Summary
En fremgangsmåde til genoverførsel til kyllingeembryoner på senere inkubering trin (ældre end Hamburger og Hamilton trin (HH) 22) er beskrevet. Denne fremgangsmåde overvinder ulemperne
Abstract
Den kyllingembryo tilvejebringer en fremragende model-system til undersøgelse genfunktioner og regulering under embryonisk udvikling. In ovo elektroporering er en kraftig metode til over-udtrykke eksogene gener eller nedregulere endogene gener in vivo i kyllingeembryoer 1. Forskellige konstruktioner, såsom DNA-plasmider kodende gener 2-4, små interfererende RNA (siRNA) plasmider 5 lille syntetisk RNA oligoer 6, og morpholino antisense-oligonukleotider 7 let kan transficeres ind i kyllingeembryoer ved elektroporering. Dog er anvendelsen af in ovo elektroporation begrænset til embryoner på tidlige inkubationstider stadier (yngre end etape HH20 - i henhold til Hamburg og Hamilton), 8, og der er nogle ulemper for dens anvendelse i embryoner i senere faser (ældre end etape HH22 - cirka 3,5 dag til udvikling). For eksempel er vitellinmembranen på senere stadier usuallieret holdt sig til De underretter membranen og åbne et vindue i skallen forårsager brud på de fartøjer, hvilket resulterer i død af embryoner; ældre embryoner er omfattet af vitellin og allantois fartøjer, hvor det er vanskeligt at få adgang til og manipulere de embryoner, ældre embryoner flytte kraftigt og er vanskelig at styre orienteringen gennem et relativt lille vindue i skallen.
I denne protokol vi vise en ex ovo elektroporation metode til genoverførsel i kyllingeembryoer på sene stadier (ældre end etape HH22). For ex ovo elektroporation, er embryoner dyrkes i petriskåle 9 og vitellin og allantois skibe er meget udbredt. Under disse betingelser, er de ældre kyllingeembryoer let adgang til og manipulere. Derfor er denne metode overvinder ulemperne ved in ovo elektroporering anvendes på gamle kyllingeembryoner. Anvendelse af denne fremgangsmåde, kan plasmider let transficeres i forskellige deleDe ældre kyllingeembryoner 10-12.
Protocol
1. Ex ovo Culture
- Friske befrugtede æg er lagt på den lange side i en tvungen udkast inkubator (BSS160, Ehret, Tyskland) ved 37,5 ° C med 60% fugtighed for inkubering. Æg opbevaret ved 12 ° C i længere end en uge, bør ikke anvendes.
- Efter inkubation i 2,5 dage (ca. etape HH17), tage æggene og mærke toppen med en blyant for at angive retning for revner.
- Før revner, hæld ca 20 ml sterilt destilleret vand i en ren stor petriskål (diameter 145 mm; Greiner Bio-One GmbH, Tyskland).
- Placer en anden lille steril petriskål (diameter på 94 mm; Greiner Bio-One GmbH) i den store petriskål.
- Knæk æggene på bunden mod en skarp metal kant, åbnes forsigtigt æggene og overføre hele indholdet af hvert æg ind i det lille petriskål.
- Dæk den store petriskål med låg og sætte det ind i en anden inkubator (BINDER GmbH, Tuttlinge, Tyskland)yderligere dyrkning ved 37,5 ° C med 60% fugtighed. Efter inkubation i det ønskede antal dage, kan embryonerne anvendes til elektroporation.
2. Forberedelse til ex ovo Elektroporation
- Træk glaskapillarer med en mikroelektrode aftrækker (Pul-100 Mikropipette Puller; World Precision Instruments, Berlin, Tyskland) under anvendelse af rør med 1,0 mm diameter (TW100F-4, World Precision Instruments) og bryde spidsen af glaskapillarer på et passende diameter.
- Indstil passende parametre (dvs. forskellige spændinger for de forskellige væv og størrelsen af embryoner) til elektroporation og forbinde elektroder til en elektroporator (CUY21-Edit, Nepa Gene, Chiba, Japan) i henhold til de målvæv og størrelse af embryoner.
- Fremstilling af et plasmid indeholdende plasmider i pCAGGS-vektoren koder for et målgen, f.eks cadherin7 (Cad7; pCAGGS-Cad7 med en koncentration på 2,0 ug / ul) og et markørgen,f.eks grønt fluorescerende protein (GFP; pCAGGS-GFP med en koncentration på 0,25 ug / ul). Derpå tilsættes Fast Green med en slutkoncentration på 0,1% (Sigma) for at mærke plasmidet opløsning med den grønne farve.
- Indlæse glaskapillar med plasmidet under anvendelse af en munding pipette.
3. Gene Transfer til kylling Optic Tectum af ex ovo Elektroporation
- Efter ex ovo kultur, fx ved inkubation dag (e) 6, er kyllingeembryoner anvendes til ex ovo elektroporering.
- Omhyggeligt rive vitellin og amnion membraner over optikken tectum med fine pincetter og tilsættes 3 dråber steril 0,9% natriumchloridopløsning på overfladen af tectum.
- Injicere plasmid opløsningen ind i hulrummet af tectum ved kapillarrøret ved hjælp af mund pipetten.
- Placere elektroderne med en wolfram nål katode og en rektangel plade anode (CUY 661-3x7, Nepa Gene) ved siden af tectum, ogumiddelbart anvendes elektriske impulser (seks pulser, 25 V, 60 ms impulslængden, 100 ms intervaller i hvert tilfælde) produceret af elektroporator til tectum.
- Dække store petriskål med låget og tilbage i inkubatoren. Efter inkubation i passende dage (fx 2 eller 3 dage efter elektroporering), er de tectum opsamles og fastgjort til immunfarvning (figur 1) og biologisk detektion.
4. Repræsentative resultater
Vellykket overekspression af exogene proteiner i Cad7 og GFP ved ex ovo elektroporering er vist i figur 1 som eksempel. Når Cad7 plasmid sammen med GFP plasmid blev elektroporeret i tectum på E6, to eller tre dage efter elektroporation embryonerne blev indsamlet og fast. Ved E8 er GFP-protein udtrykkes kraftigt i tectum i whole mount billeder (figur 1A-C). Desuden i de sektioner af tectum ved E9,GFP-protein (grøn i figur 1D) og Cad7 protein (rød i figur 1E) er co-udtrykte (gul i figur 1F), hvilket antyder, at ex ovo elektroporering er en vellykket fremgangsmåde til genoverførsel til de ældre kyllingeembryoner in vivo.
Figur 1. Når plasmider der koder for GFP, og Cad7 cotransficeres ind i kyllingen tectum ved E6, to eller tre dage efter ex ovo elektroporering er GFP-protein (grøn) stærkt udtrykt som vist i wholemount billeder (AC) på E8. I sektioner af tectum ved E9, er GFP-protein (grønt D) og Cad7 protein (rød E) co-udtrykte (gul F). BF, lyst område billede. Målestok: 200 um i A for AC; 100 um i D for DF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en guide til genoverførsel i ældre kyllingeembryoer (f.eks i den optiske tectum på E6) ved ex ovo elektroporation. Denne fremgangsmåde omfatter anvendelse af elektroporation til ældre kyllingeembryoner og kan let anvendes til mange laboratorier for at studere genfunktion in vivo på senere tidspunkter. Embryoer fra E4 til mindst E7 held kan elektroporeret ved denne fremgangsmåde, og de elektroporerede embryoner kan overlevelse indtil E15 11. Udover hjernen, kan denne fremgangsmåde også anvendes til genoverførsel til kyllingen led systemet 11.
Særlig opmærksomhed skal rettes til af ex ovo elektroporation. For eksempel for at opnå høj overlevelse af embryoner ex ovo kulturen anvendte æg være frisk og opbevaret under en uge ved 12 ° C; små petriskåle bør være steril og æg revnedannelse udføres ved omkring E2.5. Til ex ovo elektroporering,Størrelsen og placeringen af elektroderne skal være korrekt vælges i overensstemmelse med trin og målrettet del af embryoner. Når to plasmider transfekteres, bør de injicerede plasmider i et passende forhold af koncentrationen (f.eks 01:08 mellem markøren GFP-genet og målrettet genet) for at være sikker på, at GFP-mærkede celler er næsten co-udtrykke det targetede gen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra den tyske Research Foundation (DFG, LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 | |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | ||
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| Micr–lectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
