Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Genöverföring till äldre kycklingembryon med Published: July 27, 2012 doi: 10.3791/4078

Summary

En metod för genöverföring in i kycklingembryon vid senare stadier inkubation (äldre än Hamburger och Hamilton steg (HH) 22) beskrivs. Denna metod övervinner nackdelarna hos

Abstract

Den kycklingembryo tillhandahåller en utmärkt modellsystem för att studera genfunktion och reglering under embryonal utveckling. In ovo elektroporering är en kraftfull metod för att över-uttrycka exogena gener eller nedreglera endogena gener in vivo i kycklingembryon 1. Olika strukturer, såsom DNA-plasmider gener som kodar 2-4, små störande RNA (siRNA) plasmider 5, liten syntetiskt RNA oligos 6 och morfolino antisensoligonukleotider 7 kan enkelt transfekteras in kycklingembryon genom elektroporation. Dock tillämpningen av i ovo elektroporering begränsas till embryon i tidiga inkubationsbetingelser stadier (yngre än skede HH20 - enligt Hamburg och Hamilton) 8 och det finns vissa nackdelar för dess tillämpning i embryon i senare skeden (äldre än skede HH22 - cirka 3,5 dagar utveckling). Till exempel är vitellinmembranet vid senare stadier Usuallierad fastnat De skall membranet och öppna ett fönster i skalet gör bristning av fartyg, vilket resulterar i döden av embryon, äldre embryon omfattas av vitelline och allantois fartyg, där det är svårt att komma åt och manipulera embryon, äldre embryon gå kraftigt och är svår att reglera orienteringen genom en relativt liten fönster i höljet.

I detta protokoll visar vi ett ex ovo elektroporering metod för genöverföring till kycklingembryon i sena stadier (äldre än steg HH22). För ex ovo elektroporering är embryon odlas i petriskålar 9 och vitelline och allantoiska fartyg spridda. Under dessa betingelser är de äldre kycklingembryon lättillgängliga och manipuleras. Därför övervinner denna metod nackdelarna med i ovo elektroporering tillämpas på de äldre kycklingembryon. Med användning av denna metod, kan plasmider lätt transfekteras in i olika delarav de äldre kycklingembryon 10-12.

Protocol

1. Ex ovo kultur

  1. Färska befruktade ägg som på sin långsida i en forcerad utkast till inkubator (BSS160, Ehret, Tyskland) vid 37,5 ° C med 60% luftfuktighet för inkubation. Ägg som lagrats vid 12 ° C under längre tid än en vecka bör inte användas.
  2. Efter inkubation under 2,5 dagar (ca steg HH17), ta ut äggen och märka toppen med en penna för att ange riktning för sprickbildning.
  3. Innan sprickbildning, häll ca 20 ml sterilt destillerat vatten i en ren stor petriskål (diameter 145 mm, Greiner Bio-One GmbH, Tyskland).
  4. Placera en annan liten steril petriskål (diameter 94 mm, Greiner Bio-One GmbH) i den stora petriskål.
  5. Knäcka ägg på botten mot en vassa kant, öppna försiktigt äggen och överföra hela innehållet i varje ägg i den lilla petriskål.
  6. Täck den stora Petri-skål med lock och lägg den i en annan inkubator (Binder GmbH, Tuttlinge, Tyskland)för ytterligare odling vid 37,5 ° C med ca 60% fuktighet. Efter inkubation under det önskade antalet dagar, kan embryona användas för elektroporering.

2. Förberedelse för ex ovo Elektroporation

  1. Pull glaskapillärer med en mikroelektrod avdragare (PUL-100 Mikropipett Avdragare; World Precision Instruments, Berlin, Tyskland) med användning av glasrör av 1,0 mm diameter (TW100F-4; World Precision Instruments) och bryta spetsen på glas kapillärer i en lämplig diameter.
  2. Ställ in lämpliga parametrar (dvs. olika spänningar för olika vävnader och storlek av embryon) för elektroporering och anslut elektroderna till en elektroporator (CUY21-Edit, Nepa Gene, Chiba, Japan) enligt målvävnaderna och storlek av embryon.
  3. Framställa en plasmid innehållande plasmiderna i pCAGGS-vektom som kodar en målgen, t.ex., cadherin7 (Cad7; pCAGGS-Cad7 med en koncentration av 2,0 pg / pl) och en markörgen,t.ex. grönt fluorescerande protein (GFP; pCAGGS-GFP med en koncentration av 0,25 pg / pl). Tillsätt sedan Fast Green med en slutlig koncentration av 0,1% (Sigma) för att märka plasmiden lösning med grön färg.
  4. Ladda glaskapillär med plasmiden med användning av en mun-pipett.

3. Genöverföring till Chicken Optic tektum av ex ovo Elektroporation

  1. Efter ex ovo kultur, t ex genom inkubation dag (E) 6, är de kycklingembryon används för ex ovo elektroporering.
  2. Noggrant riva de vitelline och amnion membran över den optiska tektum med fin pincett och tillsätt 3 droppar steril 0,9% natriumklorid-lösning på ytan av den tektum.
  3. Injicera den plasmid lösning in i håligheten i den tektum genom glaskapillär med munnen pipett.
  4. Placera elektroderna med en volfram nål katod och en rektangel platta anod (Cuy 661-3x7, Nepa Gene) bredvid tektum ochomedelbart med elektriska pulser (sex pulser, 25 V, 60 ms pulslängd, 100 ms intervall i varje fall) som produceras av elektroporator till tektum.
  5. Täcka stor petriskål med locket och returnera den till inkubatorn. Efter inkubation lämpliga dagar (t.ex., 2 eller 3 dagar efter elektroporering), är de tektum samlas in och fastställas för immunfärgning (figur 1) och biologisk upptäckt.

4. Representativa resultat

Framgångsrik överexpression av de exogena proteiner av Cad7 och GFP genom ex ovo elektroporering visas i figur 1 som ett exempel. När Cad7 plasmid tillsammans med GFP Plasmiden elektroporerades in i tektum på E6, två eller tre dagar efter elektroporering embryona samlades och fixerades. Vid E8 är GFP-proteinet uttrycks starkt i tektum i hela monteringspunkter bilder (Fig. 1 A-C). Dessutom, i delar av tektum på E9,GFP-proteinet (grön i figur 1D) och Cad7 protein (röd i figur 1E) är samuttryckt (gul i figur 1 F), vilket antyder att ex ovo elektroporering är en framgångsrik metod för genöverföring in i de äldre kycklingembryon in vivo.

Figur 1
Figur 1. När plasmider kodning GFP och Cad7 samtransfekteras in i kycklingen tektum på E6, två eller tre dagar efter ex ovo elektroporering är GFP protein (grön) starkt uttryckt som visas i wholemount bilder (AC) vid E8. I delar av tektum på E9, GFP protein (gröna i D) och Cad7 protein (röd i E) är samuttryckt (gul i F). BF, ljusfältsbild. Skala bar: 200 m på ett för AC, 100 nm i D för DF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll ger en vägledning för genöverföring till äldre kycklingembryon (t.ex. i optiska tektum vid E6) med ex ovo elektroporation. Denna metod sträcker sig användning av elektroporering för att äldre kycklingembryon och kan lätt tillämpas på många laboratorier för att studera genfunktion in vivo i senare skeden. Embryon från E4 till minst E7 kan framgångsrikt elektroporeras med denna metod och de elektroporerade embryona kan överleva fram till E15 11. Förutom hjärnan, kan denna metod även användas för genöverföring in i kyckling lemmen systemet 11.

Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt genom att ex ovo elektroporation. Till exempel, för att få hög överlevnad av embryon genom ex ovo kultur, bör användas ägg vara färska och lagras mindre än en vecka vid 12 ° C, de små Petriskålarna bör vara sterila och ägg sprickbildning utförs runt E2.5. För ex ovo elektroporering,Storleken och placeringen av elektroderna bör vara korrekt väljas beroende på stadiet och riktad del av embryona. När två plasmider samtransfekterades bör de injicerade plasmider vara i ett lämpligt förhållande av koncentrationen (t ex 01:08 mellan markören GFP-genen och målgenen) för att vara säker på att de GFP-märkta celler är nästan samuttrycka den målsökta genen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett bidrag från den tyska Research Foundation (DFG, LU1455/1-1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Electroporator Nepa Gene, Japan CUY21-Edit
Electrodes Nepa Gene, Japan CUY661-3x7
Egg incubator Ehret, Germany BSS160
Embryo incubator BINDER GmbH, Germany
Fluorescent microscope Keyence, Deutschland GmbH BZ-8000
Petri dish Greiner Bio-One GmbH, Germany
Micr–lectrode puller World Precision Instruments, Germany PUL-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
  2. Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
  3. Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
  4. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
  5. Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
  6. Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
  7. Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
  9. Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
  10. Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
  11. Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
  12. Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).

Tags

Molecular Biology utgåva 65 Genetics Developmental Biology Genöverföring genfunktion elektroporering kyckling utveckling
Genöverföring till äldre kycklingembryon med<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luo, J., Yan, X., Lin, J., Rolfs, A. More

Luo, J., Yan, X., Lin, J., Rolfs, A. Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4078, doi:10.3791/4078 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter