Summary
En metode for genoverføring til kylling embryoer ved senere inkubering stadier (eldre enn hamburger og Hamilton scenen (HH) 22) beskrives. Denne metoden overvinner ulempene ved
Abstract
Kyllingen embryo gir en utmerket modellsystem for å studere gen-funksjon og regulering under embryonal utvikling. I ovo electroporation er en kraftig metode for å over-uttrykke eksogene gener eller ned-regulere endogene gener in vivo i kylling embryoer 1. Ulike strukturer som for eksempel DNA plasmider koding gener 2-4, små interfererende RNA (siRNA) 5 plasmider, små syntetiske RNA oligos 6, og Morpholino antisens oligonucleotides 7 kan lett tilført til kylling embryoer ved electroporation. Men anvendelsen av i ovo electroporation begrenset til embryoer ved tidlige stadier inkubering (yngre enn stadium HH20 - ifølge Hamburg og Hamilton) 8 og det er noen ulemper for sin søknad i embryoer på senere stadier (eldre enn stadium HH22 - om lag 3,5 dager med utvikling). For eksempel er vitelline membranen på senere stadier vanligvisalliert stakk til Skal membranen og åpne et vindu i skallet forårsaker brudd på fartøyene, noe som resulterer i død av embryoene; eldre embryoer er dekket av vitelline og allantoic fartøy, der det er vanskelig å få tilgang til og manipulere embryoene; eldre embryoer flytte kraftig og er vanskelig å kontrollere retningen gjennom et relativt lite vindu i skallet.
I denne protokollen viser vi en ex ovo electroporation metode for genoverføring til kylling embryoer ved sene stadier (eldre enn scenen HH22). For ex ovo electroporation, er embryoer dyrket i petriskåler 9 og vitelline og allantoic fartøyene utbredt. Under disse forholdene, er de eldre kylling embryoer lett tilgjengelig og manipulert. Derfor overvinner denne metoden ulempene med i ovo electroporation anvendt til de eldre kylling embryoer. Ved hjelp av denne metoden, kan plasmider lett tilført i ulike delerav de eldre kylling embryoer 10-12.
Protocol
1. Ex ovo Kultur
- Ferske befruktede egg på den lange siden i en tvungen-utkast inkubator (BSS160, Ehret, Tyskland) ved 37,5 ° C med 60% fuktighet for inkubasjon. Egg oppbevares ved 12 ° C i mer enn én uke må ikke brukes.
- Etter inkubering for 2,5 dager (ca stadium HH17), ta ut eggene og merke toppen med en blyant for å indikere retning for sprekkdannelser.
- Før sprengning, hell ca 20 ml sterilt destillert vann i en ren stor petriskål (diameter 145 mm; Greiner Bio-One GmbH, Tyskland).
- Plasser en liten steril petriskål (diameter 94 mm, Greiner Bio-One GmbH) i den store petriskål.
- Sprekk eggene på undersiden mot en skarp metall kant, forsiktig åpne eggene og overføre hele innholdet av hvert egg inn i den lille petriskål.
- Dekk den store petriskål med lokk og sette det inn i en annen inkubator (BINDER GmbH, Tuttlinge, Tyskland)for videre kultur på 37,5 ° C med ca 60% fuktighet. Etter inkubering for ønsket antall dager, kan embryoene brukes til electroporation.
2. Forberedelse til ex ovo electroporation
- Trekk glass kapillærer med en microelectrode avtrekker (PUL-100 mikropipette Puller; Verden presisjonsinstrumenter, Berlin, Tyskland) ved hjelp av glassrør på 1,0 mm diameter (TW100F-4; Verden presisjonsinstrumenter) og bryte tuppen av glasset kapillærer inn i en passende diameter.
- Sett opp egnede parametre (dvs. forskjellige spenninger for forskjellige vev og størrelse på embryo) for electroporation og koble elektroder til en electroporator (CUY21-Edit; NEPA Gene, Chiba, Japan) i henhold til målet vev og størrelse av embryoer.
- Forbered en plasmid løsning som inneholder plasmider i pCAGGS vektor som koder et mål gen, f.eks cadherin7 (Cad7; pCAGGS-Cad7 med en konsentrasjon på 2,0 mikrogram / mL) og en markør genet,f.eks grønt fluorescerende protein (GFP; pCAGGS-GFP med en konsentrasjon på 0,25 mikrogram / mL). Deretter legger Fast grønn med en endelig konsentrasjon på 0,1% (Sigma) til å merke plasmidet løsningen med den grønne fargen.
- Legg glasset kapillære med plasmidet løsningen ved hjelp av en munn pipette.
3. Genoverføring til Chicken Optic Tectum av ex ovo electroporation
- Etter ex ovo kultur, for eksempel ved inkubering dag (E) 6, er kylling embryoer brukt til ex ovo electroporation.
- Riv forsiktig de vitelline og amnion membraner over optikken tectum med fine pinsett og legg 3 dråper steril 0,9% natriumkloridoppløsning på overflaten av tectum.
- Injiser plasmidet løsningen inn i hulrommet i tectum ved glass Kapillær bruke munnen pipette.
- Plasser elektrodene med en wolfram nål katode og en rektangel plate anode (CUY 661-3x7, NEPA Gene) ved siden av tectum, ogstraks søke elektriske pulser (seks pulser, 25 V, 60 ms puls lengde, 100 ms intervaller i hvert tilfelle) som produseres av electroporator til tectum.
- Dekk den store petriskål med lokk og returnere den inn i inkubatoren. Etter inkubering for aktuelle dager (f.eks 2 eller 3 dager etter electroporation), er det tectum samles og festes til farging (figur 1) og biologisk deteksjon.
4. Representative Resultater
Vellykket overuttrykte de eksogene proteiner av Cad7 og GFP av ex ovo electroporation er vist i Figur 1 som et eksempel. Når Cad7 plasmidet sammen med GFP plasmid ble electroporated inn tectum på E6, to eller tre dager etter electroporation embryoene ble samlet inn og fikset. På E8 er GFP protein sterkt uttrykt i tectum i hele mount bilder (figur 1A-C). Videre, i deler av tectum på E9,GFP protein (grønt i figur 1D) og Cad7 protein (rød i figur 1E) er coexpressed (gul i figur 1F), som tyder på at ex ovo electroporation er en vellykket metode for genoverføring til de eldre kylling embryoer in vivo.
Figur 1. Når plasmider koding GFP og Cad7 er cotransfected inn i kyllingen tectum på E6, to eller tre dager etter ex ovo electroporation, er GFP protein (grønn) uttrykte sterkt som vist i wholemount bilder (AC) på E8. I deler av tectum på E9, GFP protein (grønt i D) og Cad7 protein (rød i E) er coexpressed (gul i F). BF, lyse felt bilde. Scale bar: 200 mikrometer i A for AC; 100 mikrometer i D for DF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir en veiledning for genoverføring til eldre kylling embryoer (f.eks inn i optikken tectum ved E6) ved ex ovo electroporation. Denne metoden utvider bruken av electroporation til eldre kylling embryoer og kan enkelt brukes på mange laboratorier for å studere gen-funksjon in vivo på senere stadier. Embryoer fra E4 til minst E7 kan være vellykket electroporated av denne metoden og de electroporated embryoer kan være overlevelse frem til E15 11. Dessuten hjernen, kan denne metoden også brukes for genoverføring til kyllingen lem system 11.
Spesiell oppmerksomhet bør vies av ex ovo electroporation. For eksempel, for å oppnå høy overlevelse av embryoene ved ex ovo kultur, bør egg som brukes være frisk og lagres mindre enn en uke ved 12 ° C, de små petriskåler bør være steril og egg sprekker utført på rundt E2.5. For ex ovo electroporation, denstørrelse og plassering av elektroder bør være riktig velges i henhold til scenen og målrettet del av embryoene. Når to plasmider cotransfected, bør injiseres plasmider være i en passende forhold til konsentrasjon (f.eks 01:08 mellom markør GFP-genet og målrettet genet) for å være sikker på at GFP merket cellene er nesten coexpress målrettet genet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra det tyske Research Foundation (DFG, LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 | |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | ||
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| Micr–lectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
