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Neuroscience

वयस्क चूहे में विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों की Excitotoxic घाव के लिए stereotaxic सर्जरी

Published: July 19, 2012 doi: 10.3791/4079

Summary

विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र की एक stereotaxic निर्देशांक का उपयोग excitotoxin की जलसेक द्वारा लक्षित पृथक (ओं) में वर्णित है. इस तकनीक को भी चूहे के मस्तिष्क में अन्य रसायनों के अर्क के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Protocol

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संज्ञाहरण और पीड़ाशून्यता: संज्ञाहरण के लिए तीस मिनट से पहले, 0.05 मिलीग्राम / किग्रा उपचर्म buprenorphine analgesia के लिए के साथ चूहा इंजेक्षन. 30-40 मिलीग्राम / किग्रा intraperitoneal सोडियम pentobarbital के साथ संज्ञाहरण आरंभ करें. इस बिंदु पर, atropine भी इंजेक्षन करने के लिए एनाल्जेसिक आगे (चमड़े के नीचे 2 मिलीग्राम / किग्रा) के रूप में श्वसन (0.4 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे) विफलता और meloxicam को रोकने. यदि 5 मिनट के बाद, चूहा अभी भी मोबाइल या पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए उत्तरदायी है, pentobarbital सोडियम 5 बजे के बाद खुराक दे मिलीग्राम / किग्रा (intraperitoneal) तक चूहे दर्द के लिए अनुत्तरदायी है. पहले चीरा प्रदर्शन से पहले, चीरा साइट पर स्थानीय संज्ञाहरण के लिए lidocaine (5 मिग्रा / किग्रा, अंतर्त्वचीय) इंजेक्षन. प्रारंभिक इंजेक्शन के बाद छह से आठ घंटे, 0.05 analgesia के लिए मिलीग्राम / किग्रा उपचर्म buprenorphine साथ चूहा इंजेक्षन. Buprenorphine हर 6-8 घंटे अंतःक्षिप्त किया जा सकता है उसके बाद अगर जरूरत है, हालांकि यह आम तौर पर आवश्यक नहीं है.

यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि संज्ञाहरण ग के अन्य रूपोंexcitotoxic घावों के साथ हस्तक्षेप. उदाहरण के लिए, हालांकि ketamine कृन्तकों में संज्ञाहरण के एक आमतौर पर इस्तेमाल किया रूप है, यह NMDA साथ प्रेरित घावों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं क्योंकि यह एक NMDA रिसेप्टर प्रतिपक्षी है. यह उत्प्रेरण संज्ञाहरण की एक विधि है कि घाव आकार को कम नहीं करता है का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि गैस संज्ञाहरण वांछित है, यहाँ वर्णित उन सहित सबसे stereotaxic उपकरणों गैस मास्क एडेप्टर को समायोजित कर सकते हैं.

नोट: सामग्री और विशिष्ट अभिकर्मकों और नीचे उपकरण की टेबल में वर्णित हैं.

1. पम्प और Stereotax के तैयार करना

  1. बाँझ पानी के साथ एक 10 μl हैमिल्टन सिरिंज भरें और यह एक 6 सिरिंज प्रोग्राम पंप के चायदान में माउंट. पंप पर clamped धारक में सिरिंज सवार के अंत सुरक्षित.
  2. मुद्रित बाँझ पानी का उपयोग कर एक सुई और 1 मिलीग्राम सिरिंज के साथ PE20 टयूबिंग गैस निष्फल. हैमिल्टन सिरिंज पर टयूबिंग के खुले अंत स्लाइड, देखभाल जा रहा हैट्यूब में किसी भी हवाई बुलबुले बनाने से बचने के ful.
  3. 30ga, फ्लैट कटौती, टयूबिंग की 1 इंच जलसेक सुई अंत एक stereotaxic एक इलेक्ट्रोड बैरल शैली जोड़तोड़ के उपकरण का उपयोग कर के हाथ पर क्लैंप. दबाना और अंडाकार प्रति बैरल के बीच जलसेक सुई डालें. यह भीतर धातु सुई युक्त टयूबिंग टयूबिंग सपाट और द्रव का प्रवाह सीमित से बचने का एक टुकड़ा से अधिक दबाना सुरक्षित.
  4. > / Μl मिनट 5 पंप दर को समायोजित करें और पंप पर बारी. पानी की एक मनका जलसेक सुई की नोक पर दिखाई देनी चाहिए. टयूबिंग और अपने जोड़ों के लिए यकीन है कि वहाँ कोई लीक कर रहे हैं बनाने की लंबाई की जाँच करें.
  5. पोछो दूर एक बाँझ झाड़ू के साथ मनका पानी और पंप सेट को वापस लेने. एक 2 μl हवा बुलबुला वापस ले लें. बुलबुले के शीर्ष टयूबिंग में दिखाई जानी चाहिए.
  6. जलसेक सुई टिप बाँझ 0.1M पीबीएस में एक 20 मिलीग्राम / एमएल NMDA के समाधान में विसर्जित कर दिया और 4-5 μl वापस लेने. एक हवाई बुलबुले बाँझ पानी और NMDA समाधान के बीच दिखाई होना चाहिएटिप में. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि NMDA एक शक्तिशाली neurotoxin है और सावधानी और इस समाधान की तैयारी से निपटने में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. दस्ताने और आँख संरक्षण हर समय सलाह दी जाती है.

2. Stereotaxic डिवाइस में चूहा माउंट

  1. चित्रा 1 stereotaxic डिवाइस के बुनियादी भागों दर्शाया गया है. आँखों के कान करने के लिए लाइन से चूहा सिर हजामत बनाने का काम करने के बाद, चूहा शरीर मध्यम पर सेट एक हीटिंग पैड पर आराम के साथ काटने पट्टी पर चूहे के सामने दांत, लोड. जीभ काटने पट्टी के नीचे निचले जबड़े के साथ, लटका देना चाहिए. यदि उपलब्ध है, एक तापमान प्रतिक्रिया हीटिंग पैड बेहतर होगा. गुदा तापमान की निगरानी भी आदर्श होगा.
  2. अंगूठे और तर्जनी के साथ होल्डिंग चूहा गर्दन, सही कान पट्टी पर सही क्षैतिज कान नहर चाल. बार की तरह यह एक ठोस जगह पर आराम कर रहा है महसूस करना चाहिए, यह सिर में दूर की तरह नहीं डूब. होल्डिंग सिर के दाईं ओर, स्थिर, बाएँ कान स्लाइडचूहे छोड़ दिया क्षैतिज कान नहर में बार. यह महसूस करना चाहिए जैसे कि यह एक ठोस जगह पर आराम कर रहा है. pinnae सममित देखो और कान सलाखों पर फ्लैट झूठ दिखाई चाहिए. उर्ध्व pinnae का जगमगाता हुआ कान सलाखों के अनुचित स्थान को इंगित करता है. सिर गर्दन पर दबाव के जवाब में नहीं लड़खड़ा चाहिए.
  3. नीचे नाक बार भाड़ में. कोमल हो. नाक में हड्डियों नाजुक हैं और नाक पट्टी तंग होने की जरूरत नहीं है. जाँच करें कि चूहे अभी भी आगे बढ़ने से पहले anesthetized है.

3. सर्जरी के लिए चूहा तैयारी

  1. एक बाँझ झाड़ू का प्रयोग, धीरे चूहा आंखों में से प्रत्येक में पशु चिकित्सा नेत्र चिकनाई मरहम की एक छोटी राशि जगह उन्हें सुखाने और मलबे से बचाने के.
  2. Concentrically मुंडा क्षेत्र के किनारे करने के लिए योजना बनाई चीरा साइट से, chlorhexidine 2% समाधान के साथ चूहा खोपड़ी पोंछ 70% इथेनॉल तीन बार पीछा किया. Chlorhexidine साफ़ भी अगर अधिक प्रभावी निस्संक्रामक वांछित है इस्तेमाल किया जा सकता है.10% povidone आयोडीन समाधान के साथ पोंछते द्वारा समाप्त. अब तैयार खोपड़ी है और बाँझ बाँझ सामग्री के साथ ही छुआ जाना चाहिए.
  3. आगे कदम के लिए डॉन बाँझ दस्ताने क्योंकि आप अगले तैयार शल्य साइट के साथ सौदा होगा.
  4. एक बाँझ कपड़ा रखें ताकि गवाक्षीकरण शल्य साइट को उजागर करता है.

4. सर्जिकल विंडो बनाना

  1. # 10 स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, खोपड़ी के अनुदैर्ध्य midline के साथ एक चीरा (लंबाई में लगभग 2 सेमी). चीरा आँखों की लाइन के पीछे शुरू कर देना चाहिए. गैर प्रमुख हाथ के अंगूठे और तर्जनी के साथ, तनाव चीरा की दिशा को सीधा खोपड़ी पकड़.
  2. शल्य साइट का उपयोग कर बाँझ कपास के सुझावों के किनारों के लिए खोपड़ी सतह overlying प्रावरणी खींच. खोपड़ी स्पष्ट ताकि यह देखा जा सकता है यह कुछ बल ले जाएगा.
  3. चार घुमावदार, बाँझ hemostats उपयोग करने के लिए एक शल्य खिड़की बनाने के लिए. Ea पर क्लैंप प्रावरणी (नहीं त्वचा)चीरा की पूर्वकाल और कूल्हों पहलुओं की चर्चा की ओर और फिर पशु के साथ clamps के रखना, जिससे खुला चीरा खींच और पूरी तरह से खोपड़ी को उजागर.

5. खोपड़ी leveling और पायलट छेद बनाना

  1. शीर्षस्थान, पूर्वकाल बिंदु जहां खोपड़ी के तीन मुख्य प्लेट को पूरा करने के लिए, के रूप में चित्र 2 में दर्शाया का पता लगाएँ. जलसेक सुई ले जाएँ तो सुई टिप सिर्फ पर्वबिन्दु पर खोपड़ी छू. नोट: पृष्ठीय उदर समन्वय चित्रा 3 कैसे एक Stoelting stereotaxic डिवाइस पर निर्देशांक पढ़ने के लिए दर्शाता है. ध्यान दें, इस बिंदु पर, दस्ताने नहीं रह रहे हैं बाँझ और स्पर्श सीधे नहीं होना चाहिए बाँझ सर्जरी साइट. नोट: nonsterile stereotaxic डिवाइस को छूने के बाद, सर्जन नहीं रह गया है बाँझ और शल्य साइट और न ही उपकरण है जो शल्य साइट को छूने के कुछ हिस्सों का स्पर्श नहीं करना चाहिए.
  2. Depicte रूप लैम्ब्डा, पीछे बिंदु जहां खोपड़ी के तीन मुख्य प्लेटों को पूरा, पता लगाएँचित्रा 2 में घ. जलसेक सुई थोड़ा बढ़ा है और यह सीधे लैम्ब्डा के लिए कदम वापस. लोअर सुई जब तक यह सिर्फ लैम्ब्डा पर खोपड़ी छू. पृष्ठीय - उदर समन्वय पढ़ें. यदि खोपड़ी स्तर है, यह शीर्षस्थान पढ़ने के 0.1 मिमी के भीतर हो जाएगा. अगर यह आगे से बंद है, सुई को स्थानांतरित (रास्ते से बाहर), नाक बार ढीला, या तो बढ़ाने या कम काटने बार मंच, जो सिर के अंत में बहुत अधिक है पर निर्भर करता है, और फिर पुन: उपाय.
  3. शीर्षस्थान पर सुई जलसेक ले जाएँ और पूर्वकाल पीछे और औसत दर्जे का पार्श्व निर्देशांक रिकॉर्ड. गणना के लिए जहां सुई 12 एटलस मस्तिष्क के अनुसार ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र के निर्देशांक के आधार पर स्थानांतरित किया जाना चाहिए. BLA के लिए पूर्वकाल - पीछे समन्वय से 2.8 मिमी घटाना और या तो जोड़ने या कि क्या आप के लिए छोड़ दिया है या सही लक्षित करना चाहते हैं पर निर्भर करता है औसत दर्जे का पार्श्व समन्वय से 5.1 मिमी / घटाना. गणना की स्थिति जलसेक सुई ले जाएँ.
  4. Nee घुमाओरास्ते से बाहर DLE, देखभाल करने के लिए जहां यह स्थित था का ट्रैक रखने के लिए और फिर कि एक बाँझ दंत ड्रिल बिट संलग्न के साथ एक Dremel moto के उपकरण का उपयोग स्थान में व्यास में लगभग 2 मिमी छेद ड्रिल. जब ड्रिल खोपड़ी के माध्यम से टूट जाता है के रूप में ध्यान से ड्रिल, यह नीचे खींच देते हैं, संभवतः ड्यूरा और मस्तिष्क नीचे के ऊतकों को नुकसान पहुँचाए. यह विस्तार करने के लिए छेद बीस जिस्ता कागज.
  5. एक बाँझ कपास झाड़ू से किसी भी रक्त को अवशोषित.

6. Neurotoxin का अर्क

  1. सुई की स्थिति में वापस घुमाओ. सुई से कम जब तक यह मस्तिष्क की सतह को छू लेती है. पृष्ठीय - उदर समन्वय रिकार्ड. यह ड्यूरा के स्तर पर है. उचित मूल्य घटाना करने के लिए ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र तक पहुँचने के लिए. Basolateral प्रमस्तिष्कखंड के लिए, 6.7 मिमी घटाना.
  2. जलसेक सुई गणना धीरे धीरे स्तर कम है. तो इसे बढ़ाने वापस ऊपर खोपड़ी अच्छी तरह से ऊपर. हैमिल्टन सिरिंज सफाई तार का उपयोग जलसेक सुई की नोक unclog करने के लिए, सावधान नहीं टी करने के लिए किया जा रहाआहा के अंत तार कि जलसेक गैर बाँझ दस्ताने के साथ सुई के साथ संपर्क में आता है.
  3. > Μl / 5 मिनट में पंप चलाने के लिए और सुनिश्चित करें कि आप तरल पदार्थ की एक मनका जलसेक सुई से बाहर आ देखना. यदि नहीं, तार के साथ unclog और फिर कोशिश करें.
  4. वांछित / पृष्ठीय उदर स्तर धीरे धीरे कम जलसेक सुई.
  5. जलसेक पंप पर दर 0.1 μl / मिनट के लिए सेट और जलसेक शुरू. 2 मिनट के लिए पानी में डालना.
  6. एक बार जान फूंकना शुरू कर दिया है, एक काला मार्कर के साथ टयूबिंग में हवाई बुलबुले के दोनों सिरों को चिह्नित. यदि दोनों सिरों कदम नहीं है, अपने सुई भरा हुआ है. जलसेक बंद करो, सुई उठाना, तार के साथ unclog, एक उच्च प्रवाह की दर के साथ प्रवाह की जांच करने के लिए, फिर से कम सुई और फिर कोशिश करें.
  7. एक बार जलसेक पूरा हो गया है, पंप को रोकने और NMDA के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए सुई की नोक से दूर फैलाना.
  8. सुई 0.5 मिमी उठाएँ, और 1 मिनट के लिए फिर से मन में बैठाना. सुई की नोक से दूर फैलाना NMDA के लिए 2.5 मिनट रुको. यह अतिरिक्त जलसेक वहLPS सुनिश्चित BLA के जलसेक द्वारा कवर किया जाता है. क्या यह अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए आवश्यक है प्रयोगात्मक निर्धारित करना चाहिए.
  9. धीरे धीरे मस्तिष्क की सुई उठाएँ और रास्ते से बाहर stereotaxic हाथ स्विंग.

7. चीरा बंद

  1. डॉन नया बाँझ के लिए चीरा बंद दस्ताने.
  2. दूर खोपड़ी पर बाँझ कपास युक्तियाँ के साथ किसी भी अतिरिक्त रक्त पोछो और प्रावरणी से clamps दूर.
  3. लंदन संदंश का प्रयोग, चीरा के दो पक्षों के साथ धक्का. त्वचा की भीतरी किनारों को पूरा करना चाहिए और त्वचा की बाहरी किनारे करने के लिए चीरा में कर्ल की अनुमति नहीं दी जाना चाहिए. जबकि चीरा दबाने बंद, घाव क्लिप को लागू करने के लिए फलाव मजबूती से बंद है. चीरा की लंबाई के साथ एक साथ त्वचा और प्रधान धक्का जारी रखें. यह आमतौर पर 3-5 घाव क्लिप लेता है.
  4. सभी घाव क्लिप को रखने के बाद, संदंश का उपयोग करने के लिए स्टेपल फिर चुटकी, यकीन है कि वे सुरक्षित हैं. और अधिक सुरक्षित टीवह क्लिप है, कम होने की संभावना एक चूहे उन्हें बाहर खींच से पहले चीरा चंगा किया है.
  5. 10% povidone आयोडीन समाधान और अपने घर पिंजरे और निगरानी के लिए चूहा वापस जब तक गतिशीलता बहाल है (आमतौर पर 1-2 घंटे के संज्ञाहरण के बाद, कुल सर्जरी प्रेरण से बंद करने के लिए 30-45 मिनट समय) के साथ stapled चीरा झाड़ू. इस बिंदु पर, चूहे कॉलोनी कमरे को लौट जा सकता है. एक सप्ताह के बाद, isoflurane संज्ञाहरण के तहत एक स्टेपल हटानेवाला उपकरण के साथ स्टेपल हटा दें.
  6. एक गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ का उपयोग करने के लिए अगले चूहे पर प्रयोग करने से पहले सभी उपकरणों की टिप सतहों बाँझ. उपकरण अब से 15 सेकंड के लिए मोती में डूब जाना चाहिए, या वे भी संभाल करने के लिए गर्म हो सकता है. उपकरण पूरी तरह से पहले एक जानवर पर इस्तेमाल किया ठंडा चाहिए.

8. वसूली

  1. यह संभव है कि चूहों घाव के बाद के दिनों में जब्ती गतिविधि प्रदर्शन करेंगे. मस्तिष्क क्षेत्र पर ऐसे भोजन की खपत या gro के रूप में क्षतिग्रस्त, अन्य व्यवहार निर्भर करता हैoming प्रभावित हो सकता है. यह महत्वपूर्ण है कि जानवरों के लिए सुनिश्चित करें कि वे वसूली के दौरान स्वस्थ रहने के लिए एक दैनिक आधार पर नजर रखी जा. सहायक देखभाल, के रूप में तरल भोजन, उच्च कैलोरी भोजन, या अतिरिक्त पीड़ाशून्यता आवश्यकता हो सकती है. संज्ञाहरण के कारण मृत्यु दर चूहों, आमतौर पर कम से कम 5% की एक कम प्रतिशत में होता है. अन्य कारणों की वजह से मृत्यु दर (संक्रमण, खून बह रहा है) अत्यंत दुर्लभ है. भविष्य के अध्ययन से अपवर्जन के लिए संज्ञाहरण की वसूली के बाद संकट के किसी भी लक्षण के कारण किया जा सकता है, लेकिन बहुत दुर्लभ हैं चित्रा 4 सर्जरी के बाद पहले कुछ दिनों के दौरान वजन घटाने को दर्शाया गया है के रूप में यह उम्मीद की जानी चाहिए. शरीर के वजन के 1 सप्ताह के भीतर की पलटाव चाहिए.

9. प्रतिनिधि परिणाम

NMDA जलसेक के बाद एक सप्ताह या अधिक, घाव देखे जा cresyl बैंगनी counterstain और brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर सकते हैं. दिमाग 0.1M पीबीएस और Froz के में 30% sucrose में बर्फ के ठंडे 4% paraformaldehyde की equilibrated साथ perfused किया जाना चाहिएएन. वे तो 30-60 माइक्रोन में कटा हुआ होना चाहिए, 1:06-1:12 की एक श्रृंखला में और पर एक मानक cresyl बैंगनी counterstain के दौर से गुजर से पहले जेलाटीन लेपित गिलास स्लाइड के लिए मुहिम शुरू की है. घाव एक गंजा हाजिर "या कमी हुई cresyl वायलेट के एक क्षेत्र को घाव के बाद कोशिका मृत्यु के कारण दाग के अनुरूप आंकड़े 5A और बी BLA और सीईए के एक प्रतिनिधि के घाव दिखाते हैं. चाहिए. इस छवि को एक उच्च संकल्प (1200 डीपीआई) स्कैन के साथ एक flatbed स्कैनर का उपयोग कर प्राप्त किया गया था. घाव कल्पना, यह तो एक गलत घाव स्थित किया जा सकता है लक्षित क्षेत्र के आसपास के ऊतक के ज्यादा के माध्यम से वर्गों की एक श्रृंखला counterstain में मदद करता है.

चित्रा 1
आकृति 1. Stereotaxic सेटअप यह आंकड़ा लेबल प्रासंगिक भागों के साथ चूहे stereotaxic से पता चलता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. शीर्षस्थान और चूहा SKU पर लैम्ब्डाकरूँगा इस उदाहरण शीर्षस्थान और लैम्ब्डा स्थानों को दर्शाया गया है. सभी निर्देशांक पर्वबिन्दु करने के लिए रिश्तेदार मापा जाता है. लैम्ब्डा करने के लिए सुनिश्चित करें कि खोपड़ी स्तर है प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. पढ़ना stereotaxic निर्देशांक. यह ड्राइंग एक मानक stereotaxic पढ़ने को दर्शाया गया है. दशमलव स्थान के बाईं ओर करने के लिए अंक प्राप्त करने के लिए, सही पक्ष पर मार्कर का उपयोग करें. लेबल अंक दसियों जगह (1 यानी 10 = 2, = 20) से मेल खाती है. लेबल अंकों के बीच हैश निशान एक यूनिट (1-9) के अनुरूप हैं. शून्य लाइन पूर्णांक क्या stereotax सेट कर दिया जाता है पर इंगित करता है. यहाँ, शून्य लाइन 10 और 11 मार्करों के बीच है, यह दर्शाता है कि पढ़ने के 10 और 11 के बीच है. दशमलव स्थान की सही संख्या का निर्धारण करने के लिए, बाईं ओर मार्कर का उपयोग करें. बाईं तरफ हैश निशान 0-10 प्रत्येक unlabeled एक इकाई से अंतर का प्रतिनिधित्व हैश के साथ गिने जा रहे हैं,उन यह के करने के लिए अगले. जो भी सबसे अच्छा ऊपर सही पर हैश निशान के साथ छोड़ दिया लाइनों पर हैश निशान का समन्वय पढ़ने के पहले दशमलव स्थान को इंगित करता है. यहाँ, छोड़ दिया करने के लिए संख्या 9 सही साइड हैश निशान के साथ सबसे अच्छा ऊपर लाइनों इसी पर हैश निशान तो दशमलव स्थान 9. अंतिम पढ़ने 10.9 मिमी है.

चित्रा 4
चित्रा 4. सर्जरी के बाद वजन में परिवर्तन. इस ग्राफ चूहों जो stereotaxic सर्जरी (n = 17) (SEM के ±) का औसत वजन से पता चलता है या था (n = 6) सर्जरी. 0 दिवस सर्जरी के दिन है. सर्जरी के बाद, चूहों के वजन के 2-3 दिनों के लिए सर्जरी के बाद कम है और फिर 5-6 दिन के आसपास वृद्धि हुई है.

चित्रा 5
चित्रा 5. Excitotoxic घाव एक उदाहरण है.) इस छवि से पता चलता है एक cresyl बैंगनी "गंजा के साथ एक 30 माइक्रोन राज्याभिषेक टुकड़ा पर counterstainbasolateral प्रमस्तिष्कखंड के NMDA घाव से स्थान सफेद तीर घाव रूपरेखा यह मस्तिष्क टुकड़ा जो नहीं). बी केंद्रीय नाभिक प्रमस्तिष्कखंड की एक समान घाव घाव है contralateral पक्ष की तुलना में किया जा सकता है.

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Discussion

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यहाँ प्रस्तुत stereotaxic विधि के NMDA के अर्क के माध्यम से विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों की excitotoxic घाव के लिए अनुमति देता है. बुनियादी stereotaxic तरीकों के लिए एक साइट विशेष तरीके में औषधीय और जैविक एजेंटों की एक किस्म को बढ़ावा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. यह भी मस्तिष्क क्षेत्रों की एक किस्म, 12 एटलस मस्तिष्क में उनके stereotaxic के निर्देशांक द्वारा परिभाषित लक्ष्य के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. चूहों जैसे अन्य प्रजातियों के लिए अनुकूलन समान छोटे जानवरों के लिए बनाया गया उपकरण के साथ बनाया जा सकता है. वर्तमान प्रक्रियाओं 3 मो पुराने वयस्क चूहों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, लेकिन वे उम्र की एक किस्म के लिए किशोरों से पुराने वयस्कों के माध्यम से इस्तेमाल किया जा सकता है. अगर छोटे जानवरों है कि एक मानक मस्तिष्क एटलस में प्रतिनिधित्व नहीं किया जा सकता है के साथ काम कर रहे है, एक रंगीन डाई infusing खोजपूर्ण सर्जरी empirically का उचित सुई स्थान निर्धारित करने में मदद कर सकते हैं.

जांचकर्ताओं जो प्रवेशनी के stereotaxic सर्जरी, Geiger एट अल का उपयोग लंबी अवधि के आरोपण की आवश्यकता के लिए 13. पीउपयुक्त चीरा बंद और aftercare निर्देश के साथ एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल बुरा मानना. यदि छोटे मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने की इच्छा है, तथापि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वर्तमान प्रोटोकॉल सिर और stereotaxic डिवाइस में प्लेसमेंट leveling के लिए और अधिक सटीक तरीके प्रदान करता है. वर्तमान प्रोटोकॉल भी चीरा clamping के तरीकों कि एक व्यापक शल्य खिड़की के लिए अनुमति देते हैं अक्सर, जब आवश्यक BLA के रूप में पार्श्व संरचनाओं को लक्षित प्रदान करता है.

सर्जरी के बाद, वजन घटाने के लिए पशुओं को नियंत्रित करने की तुलना में सामान्य है और उम्मीद है चित्रा 4 वयस्क नर चूहों कि एक ही पलटन से unmanipulated नियंत्रण बनाम सर्जरी के वजन में परिवर्तन को दर्शाता है. चूहों वजन घटाने सर्जरी के बाद पहले 2-3 दिनों के लिए दिखाने के लिए और फिर वजन 5-6 दिनों के बाद फिर से हासिल करने के लिए शुरू की उम्मीद की जा सकती है. अधिक लंबे समय तक वजन घटाने के संक्रमण या अन्य समस्याओं का संकेत मिलता है.

कभी कभी, एक चूहे अपने घाव क्लिप को हटा देगा. यदि चीरा जके रूप में चंगा, यह एक समस्या मौजूद नहीं है. यदि चीरा और चंगा नहीं खुला है, घाव क्लिप या तो एक अन्य क्लिप के साथ या sutures, जो दोनों के isoflurane संज्ञाहरण के तहत किया जा सकता है के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. पीने के पानी में (80-96 मिलीग्राम Trimethoprim सल्फा / किग्रा / दिन, 240 मिलीग्राम / 5 मिलीलीटर पानी) अगले 5 दिनों के लिए एंटीबायोटिक दवाओं सहित भी संक्रमण को रोकने के लिए उचित हो सकता है अगर घाव पर्यावरण के लिए खुला था.

शायद इस प्रोटोकॉल का सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू कान सलाखों के स्थान है. डाई तत्काल बलिदान के बाद जलसेक के साथ प्रायोगिक सर्जरी के लिए दोनों कान बार प्लेसमेंट और चयनित stereotaxic निर्देशांक की सटीकता की जाँच करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं. यदि मस्तिष्क को लक्षित क्षेत्र midline में है, हम मस्तिष्क के दोनों ओर से एक angled दृष्टिकोण का उपयोग कर के रूप में midline में बड़ी रक्त वाहिकाओं के एक प्रत्यक्ष midline दृष्टिकोण रोका जा सकता है की सलाह देते हैं.

यहां तक ​​कि जब के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रदर्शन संभव, stereotaxic है सुरgery अभी भी दर्दनाशक दवाओं और anesthetics करने के लिए भारी निवेश, ऊतकों को नुकसान और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जरूरत पर जोर देता है. इन सभी कारकों प्रयोगात्मक परिणाम, विशेष रूप से शल्य चिकित्सा के समय के करीब प्रभावित कर सकता है. सर्जरी के पक्ष प्रभाव प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की शुरुआत से पहले पर्याप्त वसूली समय कम से कम एक सप्ताह के लिए अनुमति देता है के द्वारा कम किया जा सकता है. लक्षित आनुवंशिक knockouts के रूप में वैकल्पिक दृष्टिकोण चूहों में संभव हो सकता है लेकिन stereotaxic सर्जरी से कहीं अधिक जटिल हो सकता है हो सकता है.

सारांश में, वर्णित विधि गुजर तंतुओं को नुकसान पहुँचाए बिना मस्तिष्क क्षेत्रों के स्थानीय घाव के लिए अनुमति देता है. यह कई प्रयोजनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और अत्यधिक विश्वसनीय और प्रमाण है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम का समर्थन किया गया था फिर predoctoral फेलोशिप (EDK), NARSAD युवा अन्वेषक पुरस्कार (डी) और NIMH दिमाग (R01MH087495) पुरस्कार (डी) सीआईआरएम.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-Methyl-D-aspartic Acid 98% Fisher Scientific AC32919-0500
Dual Lab Standard Stereotaxic w/45 deg. Ear Bars Stoelting 51653 Alternative vendor: Kopf *note of caution: assure compatibility of stereotaxic accessories if purchasing from multiple vendors
10μl SYR SPECIAL (*/*/*) Hamilton 701SN
Dremel Moto-Tool Stoelting 58600 Alternative vendor: Kopf
Carbide burs, handpiece HP, size 2 Schein Dental 2284578
St–lting 6 Syringe Programmable Pump Stoelting 53140 Alternative vendor: Kopf
Stainless Steel 316 Hypodermic Regular Wall Tubing 30 Gauge .0123" OD x .00625" ID x .003" Wall (infusion needle) Small Parts HTXX-30R-06-05
Intramedic PE 20 tubing (infusion tubing) VWR 63019-025
Reflex Clips, 9mm, non-sterile Kent Scientific Corp. INS500346 Alternative vendor: Fine Science Tools
Reflex Clip Applier for 9mm clips Kent Scientific Corp. 12031-09 Alternative vendor: Fine Science Tools
Curved Hartman hemostat Fine Science Tools 13003-10
London forceps Fine Sceince Tools 11080-02
2% chlorhexidine solution Allivet 30159 Alternative vendor: PetSolutions
10% povidone iodine solution CVS SKU #739575
Hot bead sterilizer Harvard Apparatus 610183

Table 1. Table of specific reagents and equipment.

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References

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वयस्क चूहे में विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों की Excitotoxic घाव के लिए stereotaxic सर्जरी
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Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079, doi:10.3791/4079 (2012).More

Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079, doi:10.3791/4079 (2012).

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