Summary
後のインキュベーション段階（ハンバーガーとハミルトンステージ（HH）22歳以上）でニワトリ胚への遺伝子導入方法が記載されています。このメソッドは次の欠点を克服する
Abstract
ニワトリ胚は、胚発生時の遺伝子の機能と調節を研究するための優れたモデルシステムを提供します。OVOエレクトロポレーションで過剰発現する外来遺伝子に強力なメソッドまたはニワトリ胚1のin vivoでダウンレギュレートする内因性遺伝子である。このようなDNAプラスミドをコードする遺伝子2-4、低分子干渉RNA（siRNA）のプラスミド5、小さな合成RNAオリゴ6、モルホリノ、アンチセンスオリゴヌクレオチド7と異なる構造を簡単にエレクトロポレーションによってニワトリ胚にトランスフェクトすることができます。しかし、OVOエレクトロポレーションでのアプリケーションは、初期のインキュベーション段階（ステージHH20未満-ハンブルクとハミルトンによる）で胚に限定されている8およびそれ以降の段階で胚への応用のためのいくつかの欠点は、（ステージHH22歳以上あります-約3.5開発の日）。たとえば、後の段階では卵黄膜は有珠山である味方SHALL膜に付着し、シェルウィンドウを開くには、胚の死、その結果、血管の破裂を引き起こす。古い胚は、それが胚にアクセスして操作することは困難である卵黄と尿膜の血管によって覆われている、古い胚が移動精力的に、シェルでは比較的小さな窓から配向性を制御することは困難である。
このプロトコルでは、後期段階（ステージHH22歳以上）でニワトリ胚への遺伝子導入のために元のOVOエレクトロポレーション法を示しています。 元OVOエレクトロポレーションのために、胚はペトリ皿9に培養されており、卵黄や尿管が広く普及しています。これらの条件下では、古いニワトリ胚は、簡単にアクセスおよび操作されます。したがって、このメソッドは、以前のニワトリ胚に適用されるOVOエレクトロポレーションでの欠点を克服しています。この方法を使用して、プラスミドを容易に異なる部分にトランスフェクトすることができます古いニワトリ胚10-12。
Protocol
1 例OVO文化
- 新鮮な受精卵は、インキュベーションのために60％の湿度で37.5で強制ドラフトインキュベーター（BSS160、エレット、ドイツ）°Cでの長い側に配置されます。より長い一週間に12℃で保存した卵は使用すべきではありません。
- 2.5日（ステージHH17程度）のインキュベーション後、卵を取り出し、クラックの方向性を示すために、鉛筆で上部にラベルを付けます。
- クラッキングの前に、きれいな大型のペトリ皿（;グライナーバイオワン社、ドイツ145ミリメートルの直径）に約20 mlの滅菌蒸留水を注ぐ。
- 大規模なペトリ皿に、別の小さな滅菌シャーレ（グライナーバイオワン社94ミリメートルの直径）を配置します。
- 鋭い金属エッジに対して底部に卵を割る、慎重に卵を開いて、小さなペトリ皿にそれぞれの卵の内容全体を転送します。
- 蓋付きの大きなペトリ皿をカバーし、別のインキュベーターに入れて（BINDER社、Tuttlinge、ドイツ）さらに文化の37.5℃で約60％の湿度である。日、所望の数のインキュベーションの後、胚はエレクトロポレーションに使用することができます。
2。 元OVOエレクトロポレーションの準備
- 1.0 mm径のガラス管を使用して（TW100F-4、世界の精密機器）微小電極プーラー（ワールド·精密機器、ベルリン、ドイツPUL-100マイクロピペットプラー）でガラスキャピラリーを引き出し、適切にガラスキャピラリーの先端を破る直径。
- 標的組織および胚の大きさに応じて、エレクトロポレーションのために適切なパラメータを（異なる組織および胚の大きさのために、すなわち、異なる電圧）を設定し、エレクトロに電極を接続します（NEPAジーン、千葉県、日本CUY21·エディット）。
- とマーカー遺伝子、ターゲット遺伝子をコードするpCAGGSベクターのプラスミド、例えばcadherin7（2.0μg/μLの濃度のpCAGGS-Cad7 Cad7）を含むプラスミド溶液を調製例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP、0.25μg/μLの濃度のpCAGGS-GFP）。その後、緑の色でプラスミド溶液にラベルを付けるために最終濃度0.1％（Sigma）でファストグリーンを追加します。
- 口のピペットを用いてプラスミド溶液とガラスキャピラリーをロードします。
3。 元OVOエレクトロポレーションによるニワトリ視蓋への遺伝子導入
- 元OVO培養後、例えば、インキュベーション日（E）6によって、ニワトリ胚は 、ex OVOエレクトロポレーションに使用されています。
- 慎重に微細な鉗子で視蓋の上に卵黄と羊膜を引き裂き、蓋の表面に滅菌した0.9％塩化ナトリウム溶液3滴を追加します。
- 口のピペットを用いてガラスキャピラリーによる蓋の空洞にプラスミド溶液を注入します。
- タングステンニードルカソードと蓋の横にある長方形の板のアノード（CUY 661-3x7、NEPAジーン）で電極を配置し、すぐに蓋にエレクトロによって生成された電気パルス（6パルス、25 V、60 msパルスの長さ、それぞれのケースでは100ミリ秒間隔）を適用します。
- 蓋付きの大きなペトリ皿をカバーし、インキュベーターに戻すことができます。適切な日数（例えば、2または3日エレクトロポレーション後）のインキュベーションの後、蓋を免疫染色（ 図1）と生物学的検出のために収集され、固定されています。
4。代表的な結果
元OVOエレクトロポレーションによるCad7とGFPの外因性タンパク質の過剰発現が成功した例として、図1に示されています。プラスミドGFPと一緒にCad7プラスミドときには、胚を採取し、固定した二、三日後、エレクトロポレーション、E6で蓋にエレクトロポレートした。 E8では、GFPタンパク質が強く全体のマウント画像の蓋（ 図1A-C）で表されます。また、E9で蓋のセクションで、GFPタンパク質（ 図1Dの緑）とCad7タンパク質（ 図1Eの赤）EX OVOエレクトロポレーションは 、in vivo での古いニワトリ胚への遺伝子導入のために成功した方法であることを示唆している（ 図1Fの黄色）共発現である。
E8でwholemount画像（AC）に示すように、 図1。プラスミドのエンコーディングGFPとCad7が二、三日の元のOVOエレクトロポレーションした後、E6で鶏の蓋にコトランスフェクトされた場合、GFPタンパク質（緑）が強く発現されています。 E9で蓋のセクションでは、GFPタンパク質（Dの緑）とCad7タンパク質（Eの赤）（Fの黄色）共発現されています。 BF、明視野像。スケールバー：AC用では200μm、DFのDで100μmである。
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Discussion
このプロトコルは、 元のOVOエレクトロポレーションによって、古いニワトリ胚への遺伝子導入（例えば、E6で視蓋に）のためのガイドを提供します。このメソッドは古い鶏胚にエレクトロポレーションの使用を拡張し、簡単に後の段階でin vivoでの遺伝子機能を研究するための多くの研究室に適用することができます。 E4から少なくともE7の胚は正常にこのメソッドによってエレクトロポレーションすることができ、エレクトロポレーションした胚は、E15 11時まで生存することができます。脳のほかに、このメソッドはまた鶏の肢システム11への遺伝子導入に使用することができます。
特別な注意は 、ex OVOエレクトロポレーションによって支払われるべきである。たとえば、 元のOVO培養による胚の高い生存率を得るために、使用される卵は12で、新鮮で格納されて1週間未満でなければなりません°C;小さなペトリ皿は無菌であるべきであり、卵はE2.5の周りで行わ割れ。 元OVOエレクトロポレーションのために、電極のサイズと配置が正しくステージと胚の標的部分に応じて選択する必要があります。二つのプラスミドをトランスフェクションされた場合、注入されたプラスミドは、GFPマークされた細胞はほとんど標的遺伝子を共発現されることを確認するために、濃度の適切な比率（例えば、マーカーGFP遺伝子と標的遺伝子の間で1:8）にする必要があります。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、ドイツ研究財団（; LU1455/1-1 DFG）からの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 | |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | ||
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| Micr–lectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
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