Summary
Um método de transferência de genes em embriões de galinha em fases posteriores de incubação (com mais de Hamburger e Hamilton fase (HH) 22) é descrito. Este método supera as desvantagens dos
Abstract
O embrião de galinha fornece um sistema modelo excelente para estudar a função e regulação de genes durante o desenvolvimento embrionário. Em electroporação in ovo é um método poderoso para sobre-expressar genes exógenos ou para baixo-regular os genes endógenos in vivo em embriões de galinha 1. Diferentes estruturas, tais como genes de DNA plasmídeos codificando 2-4, pequena interferência RNA (siRNA) plasmídeos 5, pequeno sintético RNA oligos 6, e os oligonucleótidos anti-sentido morfolino 7 pode ser facilmente transfectado em embriões de galinha por electroporação. No entanto, a aplicação de eletroporação em ovo é limitada aos embriões em estágios iniciais de incubação (menores de estágio HH20 - de acordo com Hamburgo e Hamilton) 8 e existem algumas desvantagens para a sua aplicação em embriões em estágios mais avançados (com mais de estágio HH22 - cerca de 3,5 dias de desenvolvimento). Por exemplo, a membrana vitelina em fases posteriores é usualiado preso à membrana devem e abrir uma janela no shell provoca ruptura dos vasos, resultando na morte dos embriões; embriões mais velhos são cobertos por vitelina e alantóide navios, onde é difícil de acessar e manipular os embriões; embriões mais velhos mover vigorosamente e é difícil de controlar a orientação através de uma janela relativamente pequena na concha.
Neste protocolo, demonstramos um método de eletroporação ex ovo de transferência de genes em embriões de galinha em estágios mais avançados (com mais de estágio HH22). Para eletroporação in ovo ex, os embriões são cultivadas em placas de Petri de 9 e vitelina e alantóide embarcações são amplamente difundidos. Sob estas condições, os embriões de galinha mais velhos são facilmente acessíveis e manipulado. Portanto, este método supera as desvantagens de ovo em electroporação aplicado aos embriões de galinha mais velhos. Usando este método, os plasmídeos podem ser facilmente transfectado em diferentes partesdos embriões de galinha mais velhos 10-12.
Protocol
1. Cultura Ex ovo
- Frescas ovos fertilizados são colocados em seu lado mais longo em uma forçada projecto incubadora (BSS160, Ehret, Alemanha) a 37,5 ° C com umidade de 60% para a incubação. Ovos armazenados a 12 ° C durante mais de uma semana não deve ser utilizado.
- Após a incubação durante 2,5 dias (cerca de estágio HH17), retire os ovos e rotular o topo com um lápis para indicar a direção para quebrar.
- Antes de craqueamento, verter cerca de 20 ml de água destilada estéril para uma placa de Petri limpo grande (diâmetro de 145 mm; Greiner Bio-One GmbH, Alemanha).
- Coloque outra pequena placa de Petri estéril (diâmetro de 94 mm; Greiner Bio-One GmbH) para a placa de Petri grande.
- Quebrar os ovos na parte inferior contra uma ponta de metal afiada, abra cuidadosamente os ovos e transferir todo o conteúdo de cada ovo em placa de Petri pequena.
- Cubra a placa de Petri grande com tampa e colocá-lo em outra incubadora (BINDER GmbH, Tuttlinge, Alemanha)para a cultura ainda mais a 37,5 ° C com cerca de 60% de humidade. Após incubação durante o número desejado de dias, os embriões podem ser utilizados para electroporação.
2. Preparação para Eletroporação ovo ex
- Puxe capilares de vidro com um puxador de microeletrodos (PUL-100 Micropipeta Extrator; Instrumentos de Precisão do Mundo, Berlim, Alemanha), utilizando tubos de vidro de 1,0 mm de diâmetro (TW100F-4; Instrumentos de Precisão do Mundo) e quebrar a ponta dos capilares de vidro em um apropriado diâmetro.
- Configurar parâmetros apropriados (ou seja, as tensões diferentes para os diferentes tecidos e tamanho de embriões) para electroporação e ligar eléctrodos para um electroporator (CUY21-Edit; Nepa Gene, Chiba, no Japão) de acordo com os tecidos alvo e tamanho de embriões.
- Preparar uma solução de plasmídeo contendo plasmídeos em vector pCAGGS que codificam um gene alvo, por exemplo, cadherin7 (Cad7; pCAGGS-Cad7 com uma concentração de 2,0 ug / uL) e um gene marcador,por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP; pCAGGS-GFP com uma concentração de 0,25 ug / uL). Em seguida, adicionar Verde Rápido com uma concentração final de 0,1% (Sigma) para etiquetar a solução de plasmídeo com a cor verde.
- Carregar o capilar de vidro com a solução de plasmídeo utilizando uma pipeta de boca.
3. Transferência de genes em Tectum Frango Óptica por Eletroporação ovo ex
- Após a cultura in ovo ex, por exemplo, por dia de incubação (E) 6, os embriões de galinha são utilizados para electroporação in ovo ex.
- Cuidadosamente rasgar as membranas vitelinas e âmnio sobre o tecto óptico com fórceps finos e adicionar 3 gotas de solução de cloreto de sódio a 0,9% estéril sobre a superfície do tecto.
- Injectar a solução de plasmídeo para dentro da cavidade do tectum por capilar de vidro utilizando a pipeta boca.
- Coloque os eletrodos com uma agulha de tungstênio catodo e um anodo placa retângulo (cuy 661-3x7, Gene Nepa) ao lado do tecto, eimediatamente aplicar impulsos eléctricos (seis impulsos, 25 V, 60 ms de comprimento de pulso, 100 intervalos de ms em cada caso) produzidas pelo electroporator ao tectum.
- Cobrir a placa de Petri de grandes dimensões com a tampa e retorná-lo para a incubadora. Após incubação durante dias adequadas (por exemplo, 2 ou 3 dias após a electroporação), o tecto são recolhidos e fixado para imunocoloração (Figura 1) e detecção biológica.
4. Os resultados representativos
Superexpressão bem sucedida das proteínas exógenas de Cad7 e GFP por electroporação in ovo ex é mostrado na Figura 1 como um exemplo. Quando Cad7 juntamente com o plasmídeo GFP plasmídeo foi electroporado para o tectum em E6, dois ou três dias após a electroporação os embriões foram recolhidas e fixada. Em E8, a proteína GFP é fortemente expresso na tectum em imagens inteiras de montagem (Figura 1A-C). Além disso, nas secções do tectum em E9,GFP proteína (verde na Figura 1D) e Cad7 proteína (vermelho na Figura 1E) são co-expressos (amarelo na Figura 1F), sugerindo que a electroporação in ovo ex é um método bem sucedido para a transferência de genes em que os embriões de galinha mais velhos in vivo.
Figura 1. Quando a plasmídeos de codificação da GFP e Cad7 são cotransfectados para o tectum galinha no E6, dois ou três dias após a electroporação in ovo ex, proteína GFP (verde) é fortemente expresso como mostrado nas imagens wholemount (AC) em E8. Em secções do tectum em E9, GFP proteína (verde em D) e Cad7 proteína (vermelho em E) são co-expressos (amarelo em F). BF, imagem de campo claro. Barra de escala: 200 um em um para AC; 100 mm em D para DF.
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Discussion
Este protocolo fornece um guia para a transferência de genes em embriões de galinha mais velhos (por exemplo, para o tecto óptico em E6) por electroporação in ovo ex. Este método estende a utilização de electroporação de embriões de galinha mais velhos e pode ser facilmente aplicado a muitos laboratórios para estudar a função do gene in vivo em fases posteriores. Embriões de E4, a pelo menos E7 pode com sucesso ser electroporado por este método e os embriões eletroporados pode ser sobrevivência até E15 11. Além do cérebro, este método pode ser também utilizado para a transferência de genes para o sistema de galinha membro 11.
Especial atenção deve ser dada por eletroporação in ovo ex. Por exemplo, a fim de obter alta sobrevivência dos embriões por cultura in ovo ex, ovos utilizados devem ser frescos e armazenados menos de uma semana a 12 ° C; os pratos de Petri pequenas deve ser estéril e ovo fissuração realizada em cerca de e2.5. Para electroporação in ovo ex, otamanho e colocação dos eléctrodos deve ser corretamente escolhida de acordo com o palco e parte específica dos embriões. Quando dois plasmídeos são cotransfectados, os plasmídeos injectados deve estar em uma proporção adequada da concentração (por exemplo, 1:8 entre o gene GFP marcador eo gene alvo) a fim de ter a certeza de que as células GFP marcados são quase coexpress o gene alvo.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma doação da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG; LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 | |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | ||
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| Micr–lectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
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