Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Перенос генов в старых куриных эмбрионов на Published: July 27, 2012 doi: 10.3791/4078

Summary

Метод переноса генов в куриных эмбрионах на более поздних стадиях инкубации (старше гамбургеров и Гамильтон этапе (HH) 22) описывается. Этот метод позволяет преодолеть недостатки

Abstract

Куриного эмбриона дает прекрасную модельную систему для изучения функций генов и регулирования в процессе эмбрионального развития. Ово электропорации это мощный метод более-экспресс экзогенных генов или вниз регулировать эндогенных генов в естественных условиях на куриных эмбрионах 1. Различные структуры, такие как ДНК, кодирующих генов плазмид 2-4 малых интерферирующих РНК (миРНК) плазмиды 5 небольших синтетических РНК олигонуклеотидов 6 и морфолино антисмысловых олигонуклеотидов 7 можно легко трансфекции в куриных эмбрионах путем электропорации. Тем не менее, применение в ово электропорации ограничивается эмбрионов на ранних стадиях инкубации (моложе этап HH20 - в соответствии с Гамбургом и Гамильтон) 8 и есть некоторые недостатки в его применении у эмбрионов на поздних стадиях (старше этап HH22 - около 3,5 дня развития). Например, желточной оболочки на более поздних стадиях УрГУсоюзника застряли с мембраной должна и открыть окно в оболочке вызывает разрыв сосудов, что приводит к гибели эмбриона, старший эмбрионов покрыты желточного и аллантоисной суда, где трудно получить доступ и управлять эмбрионов; старше эмбрионов двигаться энергично и трудно контролировать ориентацию через относительно небольшое окно в оболочке.

В этом протоколе мы демонстрируем бывший ово метод электропорации для переноса генов в куриных эмбрионов на поздних стадиях (старше этап HH22). Для бывших ово электропорация, эмбрионы культивировали в чашках Петри, 9 и желточного и аллантоисной судах широко распространены. В этих условиях, чем старше куриных эмбрионов легко доступны и манипулировать. Таким образом, этот метод устраняет недостатки в ово электропорации применяется к старшему куриных эмбрионов. Используя этот метод, плазмиды могут быть легко трансфекции в разных частяхстаршего куриных эмбрионов 10-12.

Protocol

1. Ex ово культуры

  1. Свежие оплодотворенные яйца откладываются на их длинной стороне в принудительной проект инкубатора (BSS160, Эрет, Германия) на 37,5 ° С, влажности 60% для инкубации. Яйца хранились при температуре 12 ° С в течение более одной недели, не должны использоваться.
  2. После инкубации в течение 2,5 дней (около этап HH17), вынуть яйца и маркировать сверху карандашом, чтобы указать направление для взлома.
  3. До трещин, залить 20 мл стерильной дистиллированной воды в чистую большой чашке Петри (диаметром 145 мм; Greiner Bio-One GmbH, Германия).
  4. Установите еще один небольшой стерильной чашке Петри (диаметром 94 мм, Greiner Bio-One GmbH) в большой чашке Петри.
  5. Трещина яйца на нижнюю против острые края металла, осторожно откройте яйца и передать все содержимое каждого яйца в небольшой чашке Петри.
  6. Накройте большой чашке Петри с крышкой и поместить его в другой инкубатор (BINDER GmbH, Tuttlinge, Германия)для дальнейшей культуры в 37,5 ° C около 60% влажности. После инкубации в течение нужное количество дней, эмбрионы могут быть использованы для электропорации.

2. Подготовка к бывшим ово Электропорация

  1. Потяните стеклянных капилляров с микроэлектрода съемник (ПУЛ-100 микропипетки Puller, инструменты Всемирной Precision, Берлин, Германия) с использованием стеклянных трубок 1,0-мм (TW100F-4; инструменты Всемирного Precision) и разбить кончик стеклянные капилляры в соответствующие диаметре.
  2. Настройте соответствующие параметры (например, различные напряжения для различных тканей и размеров эмбрионов) для электропорации и подключения электродов электропоратора (CUY21-Edit, Непско генов, Чиба, Япония) в соответствии с целевым тканям и размеры эмбрионов.
  3. Подготовить раствор, содержащий плазмиду плазмид в векторном pCAGGS кодирования генов-мишеней, например, cadherin7 (Cad7; pCAGGS-Cad7 с концентрацией 2,0 мкг / мкл) и маркерный ген,например, зеленый флуоресцентный белок (GFP, pCAGGS-GFP при концентрации 0,25 мкг / мкл). Затем добавить Быстрый зеленый с конечной концентрации 0,1% (Sigma) для обозначения плазмиды решение с зеленым цветом.
  4. Загрузите стеклянный капилляр с плазмиды решения с использованием рот пипеткой.

3. Перенос генов в куриный оптический Tectum экс ово Электропорация

  1. После того, как бывший ово культуры, например, путем инкубации день (E) 6 куриных эмбрионов, которая используется для ово электропорации.
  2. Тщательно разорвать желточного и амнион мембраны на оптические покрышки с мелким щипцы и добавить 3 капли стерильного 0,9% раствора хлорида натрия на поверхности покрышки.
  3. Вводите плазмиды раствора в полость покрышки от стеклянного капилляра используя рот пипеткой.
  4. Установите электроды с вольфрамовым катодом иглы и анод прямоугольника пластины (СиУ 661-3х7, Непско Gene) рядом покрышки, исразу же применять электрические импульсы (шесть импульсов, 25 V, 60 мс длительность импульса 100 мс интервалов в каждом конкретном случае), производимых электропоратора на покрышки.
  5. Накройте большой чашке Петри с крышкой и вернуть его в инкубаторе. После инкубации в соответствующие дни (например, 2 или 3 дня после электропорации), покрышки собираются и фиксируются в иммунной (рис. 1) и биологические обнаружения.

4. Представитель Результаты

Успешное гиперэкспрессией экзогенного белка GFP Cad7 и экс ово электропорации показано на рисунке 1 в качестве примера. Когда Cad7 плазмиды вместе с GFP плазмида электропорации в покрышки на E6, два или три дня после электропорации эмбрионы были собраны и закреплены. В E8, белок GFP сильно выражено в покрышки в целом изображение горы (рис. 1А-C). Кроме того, в разделах покрышки на E9,GFP белка (зеленый на рисунке 1D) и Cad7 белка (красный рис 1E) являются coexpressed (желтый рис 1F), предполагая, что бывший ово электропорации является успешным методом для переноса генов в старших куриных эмбрионов в естественных условиях.

Рисунок 1
Рисунок 1. Когда плазмиды кодирования GFP и Cad7 которые cotransfected в куриных покрышки на E6, два или три дня после того, как бывший ово электропорация, GFP белка (зеленый) сильно выражено, как показано на wholemount изображений (АС) в Е8. В разделах покрышки на E9, GFP белка (зеленый D) и Cad7 белка (красный Е) coexpressed (желтый F). BF, яркое поле изображения. Масштаб по сайту: 200 мкм для переменного тока, 100 мкм, D для DF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол представляет собой руководство для переноса генов в старые куриных эмбрионах (например, в оптических покрышки на E6) экс ово электропорации. Этот метод расширяет возможности использования электропорации пожилых куриных эмбрионов и могут быть легко применены для многих лабораториях для изучения функций генов в естественных условиях на более поздних этапах. Эмбрионы с E4, по крайней мере E7 может быть успешно электропорации этим методом и электропорации эмбрионы могут быть выживания до E15 11. Кроме того, мозг, этот метод может быть использован для переноса генов в системе куриных конечностей 11.

Особое внимание должно быть уделено бывшим ово электропорации. Например, для того, чтобы получить высокую выживаемость эмбрионов экс ово культуры, яйца, используемые должны быть свежими и хранили менее одной недели при температуре 12 ° С, небольшие чашки Петри должно быть стерильным и яйца растрескивания производится около E2.5. Для бывших ово электропорация,Размер и расположение электродов должны быть правильно выбраны в зависимости от стадии и целевых часть эмбрионов. Когда две плазмиды cotransfected, вводят плазмиды должна быть в соответствующем соотношении концентраций (например, 1:8 между маркерный ген GFP и целевого гена) для того, чтобы быть уверенным, что GFP отмечены клетки почти coexpress целевого гена.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом от немецкого исследовательского фонда (DFG, LU1455/1-1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Electroporator Nepa Gene, Japan CUY21-Edit
Electrodes Nepa Gene, Japan CUY661-3x7
Egg incubator Ehret, Germany BSS160
Embryo incubator BINDER GmbH, Germany
Fluorescent microscope Keyence, Deutschland GmbH BZ-8000
Petri dish Greiner Bio-One GmbH, Germany
Micr–lectrode puller World Precision Instruments, Germany PUL-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
  2. Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
  3. Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
  4. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
  5. Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
  6. Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
  7. Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
  9. Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
  10. Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
  11. Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
  12. Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).

Tags

Молекулярная биология выпуск 65 генетики биологии развития переноса генов функции гена электропорация курица развитие
Перенос генов в старых куриных эмбрионов на<em&gt; Бывший ово</em&gt; Электропорация
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luo, J., Yan, X., Lin, J., Rolfs, A. More

Luo, J., Yan, X., Lin, J., Rolfs, A. Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4078, doi:10.3791/4078 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter