 연합 (EU) FP6 네트워크는 유전자 변형 방법의 개발 자금을하고있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium constituents | |||
| Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
| NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
| NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
| H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
| Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
| Na2EDTA∙2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
| FeCl3∙6H2O | 157740 | Sigma | |
| Na2MoO4∙2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
| ZnSO4∙7H2O | Z0251 | Sigma | |
| CoCl2∙6H2O | 31277 | Sigma | |
| MnCl2∙4H2O | 203734-5G | Sigma | |
| CuSO4∙5H2O | C8027 | Sigma | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
| Biotin | 47868 | Sigma | |
| Thiamine ∙ HCl | T4625 | Sigma | |
| Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
| Neomycin | N6386 | Sigma | |
| Kanamycin | K4000 | Sigma | |
| Consumables for culturing | |||
| Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
| TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
| Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon | |
| Chemicals for transformation | |||
| D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma | |
| Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma | |
| ClonNat | 51000 | Werner | |
| Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen | |
| Consumables for transformation | |||
| Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
| Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO | |
| Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad | |
| Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International | |
| Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific | |
| Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |
References
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