Summary
Verfahren zum Gentransfer in Hühnerembryos in späteren Stufen der Inkubation (älter als Hamburger und Hamilton Stufe (HH) 22) beschrieben. Dieses Verfahren überwindet die Nachteile der
Abstract
Der Hühnerembryo bietet ein exzellentes Modellsystem zur Untersuchung von Gen-Funktion und Regulation während der embryonalen Entwicklung. In ovo Elektroporation ist eine leistungsfähige Methode, um Over-Express exogenen Genen oder unten zu regulieren endogene Gene in vivo in Hühnerembryonen 1. Unterschiedliche Strukturen wie DNA-Plasmide kodierenden Gene 2-4, small interfering RNA (siRNA) Plasmide 5, kleine synthetische RNA Oligos 6 und 7 Morpholino Antisense-Oligonukleotide können problemlos in Hühnerembryonen werden durch Elektroporation transfiziert. Allerdings ist die Anwendung der in-ovo-Elektroporation von Embryonen in frühen Stadien Inkubation (jünger als Bühne HH20 - nach Hamburg und Hamilton) beschränkt 8 und gibt es einige Nachteile für die Anwendung in Embryonen in späteren Stadien (älter als Stadium HH22 - rund 3,5 Tag der Entwicklung). Zum Beispiel ist die Vitellin-Membran in einem späteren Stadium USUVerbündete hielt sich an die Membran shall und Öffnen eines Fensters in der Schale verursacht Bruch der Gefäße, was zu dem Tod der Embryonen; älteren Embryonen werden durch Dottergang und Allantois-Gefäße, in denen es schwierig ist, zugreifen und sie manipulieren die Embryonen fallen; älteren Embryonen bewegen kräftig und es ist schwierig, die Orientierung durch eine relativ kleine Fenster in der Schale zu kontrollieren.
In diesem Protokoll zeigen wir eine ex ovo Elektroporation Methode für den Gentransfer in Hühnerembryonen in späten Stadien (älter als Stadium HH22). Für ex ovo Elektroporation werden Embryonen in Petrischalen kultiviert und 9 die Vitellin und Allantois-Gefässe sind weit verbreitet. Unter diesen Bedingungen werden die älteren Hühnerembryonen leicht zugänglich und manipulierbar. Daher überwindet dieses Verfahren die Nachteile der in-ovo-Elektroporation, die auf die älteren Hühnerembryonen. Mit dieser Methode können Plasmide leicht in verschiedenen Teilen transfiziert werdender älteren Hühnerembryonen 12.10.
Protocol
1. Ex ovo Kultur
- Frische befruchtete Eier werden auf ihrer langen Seite in einem Zwangs-Entwurf Inkubator (BSS160, Ehret, Deutschland) bei 37,5 ° C mit 60% Luftfeuchtigkeit für die Inkubation gelegt. Eier bei 12 ° C für länger als eine Woche gelagert sollten nicht verwendet werden.
- Nach einer Inkubationszeit von 2,5 Tage (ca. Stadium HH17), nehmen Sie die Eier und beschriften Sie die oben mit einem Bleistift die Richtung für das Knacken geben.
- Vor dem Brechen, gießen Sie etwa 20 ml sterilem destilliertem Wasser in einem sauberen großen Petrischale (Durchmesser von 145 mm; Greiner Bio-One GmbH, Deutschland).
- Legen Sie einen weiteren kleinen sterilen Petrischale (Durchmesser 94 mm; Greiner Bio-One GmbH) in die große Petrischale.
- Die Eier auf dem Boden gegen scharfe Kanten, öffnen Sie vorsichtig die Eier und den gesamten Inhalt der einzelnen Eier in den kleinen Petrischale.
- Decken Sie die große Petrischale mit einem Deckel und steckte es in einen anderen Inkubator (BINDER GmbH, Tuttlinge, Deutschland)für die weitere Kultur bei 37,5 ° C mit etwa 60% Luftfeuchtigkeit. Nach der Inkubation für die gewünschte Anzahl von Tagen, können die Embryonen für die Elektroporation verwendet werden.
2. Vorbereitung für die ex ovo Elektroporation
- Ziehen von Glaskapillaren mit einer Mikroelektrode Abzieher (PUL-100 Feinpipettenziehvorrichtung, World Precision Instruments, Berlin, Deutschland) mit Glasröhren von 1,0 mm Durchmesser (TW100F-4; World Precision Instruments) und brechen Sie die Spitze der Glaskapillare in eine geeignete Durchmesser.
- Einrichten geeigneter Parameter (dh unterschiedliche Spannungen für die verschiedenen Gewebe und hat eine Größe von Embryonen) zur Elektroporation und eine Verbindung Elektroden mit einer Elektroporator (CUY21-Korrektur, Nepa Gene, Chiba, Japan) gemäß dem Zielgewebe und eine Größe von Embryonen.
- Vorbereiten einer Lösung, die Plasmid pCAGGS Plasmide in Vektor, der ein Zielgen, zB cadherin7 (Cad7; pCAGGS-Cad7 mit einer Konzentration von 2,0 ug / ul) und ein Markergen,z. B. grün fluoreszierendes Protein (GFP; pCAGGS-GFP mit einer Konzentration von 0,25 ug / ul). Fügen Fast Green mit einer Endkonzentration von 0,1% (Sigma)-Lösung, um das Plasmid mit der grünen Farbe zu markieren.
- Laden Sie die Glaskapillare mit dem Plasmid-Lösung mit einer Pipette Mund.
3. Gentransfer in Huhn Tectum opticum von ex ovo Elektroporation
- Nach ex ovo Kultur, zB durch Inkubation Tag (E) 6 werden die Hühnerembryonen für ex ovo Elektroporation verwendet.
- Reißen Sie die Vitellin und Amnion-Membranen über die optische Tectum mit feinen Pinzetten und 3 Tropfen steriler 0,9% Natriumchlorid-Lösung auf der Oberfläche des Tectum.
- Injizieren der Plasmid-Lösung in den Hohlraum des Tectum durch Glaskapillare mit dem Mund Pipette.
- Platzieren Sie die Elektroden mit einem Wolfram-Nadel Kathode und einer Anode Rechteck Platte (CUY 661-3x7, Nepa Gene) neben dem Tectum undunmittelbar gelten elektrischen Impulsen (sechs Impulse, 25 V, 60 ms Impulslänge, 100 ms Intervallen in jedem Fall) durch die Elektroporator der Tectum hergestellt.
- Decken Sie die große Petrischale mit dem Deckel und senden Sie es in den Inkubator. Nach Inkubation für geeignete Tagen (z. B. 2 oder 3 Tage nach der Elektroporation) werden die Tectum gesammelt und für die Immunfärbung (Abbildung 1) und biologische Detektion befestigt.
4. Repräsentative Ergebnisse
Erfolgreiche Überexpression der exogenen Proteine Cad7 und GFP durch ex ovo Elektroporation ist in Abbildung 1 als Beispiel gezeigt. Wenn Cad7 Plasmid zusammen mit GFP-Plasmid in die Tectum war bei E6 elektroporiert, zwei oder drei Tage nach der Elektroporation wurden die Embryonen wurden und fixiert. Bei E8 wird das GFP-Protein stark im Tectum in whole mount Bilder (Abbildung 1a-c) zum Ausdruck gebracht. Ferner wird in den Abschnitten des Tectum bei E9,GFP-Protein (grün in 1D) und Cad7 Protein (rot in 1E) sind coexprimierten (gelb in 1F), was darauf hindeutet, dass ex ovo Elektroporation ein erfolgreiches Verfahren für den Gentransfer in den älteren Hühnerembryonen in vivo ist.
1. Wenn die Plasmide GFP-codierende und Cad7 in die Hühner Tectum sind bei E6 cotransfiziert, zwei oder drei Tage nach ex ovo Elektroporation wird GFP-Protein (grün) stark exprimiert, wie in wholemount Bilder (AC) bei E8 gezeigt. In den Abschnitten des Tectum bei E9, sind GFP-Protein (grün in D) und Cad7 Protein (rot E) coexprimierten (gelb F). BF, Hellfeldbild. Maßstabsbalken: 200 um in A für AC; 100 um in D für DF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll stellt einen Leitfaden für den Gentransfer in älteren Hühnerembryonen (z. B. in das Tectum opticum bei E6) von ex ovo Elektroporation. Diese Methode erweitert die Verwendung von Elektroporation, um älteren Hühnerembryonen und kann leicht an vielen Labors zur Untersuchung von Genfunktionen in vivo in späteren Stadien angewendet. Embryonen aus der E4 bis E7 zumindest kann erfolgreich mit dieser Methode elektroporiert werden, und die Embryonen können elektroporierte Überleben sein, bis E15 11. Neben dem Gehirn, kann dieses Verfahren auch für die Gen-Transfer in das Huhn Schenkel System 11 verwendet.
Besondere Aufmerksamkeit sollte durch ex ovo Elektroporation bezahlt werden. Zum Beispiel, um eine hohe Überlebensrate der Embryonen, die durch ex ovo Kultur zu erhalten, sollten die Eier verwendet werden frischen mit weniger als einer Woche bei 12 ° C, die kleinen Petrischalen sollten steril sein und Eier Rissbildung bei etwa E2.5 durchgeführt. Für ex ovo Elektroporation, dieGröße und Platzierung der Elektroden sollten korrekt entsprechend dem Stadium und gezielte Teil der Embryonen ausgewählt werden. Wenn zwei Plasmiden kotransfiziert werden, sollte die injizierten Plasmide in einem angemessenen Verhältnis der Konzentration (z. B., 1:8 zwischen dem Marker GFP-Gen und gezielte Gen) sein, um sicherzustellen, dass die GFP-markierten Zellen werden fast koexprimiert die gezielte Gen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (; LU1455/1-1 DFG) gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 | |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | ||
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| Micr–lectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
