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Immunology and Infection

Prions प्रोटीन misfolding चक्रीय प्रवर्धन

Published: November 7, 2012 doi: 10.3791/4075

Summary

प्रोटीन misfolding चक्रीय प्रवर्धन (PMCA) prion रूपांतरण और बाधाओं तनाव और प्रजातियों के अध्ययन के लिए एक में इन विट्रो परख है. यह भी एक prion परख का पता लगाने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

Prions संक्रामक एजेंटों है कि पशुओं और मनुष्यों 9,18 में अनिवार्य रूप से घातक संक्रामक spongiform encephalopathy (त्से) कारण हैं. prion प्रोटीन दो अलग isoforms, गैर संक्रामक मेजबान इनकोडिंग प्रोटीन (पीआरपी सी) और संक्रामक प्रोटीन (पीआरपी एससी), पीआरपी 8 सी के एक असामान्य रूप से जोड़ isoform है.

एक prion एजेंटों के साथ काम करने की चुनौतियों की एक लंबी ऊष्मायन पूर्व की अवधि के बाद मेजबान टीका 13 नैदानिक ​​लक्षण के विकास के लिए है. यह परंपरागत लंबी और महंगी पशु bioassay अध्ययन अनिवार्य है. इसके अलावा, पीआरपी सुप्रीम कोर्ट के जैव रासायनिक और biophysical गुणों खराब उनके असामान्य रचना और एकत्रीकरण राज्यों के कारण विशेषता है.

पीआरपी SC बीज पीआरपी सी 14 में इन विट्रो पीआरपी अ.जा. रूपांतरण कर सकते हैं. PMCA एक में इन विट्रो तकनीक कि adva लेता हैइस sonication और ऊष्मायन चक्र का उपयोग करने के लिए पीआरपी सुप्रीम कोर्ट के बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए, एक त्वरित दर पर एक पीआरपी सी और पीआरपी एससी 19 बीज की मात्रा मिनट की अधिक मात्रा से युक्त प्रणाली से करने की क्षमता के ntage. इस तकनीक को प्रभावी ढंग से पीआरपी सी से पीआरपी एससी रूपांतरण की प्रजातियों और तनाव विशिष्टता पुनरावृत्ति करना, prion तनाव हस्तक्षेप का अनुकरण करने के लिए और संक्रमित ऊतकों, तरल पदार्थ, और पर्यावरण 6,7,16 नमूनों से पीआरपी एससी का स्तर बहुत कम बढ़ाना साबित हो गया है, 23.

इस कागज संदूषण को कम करने, अनुरूप परिणाम पैदा करने, और उन परिणामों को बढ़ाता के लिए सिफारिशें सहित PMCA प्रोटोकॉल विवरण,. हम भी पीढ़ी और संक्रामक prion उपभेदों, prion तनाव हस्तक्षेप, और पर्यावरण में prions का पता लगाने के लक्षण वर्णन सहित कई PMCA अनुप्रयोगों, पर चर्चा की.

Protocol

1. उपकरण की तैयारी

  1. एक Misonix 3000 या Misonix 4000 (Farmingdale, एनवाई) का sonicator थर्मो इलेक्ट्रॉन Neslab EX-7 पानी स्नान (Newington, NH) से जुड़े 37 की एक निरंतर तापमान रखने डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें 200 μl गुंबददार थर्मो वैज्ञानिक (Waltham, एमए) से प्राप्त टोपी के साथ पतली दीवारों पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स में नमूने Sonicate.
  2. एक ब्रांड के नए sonicator एक "तोड़ने में" सतत 9 आपरेशन की अवधि की आवश्यकता है. अवधि एक दो महीने में तोड़ने के एक sonication 40 सेकंड और आयाम 10 के लिए निर्धारित स्तर के साथ फट 10 मिनट ऊष्मायन चक्र के होते हैं. एक टाइटेनियम microplate सींग (1 चित्रा, पैनल बी) की सतह भर में कटाव का पालन करना चाहिए. घूम पानी सफेद टाइटेनियम microplate सींग के कटाव के कारण पंकिल दिखेगा. इस पानी दैनिक बदलें.
  3. पीआरपी सुप्रीम कोर्ट के प्रवर्धन microplate सींग भर में अलग अलग होंगे. सर्वश्रेष्ठ पीआरपी एससी प्रवर्धन दक्षता के भीतर प्राप्त किया जा सकता हैmicroplate सींग (1 चित्रा, पैनल सी) के केंद्र से 5 सेमी की एक त्रिज्या.
  4. PMCA के एक दौर में 144 चक्र होते हैं. प्रत्येक चक्र 5 सेकंड sonication और 10 मिनट ऊष्मायन के होते हैं. यह मोटे तौर पर PMCA के दौर प्रति 24 घंटे के लिए आवश्यक होगा.
  5. sonication के बिजली उत्पादन पर प्रदर्शित है sonicator नियंत्रण कक्ष, पीसीआर है sonicator रैक और पानी से स्नान घूम पानी के तापमान में मौजूद ट्यूबों की संख्या के साथ बदलता रहता है. सुनिश्चित करें कि पानी 37 डिग्री सेल्सियस पर equilibrated है, और sonicator ट्यूब रैक (1 चित्रा, पैनल सी) की 30% से अधिक नहीं भरना है. Microplate सींग पीसीआर ट्यूब के माध्यम से बिखरा हुआ है. पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स के बीच खाली जगह का कम से कम एक पंक्ति है और कोई चार से अधिक पट्टी प्रति एक साथ जुड़े ट्यूब (1 चित्रा, पैनल सी) की अनुमति.
  6. sonication के ताकत एक सफल prion तनाव प्रवर्धन के लिए महत्वपूर्ण है. जबकि sonicating, आयाम को समायोजित करने के लिए एक बिजली उत्पादन155 ~ 170 वाट के बीच लेकर. हमारी प्रयोगशाला में सत्ता के स्तर के छह और सात Misonix 3000 और 4000 Misonix के लिए, क्रमशः के लिए सेट कर दिया जाता है.
  7. नहाने के पानी में आसुत जल का उपयोग करने के लिए हार्ड पानी दाग ​​जमते से बचने के लिए. इस पानी साप्ताहिक बदलें. ऊष्मायन और sonication चक्र के दौरान, पानी संक्षेपण microplate सींग ढक्कन के अंदर हो जाएगा. संक्षेपण से बचने के लिए, sonicator बाड़े बॉक्स के ऊपर एक छोटे एक्वैरियम गर्मी पैड संलग्न के रूप में 1 चित्रा, पैनल ए में दिखाया

2. नमूने की तैयारी

  1. सभी जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं Creighton विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु की देखभाल द्वारा अनुमोदित किया गया और समिति का प्रयोग करें और प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के साथ पालन. इससे पहले किसी भी ऊतक संग्रह, पशु anesthetized और transcardially perfused ठंडा फॉस्फेट का उपयोग होना चाहिए पीएच 7.4 में 5 मिमी EDTA के साथ नमकीन घोल buffered मस्तिष्क से खून निकालने और अवरोध से बचने7 खून PMCA प्रतिक्रिया. पशु ऊतकों को तेजी से सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर लीजिए और प्रत्येक prion तनाव के लिए समर्पित विच्छेदन उपकरण है. विच्छेदन के बाद, एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ऊतक जगह, फ्लैश यह सूखी बर्फ पर स्थिर है, और यह -80 पर स्टोर सी ° homogenization जब तक.
  2. PMCA सब्सट्रेट समाधान (पीआरपी सी) तैयार करने के लिए, एक uninfected हम्सटर एक 10% बर्फ ठंड रूपांतरण बफर के साथ समाधान वजन / मात्रा (w / v) (3 भाग देखें) एक Tenbroeck ऊतक चक्की का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क (यूएन BH) homogenize. जबकि homogenizing, सावधान रहना चक्की के अंदर हवा से बचने के समाधान की अत्यधिक foaming. 30 सेकंड और 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में तैरनेवाला अशेष भाजक के लिए 500 XG centrifuging द्वारा समाधान स्पष्ट. -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग.
  3. PMCA बीज (पीआरपी एससी) समाधान तैयार करने के लिए बर्फ का ठंडा wate के साथ एक 10% समाधान w / v एक संक्रामक सामग्री (मस्तिष्क, प्लीहा, लिम्फ नोड्स, अन्य ऊतकों या दूषित मिट्टी) homogenizeऔर 0.6 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में समाधान अशेष भाजक आर. -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग.

3. रूपांतरण बफर की तैयारी

  1. एक 50 मिलीलीटर बड़ा फ्लास्क (परिणाम 1% ट्राइटन X-100 के अंतिम एकाग्रता है) (, Steinheim, जर्मनी, सिग्मा Aldrich GmbH) में ट्राइटन X-100 के .5093 ग्राम वजन.
  2. एक पूरा protease अवरोध करनेवाला (गोली, मैनहेम, जर्मनी Roche Diagnostics GmbH) जोड़ें.
  3. 0.0931 EDTA के जी (यह एक 5 मिमी EDTA के अंतिम एकाग्रता में परिणाम होगा) (; Phillipsburg, एनजे Mallinckrodt बेकर इंक) जोड़ें.
  4. 7.4 1N NaOH साथ पीएच को समायोजित करें.
  5. 50 मिलीलीटर Dulbecco फास्फेट के साथ मात्रा समायोजित Saline Buffered (DPBS) (Mediatech इंक, Manassas, VA).
  6. एक निर्वात निस्पंदन उपकरण के साथ एक 0.45 सुक्ष्ममापी nitrocellulose झिल्ली के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें. रूपांतरण बफर 4 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं एक महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है.

4. Prion PMCA का प्रयोग खींच के प्रवर्धन

  1. एक पीसीआर ट्यूब में 1:20 के अनुपात (यानी PMCA बीज और PMCA सब्सट्रेट के 95 μl के मिश्रण 5 μl) PMCA सब्सट्रेट में पर PMCA बीज पतला. निकालें और एक -80 में 15 μl अशेष भाजक की दुकान ° unsonicated नियंत्रण के लिए सी, इस unsonicated नियंत्रण proteinase कश्मीर (पी) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (पश्चिम बंगाल) के द्वारा पीछा पाचन के माध्यम पीआरपी एससी प्रवर्धन यों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. एक अतिरिक्त unsonicated नियंत्रण 37 डिग्री सेल्सियस पर PMCA प्रतिक्रिया की अवधि के लिए एक दूसरे 15 μl अशेष भाजक रखने के द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है. तीन repetitions के एक न्यूनतम सांख्यिकीय प्रयोजनों के लिए आवश्यक है.
  2. विषय नमूने के शेष (70 μl) PMCA के एक दौर के रूप में चित्रा 1 दर्शाया, पैनल ए हिला पीसीआर ट्यूब के गुंबददार टोपी पर पानी संक्षेपण से बचने के लिए हर 5 घंटा ट्यूबों.
  3. नमूना ट्यूबों नीचे काता किया जाना चाहिए और धीरे से किसी भी प्रक्रिया के बाद homog सुनिश्चित करने के लिए खोलने से पहले vortexed (सावधान किया जा रहा है कि समाधान गुंबददार टोपी में मत जाओ)eneity और संभावित संक्रमण से बचने के.
  4. कम ऊष्मायन अवधि उपभेदों (यानी हरियाणा TME HaCWD, या 263K) के सीरियल PMCA (sPMCA) के लिए 1:20 के अनुपात में sonicated नमूना के एक दौर से ताजा असंक्रमित के 95 μl में 5 μl स्थानांतरित द्वारा sonicated सामग्री को कमजोर मस्तिष्क homogenate (2 चित्रा, पैनल बी).
  5. लंबी ऊष्मायन अवधि उपभेदों (यानी DY TME, 139H, 22CH, 22AH, या ME7H) sPMCA के लिए 1:1 के अनुपात में sonicated नमूना के 50 μl स्थानांतरित एक दौर से ताजा असंक्रमित के 50 μl में sonicated सामग्री को कमजोर मस्तिष्क homogenate (2 चित्रा, पैनल बी).
  6. पहले पतला sonicated मिश्रण (4.4 कदम या 4.5 से) से दो 15 μl aliquots निकालें और -80 पर उनमें से दुकान में एक डिग्री सेल्सियस और 37 में अन्य ° C (PMCA दो दौर के लिए unsonicated नियंत्रण समाधान). अवशेष विषय एक PMCA दो दौर.
  7. इस प्रक्रिया को अनिश्चित काल के दोहराया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला में हम,पन्द्रह PMCA दौर तनाव अपरिवर्तित शेष गुणों के साथ प्रदर्शन किया.
  8. पीके नमूने डाइजेस्ट. एक ठेठ पश्चिम बंगाल के लिए, पी के नमूने के 80 5 μl / ग्राम मिलीलीटर (इस समाधान 40 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम पीके एकाग्रता होगा) के 5 μl और एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं मिश्रण. जेल लोडिंग बफर के 10 μl जोड़ें. 10 मिनट के लिए इस समाधान उबाल लें. चलो समाधान शांत हो जाओ और जेल में 10 μl लोड.
  9. प्रवर्धन की सफलता की गणना पीके से पचता नमूनों पर एक वाइड विश्लेषण करने के लिए उन्हें या तो तुलना द्वारा प्रवर्धित पीआरपी एससी की राशि का अनुमान, unsonicated नियंत्रण 20,21 2 चित्रा, पैनल की ज्ञात मात्रा के लिए सी या पुनः संयोजक PK-पचाया नहीं पीआरपी.

5. क्रॉस संदूषण से बचना

महत्वपूर्ण कदम पार संदूषण और झूठी protease प्रतिरोधी उत्पादों की नोवो गठन के कारण सकारात्मक की घटना को कम करने के लिए रखा जा सकता है.

  • नमूना संग्रह के लिए प्रत्येक prion तनाव के लिए विच्छेदन उपकरण की एक समर्पित सेट (यानी संदंश, चिमटी, कैंची) का प्रयोग करें.
  • असंक्रमित एक PMCA सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया जा दिमाग homogenizing से पहले, 1% ब्लीच साथ pipettes पोंछे. 10 मिनट के लिए 1% ब्लीच के साथ है sonicator पीसीआर ट्यूब रैक, ऊतक homogenizers, और पीसीआर ट्यूब भंडारण रैक लेना और आसुत जल के साथ अच्छी तरह कुल्ला.
  • एक ताजा Versi सूखी लैब हर बार एक नया नमूना homogenized मूसलधार बारिश के साथ काम के क्षेत्र को कवर करने के लिए, एक नया PMCA प्रयोग करने के लिए तैयार किया जा रहा है, या जब sPMCA दौर के बीच aliquoting.
  • नए दस्ताने हर बार नए नमूने (खासकर जब sPMCA दौर के बीच aliquots स्थानांतरित) नियंत्रित किया जाता है का उपयोग करें.
  • कम sonication फटने प्रत्येक PMCA चक्र के लिए प्रयोग करें. 5 सेकंड 10 मिनट ऊष्मायन के साथ संयुक्त sonication की साइकिल डी Novo पीआरपी एससी 1,20,21,23,24 पैदा करने के बिना prions बढ़ाना करने के लिए पर्याप्त है. अन्य प्रयोगशालाओं के रूप में दिखाया गया है, बढ़ रही हैsonication समय, sonication आयाम बढ़ रही है, और PMCA चक्र के की संख्या बढ़ाने के डी Novo पीआरपी SC 2 गठन के लिए संभावना बढ़ जाती है.
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    Representative Results

    प्रोटीन misfolding चक्रीय प्रवर्धन (PMCA) इन विट्रो में पीआरपी एससी 7, 12, 14, 19, 24 बढ़ाना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक सफल पीआरपी एससी प्रवर्धन पीके प्रतिरोधी prion प्रोटीन (हम्सटर व्युत्पन्न prion उपभेदों के लिए 19 और 30 के बीच केडीए पलायन) के रूप में 3 चित्र में दिखाया के पश्चिमी blots पर बैंड तीव्रता में वृद्धि से दिखाया गया है उसके बैंड की तीव्रता में वृद्धि के बाद PMCA पीके प्रतिरोधी PRP एससी सामग्री के प्रवर्धन इंगित करता है. हम्सटर व्युत्पन्न prion प्रोटीन, HaCWD और DY TME, के सफल प्रवर्धन चित्रा 3 के पश्चिम बंगाल विश्लेषण में (5 गलियों और 7) के पहले और बाद में (गलियों 4 और 6) PMCA बैंड तीव्रता तुलना में दिखाया गया है.

    पीआरपी सुप्रीम कोर्ट के पीके पाचन वाइड विश्लेषण द्वारा पीछा एक उच्च, मध्यम और कम di-, मोनो, unglycosylated और prion प्रोटीन, क्रमशः इसी बैंड को दिखाता है. कुछ prion उपभेदों उनके तत्वों द्वारा भेदभाव किया जा सकता हैctrophoretic गतिशीलता. उदाहरण के लिए, वहाँ एक दो केडीए माइग्रेशन HaCWD और DY TME prion उपभेदों के बीच में अंतर है. (3 चित्रा, गलियों 1 और 2, क्रमशः).

    एक उच्च निष्ठा पीआरपी एससी प्रवर्धन 1 PMCA, 7, 12, 19, 23, 24 के द्वारा हासिल की है. PMCA प्रवर्धन में यह उच्च विश्वस्तता PMCA प्रवर्धित prion उपभेदों (HaCWD और DY TME) की एक समान electrophoretic प्रवास के द्वारा मनाया जाता है जब उनके इसी बीज (3 चित्रा की तुलना में, 1 और 4 और HaCWD और DY TME के लिए 2 और 6 गलियों, क्रमशः).

    यदि कोई पार संदूषण या डी Novo पीआरपी एससी गठन होता है, पश्चिम बंगाल नकली नियंत्रण PMCA नमूने के विश्लेषण पीके पाचन (चित्रा 3, 8 लेन और 9) के बाद स्पष्ट रहना चाहिए.

    चित्रा 1
    चित्रा 1. पानी संक्षेपण से बचने के लिए, एक नियमित मछलीघर गर्मी पैड microplate सींग (पैनल ए) के ढक्कन के ऊपर रखा गया है. एक ब्रांड के नए sonicator एक को तोड़ने के बारे में दो महीने के लिए निरंतर sonication की अवधि में अनुमति दी जानी चाहिए पैनल बी तोड़ने में अवधि के बाद टाइटेनियम microplate सींग पर कटाव से पता चलता है. पैनल सी पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स के एक संभव व्यवस्था से पता चलता है कि नमूनों की एक इष्टतम sonication अनुमति होगी.

    चित्रा 2
    चित्रा 2 (पैनल ए) PMCA, sPMCA (पैनल बी), पश्चिम बंगाल और विश्लेषण (पैनल सी) के लिए फ्लो चार्ट. पीआरपी एससी PMCA बीज और uninfected मस्तिष्क homogenate है (संयुक्त राष्ट्र BH) PMCA सब्सट्रेट है. प्रत्येक PMCA दौर के लिए परिलक्षित PRP एससी की मात्रा का ठहराव अपने PMCA पहले इसी बैंड तीव्रता से PMCA के बाद बैंड तीव्रता विभाजित करके प्राप्त किया जाता है.

    "वाईएस> चित्रा 3
    चित्रा 3 PK-पचा HaCWD और DY TME हम्सटर व्युत्पन्न prion उपभेदों के पश्चिमी धब्बा. पीआरपी एससी 3F4 विरोधी prion एंटीबॉडी का उपयोग कर पाया है. पश्चिम बंगाल के विश्लेषण (धब्बा तीव्रता) बहुतायत और पीआरपी सुप्रीम कोर्ट के electrophoretic गतिशीलता को दर्शाता है. मस्तिष्क homogenate से PMCA प्रतिक्रियाओं के साथ या तो (4-5 गलियों) HaCWD या DY (6-7 गलियों) TME एजेंटों से संक्रमित hamsters से वरीयता प्राप्त थे. नमूने कि PMCA लिया (+ PMCA) पीआरपी एससी बहुतायत में वृद्धि दिखा जब उनके unamplified (PMCA -) की तुलना में नियंत्रण (5 करने के लिए 4 और 7 से 6 गलियों की तुलना). वहाँ दो केडीए prion प्रोटीन की HaCWD और DY TME (1-2 गलियों) के बीच electrophoretic प्रवास में एक फर्क है. प्रवास में इस अंतर का उपयोग HaCWD और DY TME homogenates (4 और 6 लेन, क्रमशः) PMCA जनित नमूनों में बनाए रखा है. असंक्रमित (नकली) मस्तिष्क homogenate साथ वरीयता प्राप्त PMCA प्रतिक्रियाओं पी बढ़ाना विफलआरपी SC (8 लेन). 19 और 21 केडीए आणविक मार्कर के लिए स्थानों को पैनल के बाईं ओर संकेत कर रहे हैं.

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    Discussion

    Amplifying संक्रामक prion प्रोटीन की चुनौतियां लंबी ऊष्मायन vivo प्रयोग में समय और खर्च कर रहे हैं. PMCA तकनीक संक्रामक prion एजेंट बढ़ाना एक लागत प्रभावी साधन है. कई प्रयोगशालाओं PMCA की क्षमता के लिए सही है कि इन विट्रो 7, 9, 12, 14, 19,24 में prion उपभेदों बढ़ाना पुष्टि की है.

    Prion रोगों प्रजातियों के बीच प्रेषित किया जा सकता है. Bessen और मार्श को प्रभावी ढंग से संक्रामक मिंक encephalopathy, जो दो अलग हम्सटर व्युत्पन्न prion 5 उपभेदों के साथ inoculated hamsters. एक सुंदर अध्ययन में कह रही है, और सह कार्यकर्ताओं sPMCA इस्तेमाल माउस व्युत्पन्न prion तनाव, आरएमएल बढ़ाना, ट्रांसजेनिक व्यक्त cervid पीआरपी सी चूहों का उपयोग कर PMCA सब्सट्रेट के रूप में (टीजी (CerPrP) 1536 /). रोग की एक तेजी से शुरुआत टीजी के टीका (CerPrP) के बाद मनाया गया १५३६ + / - PMCA अनुकूलित सामग्री के साथ 12. इसी तरह, कर्ट एट अल. बढ़ाना करने में सक्षम थेपुरानी बर्बाद रोग (CWD), cervids में एक prion रोग, गैर cervid PMCA 15 सब्सट्रेट प्रजातियों का उपयोग कर. ये आंकड़े बताते हैं कि prion रोगों में बाधा प्रजातियों इन विट्रो में नजरअंदाज PMCA के माध्यम से किया जा सकता है.

    Bessen और मार्श ने दिखाया है कि हम्सटर कम ऊष्मायन अवधि के तनाव, हरियाणा TME, एक तेज पीआरपी एससी संचय जब अपने लंबी ऊष्मायन अवधि समकक्ष, उप TME 3, 5 की तुलना में. इसी तरह, ऊष्मायन अवधि और संचय की दर के बीच इस संबंध PMCA के बाद कई prion हम्सटर व्युत्पन्न 1 उपभेदों, 23, 24 में मनाया जाता है.

    प्रवर्धन दर प्रत्येक तनाव के आंतरिक संपत्ति है. PMCA इस प्रवर्धन दर यों के लिए इस्तेमाल किया गया है. Ayers एट अल. Unitless संख्या, प्रवर्धन गुणांक में कहा जाता है, कि एक दिया हम्सटर व्युत्पन्न prion 1 तनाव के लिए प्रवर्धन की दर का प्रतिनिधित्व करता है की गणना करने में सक्षम थे.

    Prionउपभेदों एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप जब एक ही मेजबान में पेश कर सकते हैं. एक लंबी ऊष्मायन अवधि तनाव की उपस्थिति ऊष्मायन अवधि बढ़ाने या भी एक कम ऊष्मायन अवधि के तनाव की क्षमता के लिए बीमारी का कारण ब्लॉक कर सकते हैं. ऊष्मायन अवधि में यह विस्तार तनाव हस्तक्षेप करार दिया है. तनाव हस्तक्षेप 10 चूहों और 22 hamsters होते दिखाया गया है. Bartz और सह कार्यकर्ता PMCA का इस्तेमाल किया है hamsters में prion तनाव हस्तक्षेप अध्ययन. उनके परिणाम बताते कि PMCA प्रयोगों vivo 22, 23 में एक समान प्रयोग के निष्कर्षों के साथ सहसंबंधी.

    पीआरपी अनुसूचित जाति के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के बाहर की एक अपेक्षाकृत कम स्तर है, के बाद से वहाँ prions केवल सही immunohistochemistry द्वारा पीछा मस्तिष्क के विच्छेदन के माध्यम से किया जा सकता है पोस्टमार्टम के निदान. PMCA नैदानिक ​​उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि यह पीआरपी सुप्रीम कोर्ट के 7 मिनट मात्रा amplifying के एक महान क्षमता को दिखाया गया है, से भी हम्सटर मूत्र sampl11 ते.

    prion एजेंट कठोर पर्यावरण की स्थिति का सामना करने में सक्षम है और संक्रामक रहने 16,17. हालांकि, पर्यावरण में सुप्रीम कोर्ट के पीआरपी राशि भी परम्परागत तकनीकों जैसे पश्चिम बंगाल का उपयोग कर पता लगाया जा करने के लिए छोटा है. PMCA को बढ़ाना और पीआरपी पर्यावरण एससी की अनुमानित राशि, मिट्टी और 16 पानी के रूप में, 17, 20, 21 की गणना के लिए इस्तेमाल किया गया है.

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    Disclosures

    ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

    Acknowledgments

    हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ. संध्या Fe मैरी रामोस का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. यह काम अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केंद्र (RR0115635 P20-6, C06 RR17417-01 और G20RR024001) और मस्तिष्क संबंधी विकार के लिए राष्ट्रीय संस्थान और स्ट्रोक (NS052609 2R01) द्वारा समर्थित किया गया.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Misonix 3000 Misonix S-3000
    Misonix 4000 Misonix S-4000
    Tenbr–ck Tissue Grinder Kontes 885000-0007
    Neslab EX-7 Water Bath Thermo Electron Neslab EX-7
    0.2 ml PCR Tube Strips Thermo Scientific AB-0451
    Triton X-100 Sigma Aldrich T9284-100ML
    Complete Protease Inhibitor Roche 11 697 498 001
    EDTA J.T. Baker 4040-00
    DPBS Mallinckrodt Baker Mediatech 21-031-CV
    Versi-Dry Lab Soakers Fisher Scientific 14 206 28
    Repti Therm Heater Zoo Med Laboratories, Inc. RH-4

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Saunders, S. E., Bartz, J. C., Shikiya, R. A. Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions. J. Vis. Exp. (69), e4075, doi:10.3791/4075 (2012).

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