Summary
Denne artikel beskriver genetisk transformation af unicellulær marine alger
Abstract
Almindelige problemer hindrer hurtige fremskridt i Plant Sciences omfatter celle, væv og hele organismen kompleksitet, og især det høje niveau af genomisk redundans påvirker simple genetik i højere planter. Den hidtil ukendte modelorganisme Ostreococcus Tauri er den mindste fritlevende eukaryot kendt til dato, og har en stærkt reduceret genomstørrelse og cellulær kompleksitet 1,2, manifesteret ved tilstedeværelsen af kun et af de fleste organeller (mitokondrier chloroplast, Golgi stabel) pr celle, og et genom, der kun indeholder ~~~HEAD=NNS 8000 gener. Endvidere, at kombinationen af unicellularity og let kultur tilvejebringer en platform egnet til kemiske biologi fremgangsmåder. For nylig er Ostreococcus held blevet anvendt til at undersøge de grundlæggende mekanismer bag cirkadiske tidtagning 3-6. Resultater fra denne model organisme har påvirket ikke kun Plant Science, men også pattedyr biologi 7. Dette eksempel belyser, hvordan hurtige eksperimenter påsimple eukaryote fra den grønne linie kan accelerere forskning i mere komplekse organismer ved at generere testbare hypoteser ved hjælp af metoder, det er teknisk muligt kun på denne baggrund af reduceret kompleksitet. Kendskab til et genom og mulighed for at ændre gener er vigtige redskaber i enhver model arter. Genomisk 1, transkriptom 8, og proteom 9 oplysninger om denne art er frit tilgængelige, mens de tidligere rapporterede metoder 6,10 til genetisk omdanne Ostreococcus er kendt for at få laboratorier verden over.
I denne artikel, at de eksperimentelle fremgangsmåder genetisk transformation denne hidtil ukendte model organisme med en overekspression konstruktion ved hjælp af elektroporering som beskrevet i detaljer, samt fremgangsmåden til optagelse af transformerede celler i lav procentdel agarose for at tillade selektion af transformerede linier stammer fra en enkelt transformeret celle. Efter den vellykkede anvendelse af OstreocoCCUS til circadian forskning, kan stigende interesse i Ostreococcus kan forventes fra forskellige forskningsområder inden for og uden plante videnskaber, herunder bioteknologiske områder. Forskere fra en bred vifte af biologiske og medicinske videnskaber, der arbejder på bevarede biokemiske veje kan overveje at videreføre forskning i Ostreococcus, fri fra genomiske og organismal kompleksiteten af større model arter.
Protocol
1. Fremstillinq af algemateriale
- Ostreococcus celler dyrkes i kunstigt havvand (ASW). Havsalt (typisk omkring 40 g per liter) opløses i deioniseret vand til en salinitet på 30 ppt, som målt ved hjælp af en salinitet meter. Berigelsesmedium 11,12, sporstoffer metalelementer og vitaminer tilsættes som beskrevet i tabel 1-3. Medierne derefter filtersteriliseret gennem et 0,22 um filter.
- For vedligeholdelse, er celler af Ostreococcus stamme OTTH95 subkultiveres aseptisk i en fortynding på 1/100 i frisk ASW hver 7 dage og dyrket under konstant lys i et plantevækstregulerende inkubator forsynet med måneskinsblå filter. Lysintensiteten skal være tæt på 20 umol m-2s-1 og temperaturen holdes på 20 ° C. Cellerne ikke kræver konstant omrøring, men rystes gang hver 2. til 3. dag for at forhindre aggregering.
- For hver omdannelse, er 50 ml celler kræves på en celle density 20-30 x 10 6 ml -1, som skal nås 5-7 dage efter sub-dyrkning. Omtrentlig celledensitet og axeny kan bestemmes ved anvendelse af enten flowcytometri eller et hæmocytometer og mindst en x40 forstørrelse.
2. Elektroporation
- Fremstilling af DNA til transformation. For hver omdannelse, 5 ug af ren, lineariserede plasmid DNA, der kræves ved en koncentration på 1 ug / ul i sterilt deioniseret vand. Til opnåelse af dette DNA, Forfatterne anbefaler anvendelse af en Qiagen Midi prep kit, selvom andre fremgangsmåder kan fungere lige så godt. Fordøje produkt med et enzym, der skærer i skelettet af den anvendte vektor, men ikke i transgen eller selektionsgen. Yderligere oprensning og koncentreres den resulterende lineære DNA ved hjælp af ethanolfældning og resuspender produktet i en passende volumen af høj kvalitet sterilt deioniseret vand.
- Fremstille mikrocentrifugerør indeholdende 5 ug DNA for hver transformation. En kontroversiellel uden DNA er nødvendigt for hver cellelinje, der skal transformeres. Holde disse rør på is, sammen med et 2 mm elektropora-tionskuvette for hver transformation.
- Forbered 2,2 ml resuspenderingsbufferen pr transformation. Opløs Sorbitol til en 1 M opløsning i ddH2O tilsættes 0,1% pluronsyre F68 og filter-steriliseres.
- Tilsættes pluronsyre F68, til en slutkoncentration på 0,1% til cellerne, og pelleten i 10 minutter ved 8000x g ved 10 ° C i et 50 ml rør med konisk bund. Umiddelbart resuspender cellerne i 1 ml resuspensionsbuffer ved at pipettere op og ned, og overføres til et mikrofugerør. Spinnes ned i 10 minutter ved 8000 xg ved 10 ° C, og arbejder hurtigt, skal du gentage dette vasketrin en gang mere.
- Med en cut spids, resuspenderes hver endelige pellet i 40 ul resuspensionsbuffer. Tilsæt 40 ul af de resuspenderede celler til hver rør af lineariseret DNA på is, bland forsigtigt og overføre til elektroporation kuvetten.
- Sætte kuvette i electroptalen maskine. Skift indstillinger til 6 kV cm -1, 600 Ω og 25 uF. Elektroporere cellerne.
- Inkubér electoporated celler i kuvetterne ved stuetemperatur i 10 minutter, og bruge tid til at forberede vævskulturkolber. Mærk dem og tilføje 30 ml frisk ASW til hver. Tag 1 ml af hver kolbe og forsigtigt tilføje den til den tilsvarende kuvette. Inkuber i 2 minutter og fjern forsigtigt ASW, der nu indeholder det dråbe af celler og forsigtigt og langsomt pipetteres direkte i ASW i dyrkningskolbe.
- Celler typisk forblive i en dråbe. Pas på ikke at ryste eller forstyrre de aggregerede cellerne i dette øjeblik. Tillade cellerne at genvinde i inkubatoren i 1-2 timer, og derefter genopslæmme ved omrystning af kolberne. På dette tidspunkt, bør cellerne resuspenderes frit og ingen klumper skal være synlig. Lad kulturerne til at inddrive natten i inkubatoren.
3. Inddragelse af celler på plader i halvfast medium
- Indsamle de transformerede celler fra inkubatoren. Arbejder i en steril flowhood, tilsæt 1 ml kogende LMP-agarose til 9 ml i et af rørene. Glasset lukkes, og blandes ved at vende. Derpå tilsættes 0,5 ml frisk transformerede celler hurtigt blandes og hæld i pladen. Gentag denne proces med de resterende 7 rørene og derefter gå videre til den næste transformation kolben.
- Lade pladerne åbne i stinkskab for en time, for agarose at indstille. Luk derefter pladerne og overføre dem til store firkantede petriskåle, som afholder 4 plader hver. Forsegl kvadratiske plader with parafilm. Bemærk, at pladerne ikke bliver sat helt, og som følge heraf er gelen meget skrøbelige. Man skal passe på ikke at bryde gelen ved håndtering af pladerne. Placer alle kvadratiske plader i inkubatoren.
4. Udvælgelse af transformerede kolonier
- Kolonier skal vises efter 10 til 21 dage om omdannelse plader, men ikke på mock transformerede plader. Hvis du vil vælge kolonier bruge en 200 gl pipette med cut-off tips. Du skal blot vælge frie kolonier og suge ud den grønne koloni. Pas på ikke at inkludere alle celler fra nærliggende kolonier.
- Overføre cellerne til 2 ml flydende medium indeholdende selektion i en 24 brønde plade. Ved anvendelse nourseothricin, anvende 1,75 mg / ml. Blandes ved pipettering op og ned. Vælg 24-50 kolonier pr transformation. Forsegle pladerne med parafilm og overførsel til inkubatoren.
- Efter en uge, overføres 100 ul af hver brønd til 2 ml frisk ASW med selektion i et 24 brønde plade og vokse til en additional 7 dage. Overlevende cellelinier kan anvendes til yderligere undersøgelser. Stabil integration i genomet og insertion nummer skal analyseres under anvendelse af PCR og Southern Blot. Genomisk DNA kan opnås for disse formål ved hjælp af en ned-skaleret standardmetode til plante-DNA-ekstraktion.
5. Repræsentative resultater
Cellerne delt 1/100 nåede en densitet på 25 millioner celler pr efter dyrkning i 7 dage. Elektroporering af celler med de passende indstillinger resulterede i en tidskonstant på mellem 10 og 14 millisekunder. Når celler overføres til mediet i dyrkningskolber, bør en dråbe af celler dannes. Da let rystet efter en time, bør cellerne let opblandingen. Optagelse af 1 ml transformerede celler i 0,2% LMP agar bør resultere i en ensartet, men kun halvfast gel. Kolonier skal vises efter 10 til 21 dage. Når transformerende 5 ug lineariseret DNA under anvendelse af protokollen ovenfor, 50-100 kolonier pr transformationPladen blev typisk forventes, versus ingen af de negative kontrolprøver plader. ~ 80% af opsamlet kolonier blev positivt selekteret ved antibiotisk resistens i flydende medium, og blev anvendt i efterfølgende studier.
| Slutkoncentration | Stamopløsning | Volumen til 1 liter | |
| NaNO 3 | 8,83 x 10 -4 M | 75 g / L dH2O | 1 ml |
| NH4Cl | 3,63 x 10 -5 M | 2,68 g / L dH2O | 1 ml |
| β-glycerophosphat | 1 x 10 -5 M | 2,16 g / L dH2O | 1 ml |
| H2 Seo 3 | 1 x 10-8M | 1,29 mg / L dH2O | 1 ml |
| Tris-base (pH 7,2) | 1 x 10 -3 M | 121,1 g / L dH2O | 1 ml |
| K spormetal-opløsning | Tabel 2 | 1 ml | |
| f / 2 vitaminopløsning | Tabel 3 | 0,5 ml |
Tabel 1. Medium bestanddele for vækst af O. Tauri 11, 12. udgør et samlet volumen på 1 liter af kunstigt havvand med en salinitet på 30 ppt, og der tilsættes ovennævnte komponenter fra stamopløsninger som angivet. Filter-sterilisere mediet og brug inden for en uge. Lagre af alle forbindelser undtagen vitamin opløsningen kan samles til at tilføje 6 ml af denne opløsning til hver liter medium.
| Slutkoncentration | Stamopløsning | Beløb til 1 liter | |
| Na2 2 O | 1 x 10 -4 M | 41,6 g | |
| FeCl3 • 6H H2O | 1 x 10 -5 M | 3,15 g | |
| Na 2 Moo 4 • 2H 2 O | 1 x 10-8M | 6,3 g / L dH2O | 1 ml |
| ZnSO 4 • 7H 2 O | 1 x 10-9M | 22,0 g / L dH2O | 1 ml |
| CoCl 2 • 6H 2 O | 1 x 10-9M | 10,0 g / L dH2O | 1 ml |
| MnCl 2 • 4H 2 O | 1 x 10-8M | 180,0 g / L dH2O | 1 ml |
| CuSO 4 • 5H 2 O | 1 x 10-8M | 9,8 g / L dH | 1 ml | |
Tabel 2 nedenfor. Sporstofanalyse løsning 11,12. Fyld op til i alt 1 liter, i dH2O, og varme for at opløse. Alikvot af opløsningen og fryse til opbevaring. Slutkoncentrationer angivet vedrører den endelige medium, ikke spormetal-opløsning.
| Slutkoncentration | Stamopløsning | Beløb til 1 liter | |
| Vitamin B 12 | 1 x 10 -10 M | 1 g / L dH2O | 1 ml |
| Biotin | 1 x 10-9M | 0,1 g / L dH2O | 10 ml |
| Thiamin • HCl | 1 x 10-7M | 200 mg |
Tabel 3. f / 2vitaminopløsning 11. fyldes op til i alt 1 liter i dH2O, filter-sterilisere alikvot og fryse. Slutkoncentrationer angivet vedrører den endelige medium, der ikke vitamin opløsningen.
Figur 1. Grafisk overblik over proceduren for transformation. Skematisk fremstilling af den procedure, der genetisk transformere Ostreococcus Tauri af elektroporation.
Figur 2. Kulturvækst. Celler subkultiveres aseptisk i en fortynding på 1/100 i frisk ASW hver 7 dage og dyrket under konstant lys i et plantevækstregulerende inkubator forsynet med måneskinsblå filter. Lysintensiteten skal være tæt på 20 umol m-2s-1 og temperaturen holdes på 20 ° C Cellerne ikke kræver konstant omrøring, men erHaken gang hver 2. til 3. dag for at forhindre aggregering.
Figur 3. Colony prisdannelse på 0,2% LMP agarose. Overførsel 4 plader til en stor firkant petriskål, og tætning med parafilm (øverst til venstre). Når kolonier er dannet, skal du blot vælge gratis (ideelt set konisk formede) kolonier (øverst til højre) og suge dem ud af pladen med en P200 pipette. Der bør ikke være nogen kolonier på den negative kontrol (nederst til højre).
Discussion
Cellulær stat og kultur axeny er af afgørende betydning for proceduren for transformation. Selvom celler normalt holdes i cyklusser på 12 timers lys og blev 12 timer mørke, transformationseffektivitet i celler dyrket under disse betingelser viser sig at være utilstrækkelige. I løbet af de gentagne foderpelleteringsforhold / resuspension trin, bør celler altid opblandingen nemt. Hvis celler aggregat eller en slim-lignende stof er til stede, er det bedre at starte proceduren fra begyndelsen igen. Typisk kan ~ 50 kolonier forventes på hver transformation plade, versus ingen på den negative kontrol pladen. I tilfælde af lav transformationseffektivitet, bør dyrkningsbetingelser varieres for at sikre cellerne er i den optimale tilstand. Variabler, der påvirker transformationseffektivitet inkludere omgivende temperatur i laboratoriet (bør være tæt på 20 ° C) og håndtering af hastighed (Procedure fra pelletering cellerne [2,3] til nyttiggørelse [2,7] bør tage ~ 1 time). Det er også vigtigt, at alle opløsninger enre lavet frisk før hver transformation. Optages i plader, er koncentrationen af LMP-agarose afgørende. Ostreococcus celler vil ikke vokse i høje agarose koncentrationer og vil diffundere i lave koncentrationer.
Tre transformationsvektorer for Ostreococcus er blevet offentliggjort tidligere 6, og flere vektorer forventes at blive genereret og offentliggjort inden længe. Den eksisterende vektor Pot-Luc 6 tillader anvendelsen af en promotor valg i kombination med et C-terminalt ildflueluciferase tag tillader hurtigere transgene linjevalg plus medgørlige ekspressionsmønstre, hvorimod Potox vektoren 6 bærer en stærk inducerbar promotor 13 tages fra Ostreococcus høj affinitet Phosphate Transporter (HAPT)-genet for overekspression af genet af interesse. Den Potox-Luc vektoren stammer fra Potox, der bærer en yderligere luciferase markør, der kan anvendes til indirekte selektion af overekspression linier
Selv om processen synes ineffektiv, det store antal celler og plasmid-DNA er nødvendig for denne fremgangsmåde udgør nogen væsentlig hindring. En større begrænsning er, at hver genereret linje, der er resistent over for den selekterbare markør skal analyseres individuelt til at kontrollere, at hele konstruktionen er integreret i DNA. Vi har observeret eksempler, i hvilke vellykket ekspression af den selekterbare markør ikke svarer til indsættelse af selve genet af interesse; dvs partielle integrationer kan forekomme. Åbenbart tilfældig insertion i genomet betyder også, at der ikke er nogen styring af indsættelsesstedet anvendelse af denne metode, og fremgangsmåder based på homolog rekombination er i øjeblikket ved at blive udviklet. Men den metode, der er beskrevet her, er, at vores bedste viden, der i øjeblikket er den eneste karakteriseret metode til at generere genetisk modificerede Ostreococcus celler.
Som Ostreococcus Tauri er først for nylig blevet brugt som en eksperimentel model organisme, de fleste metoder arbejder med disse celler vil sandsynligvis udvikle sig og blive forbedret af stigende forskningsmæssig involverede samfund. Denne protokol har til formål at hjælpe folk indlede arbejdet med Ostreococcus, men på ingen måde hævder at beskrive alt, hvad der er at vide om genomisk transformation af denne microalga. Forfatterne tillid til, at læserne vil være i stand til at tilpasse denne protokol til deres egne behov, som små forskelle i inkubatorer (lysniveauer eller kvalitet) og andre parametre vil eksistere, og sandsynligvis skal optimeres i hvert enkelt laboratorium for at få de sunde kulturer er nødvendige for denne protokol. Efter at have læst de teknikker, der er beskrevet her,vektorer kan konstrueres til at generere luminescerende, fluorescerende eller andre mærkede fusionsproteiner linier under kontrol af en række promotorer. Denne spændende roman eksperimentel platform vil være nyttigt at undersøge, hvordan komplicerede biokemiske problemer løses i en eukaryot af reduceret kompleksitet, hvor farmakologiske tilgange er meget lettere 3.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
SynthSys et Center for Integrativ Systembiologi finansieret af BBSRC og EPSRC pris D019621. EU FP6 Network of Excellence "Marine Genomics" tilskud til FYB har finansieret udviklingen af genetisk transformation metoder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium constituents | |||
| Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
| NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
| NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
| H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
| Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
| Na2EDTA∙2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
| FeCl3∙6H2O | 157740 | Sigma | |
| Na2MoO4∙2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
| ZnSO4∙7H2O | Z0251 | Sigma | |
| CoCl2∙6H2O | 31277 | Sigma | |
| MnCl2∙4H2O | 203734-5G | Sigma | |
| CuSO4∙5H2O | C8027 | Sigma | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
| Biotin | 47868 | Sigma | |
| Thiamine ∙ HCl | T4625 | Sigma | |
| Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
| Neomycin | N6386 | Sigma | |
| Kanamycin | K4000 | Sigma | |
| Consumables for culturing | |||
| Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
| TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
| Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon | |
| Chemicals for transformation | |||
| D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma | |
| Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma | |
| ClonNat | 51000 | Werner | |
| Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen | |
| Consumables for transformation | |||
| Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
| Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO | |
| Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad | |
| Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International | |
| Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific | |
| Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |
References
- Derelle, E. Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).
- Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. 3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell. PLoS One. 2, e749 (2007).
- O'Neill, J. S. Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote. Nature. 469, 554-558 (2011).
- van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle. Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).
- Troein, C. Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms. Plant. J. 66, 375-385 (2011).
- Corellou, F. Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus. Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).
- O'Neill, J. S., Reddy, A. B. Circadian clocks in human red blood cells. Nature. 469, 498-503 (2011).
- Monnier, A. Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles. B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).
- Le Bihan, T. Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri. J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).
- Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. Corellou, F., Bouget, F. -Y. , 201001174050 (2010).
- Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).
- Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton. J. Phycol. 23, 633-638 (1987).
- Djouani-Tari, elB. A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis. PLoS One. 6, e28471 (2011).
- Moulager, M. Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus. PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).
