Summary
Denna artikel beskriver genetisk omvandling av encelliga marina algen
Abstract
Vanliga problem som hindrar snabba framsteg i växtforskning omfattar cell-, vävnads-och hela organismen komplexitet, och i synnerhet den höga genomisk redundans påverkar enkla genetik i högre växter. Den nya modellen organismen Ostreococcus Tauri är den minsta fritt levande eukaryot känt hittills, och har en kraftigt reducerad genomstorlek och cellulära komplexitet 1,2, manifesteras genom närvaron av en enda av de flesta organeller (mitokondrien, kloroplast, Golgi stack) per cellen, och en genom som innehåller endast ~~~HEAD=NNS 8000 gener. Vidare ger kombinationen av unicellularity och enkelt kulturen en plattform mottaglig för strategier Chemical Biology. Nyligen har Ostreococcus framgångsrikt använts för att studera mekanismerna som ligger till grund cirkadiska tidtagning 3-6. Resultat från denna modell organism har påverkat inte bara Plant Science, men också däggdjursbiologi 7. Detta exempel belyser hur snabbt experiment i enenkelt eukaryot från den gröna linjen kan accelerera forskningen i mer komplexa organismer genom att generera testbara hypoteser med hjälp av metoder tekniskt genomförbara bara denna bakgrund av minskad komplexitet. Kunskap om ett genom och möjligheten att ändra gener är viktiga verktyg i alla modeller arter. Genomic 1, Transcriptomic 8 och proteomik 9 för den här arten är fritt tillgänglig, medan de tidigare rapporterade metoder 6,10 genetiskt omvandla Ostreococcus är kända för att få laboratorier över hela världen.
I den här artikeln, de experimentella metoder omvandla genetiskt denna roman modellen organism med ett överuttryck konstruktion med hjälp av elektroporation beskrivs i detalj, liksom metoden för införandet av transformerade celler i låg procent agaros för att möjliggöra selektion av transformerade linjer som härrör från en enda transformerad cell. Efter en framgångsrik tillämpning av OstreocoCCU till dygnsrytm forskning kan växande intresse för Ostreococcus kan förväntas av olika forskningsområden inom och utanför växtforskning, inklusive biotekniska områden. Forskare från ett brett spektrum av biologiska och medicinska vetenskaper som arbetar på bevarade biokemiska vägar kan överväga att bedriva forskning inom Ostreococcus, fri från genomiska och organismbiologi komplexitet större modell arter.
Protocol
1. Framställning av algmaterial
- Ostreococcus celler odlas i artificiellt havsvatten (ASW). Havssalter (typiskt omkring 40 gram per liter) löses i avjoniserat vatten till en salthalt av 30 ppt, mätt med användning av en salthalt mätare. Anrikningssubstrat 11,12, spårämnen metall och vitaminer läggas till som beskrivs i tabellerna 1-3. Medierna är då filtersteriliserades genom ett 0,22 pm filter.
- För underhåll, celler av Ostreococcus stam OTTH95 är subodlas aseptiskt vid en utspädning av 1/100 i färsk ASW var 7 dagar och vuxit under konstant ljus i en växters tillväxt inkubator försedd med Moonlight blått filter. Ljusintensiteten ska vara nära 20 mol m -2 s -1 och temperatur hålls vid 20 ° C. Celler kräver inte konstant omrörning, men skakas gång var 2 till 3 dagar för att förhindra aggregation.
- För varje transformation är 50 ml celler krävs vid en cell density av 20-30 x 10 6 ml -1, som skall uppnås 5-7 dagar efter subodling. Ungefärliga celldensitet och axeny kan bestämmas med användning av antingen flödescytometri eller en hemocytometer vid ett minimum av x40 förstoring.
2. Elektroporering
- Framställa DNA för transformation. För varje transformation, 5 | ig av ren, lineariserad plasmid-DNA som krävs vid en koncentration av 1 pg / pl i sterilt avjoniserat vatten. För att erhålla detta DNA, författarna rekommendera att använda en Qiagen Midi prep-kit, även om andra metoder kan fungera lika bra. Digerera med ett enzym som klyver i huvudkedjan av den använda vektorn, men inte i transgen eller selektionsgen. Ytterligare rena och koncentrera den resulterande linjära DNA genom etanolprecipitering och återsuspendera produkten i en lämplig volym av hög kvalitet sterilt avjoniserat vatten.
- Förbered mikrocentrifugrör innehållande 5 ng DNA för varje transformation. En kontrol med ingen DNA som är nödvändigt för varje cellinje som skall transformeras. Håll dessa rör på is tillsammans med en 2 mm elektroporering kyvett för varje transformation.
- Förbered 2,2 ml återsuspensionsbufferten per omvandling. Lös Sorbitol till en 1 M lösning i ddHaO 2 O, tillsätt 0,1-syra% pluronic F68 och filtersterilisera.
- Tillsätt pluronsyra F68, till en slutlig koncentration av 0,1% till cellerna, och pelleten dem under 10 minuter vid 8000x g vid 10 ° C i en 50 ml rör med konisk botten. Omedelbart återsuspendera cellerna i 1 ml resuspensionsbuffert genom pipettering upp och ner, och överför till ett mikrofugrör. Snurra i 10 minuter vid 8000 xg vid 10 ° C, och arbetar snabbt, upprepa detta tvättsteg gång.
- Med en cut spets, resuspendera varje slutliga pelleten i 40 | il av återsuspensionsbufferten. Tillsätt 40 pl av de återsuspenderade cellerna till varje rör av lineariserad DNA på is, blanda försiktigt och överföra till elektroporation kuvetten.
- Sätt kyvetten i electroporation maskin. Ändra inställningarna till 6 kV cm -1, 600 Ω och 25 uF. Elektroporera cellerna.
- Inkubera electoporated cellerna i kyvetten vid rumstemperatur under 10 minuter, och använda denna tidpunkt för att framställa de vävnadsodlingskolvar. Etikettera dem och tillsätt 30 ml färsk ASW till varje. Tag 1 ml av varje kolv och försiktigt lägga till motsvarande kyvetten. Inkubera i 2 minuter och ta försiktigt bort ASW, som nu innehåller globule av celler och försiktigt och långsamt pipettera direkt in i ASW i kulturen kolven.
- Celler förblir vanligtvis i en kula. Var noga med att inte skaka eller störa aggregerade cellerna just nu. Tillåta cellerna återhämta sig under inkubator under 1-2 timmar, därefter återsuspendera genom skakning av flaskorna. Vid denna tid bör cellerna blandas fritt och inga klumpar ska vara synligt. Lämnar kulturerna återhämta sig över natten i inkubatorn.
3. Införande av celler på plattor i halvfast medium
- Samla de transformerade cellerna från inkubatorn. Arbetar i en steril flowhood, tillsätt 1 ml kokande LMP-agaros till 9 ml i ett av rören. Stänga röret och blanda genom att invertera. Tillsätt sedan 0,5 ml färskt transformerade celler, snabbt blanda och hälla in i plattan. Upprepa denna process med de återstående 7 rören och sedan gå vidare till nästa transformation kolven.
- Lämnar plattorna öppna i dragskåp under en timme, för agaros härda. Stäng sedan plattorna och överföra dem till stora torget petriskålar, som kommer att hålla 4 plattor vardera. Täta torget plattor with parafilm. Notera att plattorna inte kommer att helt och hållet, och som ett resultat, är gelén mycket bräcklig. Försiktighet bör iakttas för att inte bryta gelen vid hantering av plattorna. Placera alla fyrkantiga plattor i inkubatorn.
4. Selektion av transformerade kolonier
- Kolonier ska visas efter 10 till 21 dagar om ombildning plattorna, men inte på de omvandlade håna plattorna. Att plocka kolonier använda en 200 ul pipett med cut-off tips. Välj helt enkelt fria kolonier och suga ut den gröna kolonin. Var noga med att inte innehåller några celler från närliggande kolonier.
- Överföra cellerna till 2 ml flytande medium innehållande markeringen i en 24 brunnars platta. När du använder Nourseothricin använder 1,75 mg / ml. Blanda genom att pipettera upp och ner. Välj 24-50 kolonier per omvandling. Försegla plattorna med parafilm och överföring till inkubatorn.
- Efter en vecka, överför 100 pl av varje brunn till 2 ml färsk ASW med selektion i en 24 brunnars platta och växa för en additional 7 dagar. Överlevande cellinjer kan användas för ytterligare studier. Stabil integrering in i genomet och infogning antal bör analyseras med användning av PCR och Southern blöt. DNA-materialet kan erhållas för dessa ändamål med hjälp av någon ned-skalat standardmetod för växt-DNA-extraktion.
5. Representativa resultat
Cellerna delades 1/100 nått en densitet på 25 miljoner celler per milliliter efter odling i 7 dagar. Elektroporering av cellerna med lämpliga inställningar resulterade i en tid konstant mellan 10 och 14 millisekunder. När cellerna överförs till medium i odlingsflaskor, bör en kula av celler bildas. Då skakas lätt efter en timme, bör cellerna blandas lätt. Införande av 1 omvandlade ml celler till 0,2% LMP agar bör resultera i en enhetlig men bara halvfast gel. Kolonier ska visas efter 10 till 21 dagar. När transformerande 5 pg av lineariserad DNA med användning av protokollet ovan, 50-100 kolonier per transformationplatta vanligtvis förväntas jämfört med ingen på de negativa kontroll plattorna. ~ 80% av plockade kolonier positivt ut av antibiotikaresistens i flytande medium och användes i efterföljande studier.
| Slutkoncentration | Stamlösning | Volym för 1 liter | |
| NaNOs 3 | 8,83 x 10 -4 M | 75 g / L dH 2 O | 1 ml |
| NH4Cl- | 3,63 x 10 -5 M | 2,68 g / L dH 2 O | 1 ml |
| β-glycerofosfat | 1 x 10-5M | 2,16 g / L dH 2 O | 1 ml |
| H 2 SeO 3 | 1 x 10 -8 M | 1,29 mg / L dH 2 O | 1 ml |
| Tris-bas (pH 7,2) | 1 x 10 M -3 | 121,1 g / L dH 2 O | 1 ml |
| K spårmetall-lösning | Tabell 2 | 1 ml | |
| f / 2 vitamin-lösning | Tabell 3 | 0,5 ml |
Tabell 1. Beståndsdelarna i mediet för tillväxt av O. Tauri 11, 12. Fyll en total volym på 1 liter konstgjorda havsvatten till en salthalt på 30 ppt och lägger komponenterna ovan från lager lösningar anges. Filtersterilisera mediet och använd inom en vecka. Lager av alla föreningar utom vitaminlösning kan slås samman för att lägga 6 ml av denna lösning till varje liter medium.
| Slutkoncentration | Stamlösning | Belopp för 1 liter | |
| Na 2 2 O | 1 x 10 -4 M | 41,6 g | |
| FeCl 3 • 6H 2 O | 1 x 10-5M | 3,15 g | |
| Na 2 Moo 4 • 2H 2 O | 1 x 10 -8 M | 6,3 g / L dH 2 O | 1 ml |
| ZnSO 4 • 7H 2 O | 1 x10-9 M | 22,0 g / L dH 2 O | 1 ml |
| CoCl 2 • 6H 2 O | 1 x10-9 M | 10,0 g / L dH 2 O | 1 ml |
| MnCb 2 • 4 H2O | 1 x 10 -8 M | 180,0 g / L dH 2 O | 1 ml |
| CuSO 4 • 5H 2 O | 1 x 10 -8 M | 9,8 g / L dH | 1 ml | |
Tabell 2. Spårmetallösning 11,12. Fyll till totalt 1 liter i dH 2 O, och värme för att lösa. Alikvotera lösningen och frysa för lagring. Slutkoncentrationer som anges avser den slutliga mediet, inte spårmetall-lösning.
| Slutkoncentration | Stamlösning | Belopp för 1 liter | |
| Vitamin B 12 | 1 x 10 -10 M | 1 g / L dH 2 O | 1 ml |
| Biotin | 1 x10-9 M | 0,1 g / L dH 2 O | 10 ml |
| Tiamin • HCl | 1 x 10 -7 M | 200 mg |
Tabell 3. f / 2vitamin lösning 11. Fyll upp till totalt 1 liter i dH 2 O, filter-sterilisera, alikvot och frys. Slutkoncentrationer som anges avser den slutliga mediet, inte vitaminlösning.
Figur 1. Grafisk översikt av transformationsproceduren. Schematisk representation av processen för att genetiskt transformera Ostreococcus Tauri genom elektroporation.
Figur 2. Kultur tillväxt. Celler är subodlas aseptiskt vid en utspädning av 1/100 i färsk ASW var 7 dagar och vuxit under konstant ljus i en växters tillväxt inkubator försedd med Moonlight blått filter. Ljusintensiteten ska vara nära 20 mol m -2 s -1 och temperatur hålls vid 20 ° C-celler inte kräver konstant omrörning, men är sHaken gång var 2 till 3 dagar för att förhindra aggregation.
Figur 3. Kolonibildning på 0,2% LMP agaros. Transfer 4 plattor för en stor fyrkantig petriskål och tätning med parafilm (överst till vänster). När kolonierna har bildat väljer du helt enkelt gratis (helst koniskt formade) kolonier (överst till höger) och suga ut dem av plattan med en P200 pipett. Det bör inte finnas några kolonier på den negativa kontrollen (nederst till höger).
Discussion
Cellular staten och kultur axeny är av avgörande betydelse för omvandlingen förfarandet. Även celler upprätthålles vanligen i cykler om 12 timmar ljus, var 12 h mörker, transformationseffektiviteten i celler som odlats under dessa betingelser visade sig vara otillräckliga. Under de upprepade pelletering / resuspension steg bör cellerna återsuspendera alltid lätt. Om celler tillsammans, eller en slem-liknande substansen är närvarande är det bättre att börja proceduren från början igen. Normalt kan cirka 50 kolonier kan förväntas på varje transformation plattan, jämfört ingen på den negativa kontrollen plattan. Vid låg transformationseffektivitet bör odlingsbetingelser kan varieras för att säkerställa cellerna är i optimalt tillstånd. Variabler som påverkar transformationseffektivitet inkluderar omgivande temperaturen i laboratoriet (bör vara nära 20 ° C) och hantering hastighet (proceduren från pelletering celler [2,3] till återhämtning [2,7] bör ta ~ 1 timme). Det är också viktigt att alla lösningar enRe gjorde färska före varje transformation. För införande i plattor, är koncentrationen av LMP-agaros avgörande. Ostreococcus celler kommer inte att växa i höga koncentrationer agaros, och kommer att diffundera i låga koncentrationer.
Tre transformationsvektorer för Ostreococcus har publicerats tidigare 6, och fler vektorer förväntas genereras och publiceras inom kort. Den existerande vektorn Pot-Luc 6 tillåter användningen av en promotor som väljs i kombination med en C-terminal eldflugeluciferas tagg tillåta snabbare transgen linjeval plus hanterlig mönster expressionsvektorer, medan Potox vektorn 6 bär starkt inducerbara promotom 13 tas från den Ostreococcus hög affinitet Fosfat Transportör (HAPT)-genen för överexpression av genen av intresse. Den Potox-Luc vektor härstammar från Potox, som bär en ytterligare luciferas markör som kan användas för indirekt val av överuttryck linjer
Även om processen visas ineffektiv, utgör det stora antalet celler och plasmid-DNA som behövs för detta förfarande ingen signifikant hinder. En större begränsning är att varje genererad linje som är resistent mot den selekterbara markören måste analyseras individuellt för att kontrollera att hela konstruktionen är integrerad i DNA. Vi har observerat exempel där lyckade uttryck av den valbara markören inte motsvarar införandet av den faktiska genen av intresse, det vill säga partiella integrationer kan förekomma. Uppenbarligen innebär slumpmässig insättning i genomet också att det inte finns någon kontroll av införingsstället användning av denna metod, och metoder bföljer ofta önskemål om homolog rekombination för närvarande utvecklas. Men beskrivs metoden här är, såvitt vi vet, för närvarande den enda kännetecknas metoden för att skapa genetiskt modifierade Ostreococcus celler.
Som Ostreococcus Tauri har först nyligen använts som en experimentell modell organism, är de flesta metoder som arbetar med dessa celler kan utvecklas och förfinas av den växande inblandade forskarsamhället. Detta protokoll är tänkt att hjälpa människor påbörja arbetet med Ostreococcus, men på något sätt anspråk på att beskriva allt som finns att veta om genomisk omvandling av denna mikroalg. Författarna förtroende som läsare kommer att kunna anpassa detta protokoll till sina egna behov som små skillnader i kuvöser (ljusnivåer eller kvalitet) och andra parametrar kommer att finnas och sannolikt måste optimeras i varje enskilt laboratorium för att få de friska kulturerna som behövs för detta protokoll. Efter bemästra de tekniker som beskrivs här,vektorer kan konstrueras för att generera lysande, fluorescerande eller andra taggade linjer fusion under kontroll av en rad promotorer. Denna spännande nya experimentell plattform kommer att vara användbart att studera hur komplicerade biokemiska problem löses i en eukaryot av minskad komplexitet, där farmakologiska metoder är mycket underlättas 3.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
SynthSys ett centrum för integrativ systembiologi finansieras av BBSRC och EPSRC utmärkelse D019621. EU FP6 Network of Excellence "marina Genomics" bidrag till FYB har finansierat utvecklingen av genetisk transformation metoder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium constituents | |||
| Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
| NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
| NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
| H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
| Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
| Na2EDTA∙2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
| FeCl3∙6H2O | 157740 | Sigma | |
| Na2MoO4∙2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
| ZnSO4∙7H2O | Z0251 | Sigma | |
| CoCl2∙6H2O | 31277 | Sigma | |
| MnCl2∙4H2O | 203734-5G | Sigma | |
| CuSO4∙5H2O | C8027 | Sigma | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
| Biotin | 47868 | Sigma | |
| Thiamine ∙ HCl | T4625 | Sigma | |
| Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
| Neomycin | N6386 | Sigma | |
| Kanamycin | K4000 | Sigma | |
| Consumables for culturing | |||
| Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
| TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
| Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon | |
| Chemicals for transformation | |||
| D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma | |
| Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma | |
| ClonNat | 51000 | Werner | |
| Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen | |
| Consumables for transformation | |||
| Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
| Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO | |
| Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad | |
| Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International | |
| Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific | |
| Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |
References
- Derelle, E. Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).
- Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. 3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell. PLoS One. 2, e749 (2007).
- O'Neill, J. S. Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote. Nature. 469, 554-558 (2011).
- van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle. Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).
- Troein, C. Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms. Plant. J. 66, 375-385 (2011).
- Corellou, F. Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus. Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).
- O'Neill, J. S., Reddy, A. B. Circadian clocks in human red blood cells. Nature. 469, 498-503 (2011).
- Monnier, A. Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles. B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).
- Le Bihan, T. Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri. J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).
- Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. Corellou, F., Bouget, F. -Y. , 201001174050 (2010).
- Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).
- Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton. J. Phycol. 23, 633-638 (1987).
- Djouani-Tari, elB. A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis. PLoS One. 6, e28471 (2011).
- Moulager, M. Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus. PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).
