Summary
Werkwijze voor genoverdracht in kippenembryo's bij later stadium incubatie (ouder dan Hamburger Hamilton fase (HH) 22) beschreven. Deze methode overwint nadelen
Abstract
De kip embryo biedt een uitstekende modelsysteem voor het bestuderen van gen-functie en regulatie tijdens de embryonale ontwikkeling. In ovo elektroporatie is een krachtige methode om overexpressie van exogene genen of endogene genen in vivo down-reguleren in kippenembryo's 1. Verschillende structuren zoals DNA plasmiden coderende genen 2-4 kleine interfererende RNA (siRNA) plasmiden 5 kleine kunststof RNA-oligo 6 en morfolino antisense oligonucleotiden 7 kan gemakkelijk worden getransfecteerd in kippenembryo door elektroporatie. Echter, de toepassing van in-ovo electroporatie beperkt tot embryo's in een vroeg stadium incubatie (jonger dan stadium HH20 - volgens Hamburg en Hamilton) 8 en er zijn enkele nadelen voor de toepassing ervan in embryo's in een later stadium (ouder dan stadium HH22 - ongeveer 3,5 dagen van de ontwikkeling). Bijvoorbeeld, de vitelline membraan in een later stadium is usubondgenoot vast aan de Shall membraan en het openen van een raam in de schelp veroorzaakt breuk van de schepen, de dood als gevolg van de embryo's; oudere embryo's worden gedekt door vitelline en allantoïs schepen, waar het moeilijk is om toegang te krijgen en manipuleren van de embryo's; oudere embryo's te verplaatsen krachtig en is het moeilijk om de oriëntatie te controleren door middel van een relatief klein venster in de shell.
In dit protocol tonen we aan een ex ovo elektroporatie methode voor gentransfer in kippenembryo's in de late stadia (ouder dan stadium HH22). Voor ex ovo elektroporatie, worden embryo's gekweekt in petrischalen 9 en de vitelline en allantoïs schepen worden op grote schaal verspreid. Onder de voorwaarden, worden de oudere kippenembryo's gemakkelijk bereikbaar en gemanipuleerd. Derhalve is deze methode overwint de nadelen van in ovo elektroporatie op de oudere kippenembryo's. Met deze methode kan plasmiden getransfecteerd gemakkelijk in verschillende delenvan de oude kippenembryo's 10-12.
Protocol
1. Ex ovo Cultuur
- Verse bevruchte eieren worden gelegd op hun lange zijde worden in een heteluchtoven-ontwerp van incubator (BSS160, Ehret, Duitsland) bij 37,5 ° C met 60% vochtigheid voor incubatie. Eieren opgeslagen bij 12 ° C langer dan een week niet worden gebruikt.
- Na incubatie gedurende 2,5 dag (ongeveer stadium HH17), neem de eieren en het etiket van de top met een potlood om richting aan te geven voor het kraken.
- Voor het kraken, giet ongeveer 20 ml steriel gedistilleerd water in een schone grote Petri-schaal (diameter van 145 mm, Greiner Bio-One GmbH, Duitsland).
- Plaats een andere kleine steriele petrischaal (diameter van 94 mm, Greiner Bio-One GmbH) in de grote petrischaal.
- Breek de eieren op de bodem tegen een scherpe metalen rand, voorzichtig open de eieren en breng de volledige inhoud van elk ei in de kleine petrischaal.
- Dek de grote petrischaal met een deksel en zet het in een andere incubator (Binder GmbH, Tuttlinge, Duitsland)verdere cultuur bij 37,5 ° C met 60% vochtigheid. Na incubatie gedurende het gewenste aantal dagen, kan de embryo worden gebruikt voor electroporatie.
2. Voorbereiding voor ex ovo Elektroporatie
- Trek glazen capillairen met een micro-elektrode trekker (PUL-100 Micropipet Puller; Wereld precisie-instrumenten, Berlijn, Duitsland) met behulp van glazen buizen van 1,0 mm diameter (TW100F-4; Wereld precisie-instrumenten) en breek de top van de glazen capillairen in een geschikte diameter.
- Stel de juiste parameters (dwz verschillende voltages voor de verschillende weefsels en de grootte van embryo's) voor elektroporatie en sluit elektroden op een electroporator (CUY21-Edit; Nepa Gene, Chiba, Japan) op basis van de te onderzoeken weefsels en de grootte van embryo's.
- Bereid een plasmide oplossing die plasmiden pCAGGS coderend voor een doelwitgen, bijvoorbeeld cadherin7 (Cad7; pCAGGS-Cad7 met een concentratie van 2,0 pg / pl) en een marker gen,bijvoorbeeld green fluorescent protein (GFP; pCAGGS-GFP in een concentratie van 0,25 pg / pl). Voeg Fast Green met een eindconcentratie van 0,1% (Sigma) het plasmide oplossing labelen met de groene kleur.
- Plaats de glazen capillair met het plasmide oplossing om met een mond pipet.
3. Gentransfer in Chicken Optic Tectum door ex ovo Elektroporatie
- Na ex ovo cultuur, bijvoorbeeld door incubatie dag (E) 6, worden de kippen embryo's die voor ex ovo elektroporatie.
- Scheur de vitelline en amnion membranen over de optische tectum met fijne pincet en voeg 3 druppels steriele 0,9% natriumchloride-oplossing op het oppervlak van het tectum.
- Injecteer het plasmide oplossing in de holte van de tectum door glazen capillair met de mond pipet.
- Plaats de elektroden met een wolfraam naald kathode en een rechthoek plaat anode (CUY 661-3x7, Nepa Gene) naast de tectum, enonmiddellijk ten elektrische pulsen (zes pulsen, 25 V, 60 ms pulslengte, 100 ms tussenpozen telkens) door de electroporator de tectum.
- Dek de grote petrischaal met het deksel en terug te sturen in de incubator. Na incubatie gedurende geschikte dag (bijvoorbeeld 2 tot 3 dagen na elektroporatie), de tectum verzameld en vastgesteld immunokleuring (figuur 1) en biologische detectie.
4. Representatieve resultaten
Succesvolle overexpressie van exogene eiwitten en Cad7 GFP door ex ovo elektroporatie is in figuur 1 als voorbeeld. Wanneer Cad7 plasmide met GFP plasmide werd geëlektroporeerd in de tectum op E6, twee of drie dagen na elektroporatie van de embryo's en gefixeerd. Bij E8 wordt het GFP-eiwit sterk tot uitdrukking in de tectum geheel houder beelden (figuur 1A-C). Bovendien is in de delen van het tectum op E9,GFP-eiwit (groen in figuur 1D) en Cad7 eiwit (rood in figuur 1E) zijn coexpressed (geel in figuur 1F), wat suggereert dat ex ovo elektroporatie is een succesvolle methode voor gentransfer in de oudere kippen embryo's in vivo.
Figuur 1. Wanneer de plasmiden coderen GFP en Cad7 worden gecotransfecteerd in de kip tectum op E6, twee of drie dagen na ex ovo elektroporatie wordt GFP-eiwit (groen) sterk tot expressie, zoals in wholemount beelden (AC) op E8. In delen van het tectum op E9, GFP-eiwit (groen in D) en Cad7 eiwit (rood in E) zijn coexpressed (geel in F). BF, helderveld afbeelding. Schaal bar: 200 pm in A voor AC; 100 micrometer op D voor DF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol geeft een leidraad voor gentransfer in oudere kippenembryo's (bijvoorbeeld in de optische tectum op E6) door ex ovo elektroporatie. Deze methode breidt het gebruik van elektroporatie oudere kippen embryo's en kunnen eenvoudig worden toegepast voor het bestuderen vele laboratoria genfunctie in vivo in een later stadium. Embryo van E4 tenminste E7 succes kan worden geëlektroporeerd met deze methode de geëlektroporeerde embryo's overleving tot E15 11. Naast de hersenen kan deze werkwijze ook worden gebruikt voor genoverdracht in de kip ledematenstelsel 11.
Speciale aandacht moet worden besteed aan door ex ovo elektroporatie. Bijvoorbeeld, om hoge overleven van de embryo's te verkrijgen door ex ovo cultuur moet worden gebruikt eieren vers en opgeslagen minder dan een week bij 12 ° C, de kleine Petrischalen moet steriel en eieren kraken uitgevoerd rond e2.5. Vb ovo elektroporatie, degrootte en plaatsing van de elektroden dienen correct te worden gekozen op basis van het podium en gerichte deel van de embryo's. Wanneer twee plasmiden getransfecteerd moet de toegediende plasmiden in een geschikte verhouding van de concentratie (bijvoorbeeld 1:8 tussen de marker GFP-gen en gerichte gen) om te zorgen dat de gemerkte cellen bijna GFP worden gerichte gen coexpress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Duitse Research Foundation (DFG, LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 | |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | ||
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| Micr–lectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
