Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Stereotaktischen Chirurgie für Exzitotoxische Läsion Spezifische Hirnareale in der erwachsenen Ratte

doi: 10.3791/4079 Published: July 19, 2012

Summary

Gezielte Abtragung von spezifischen Hirnregionen (en) durch Infusion unter Verwendung eines stereotaktischen Koordinaten Excitotoxin beschrieben. Diese Technik könnte auch für die Infusion von anderen Chemikalien in dem Gehirn der Ratte angepasst werden.

Abstract

Viele Verhaltensfunktion bei Säugern, einschließlich Nagern und Menschen, werden hauptsächlich von diskreten Hirnregionen vermittelt. Eine gängige Methode für anspruchsvolle Funktion der verschiedenen Hirnregionen für das Verhalten oder anderen experimentellen Ergebnissen ist, um eine lokalisierte Ablation von Funktion zu implementieren. Beim Menschen werden Patientenpopulationen mit lokalisierten Hirnläsionen oft für Defizite studiert, in der Hoffnung auf die darunterliegende Funktion der beschädigten Stelle. Bei Nagetieren, kann man experimentell induzieren Läsionen bestimmter Hirnregionen.

Läsion kann auf verschiedene Arten erreicht werden. Elektrolytische Läsionen können lokale Schäden, sondern eine Vielzahl von Zelltypen sowie durchqueren Fasern aus anderen Hirnregionen, die in der Nähe der Läsion zufällig beschädigen. Induzierbarer genetischer Techniken unter Verwendung von Zelltyp-spezifische Promotoren können auch ermöglichen gezieltes Targeting. Diese Techniken sind komplex und nicht immer praktisch abhängig von dem Ziel Hirnregion. Excitotoxischen Läsion mit stereotaktischen Chirurgie hingegen ist einer der zuverlässigsten und praktischen Methoden der Läsion exzitatorischen Neuronen ohne Beschädigung lokalen Gliazellen oder durchqueren Fasern.

Hier stellen wir ein Protokoll für stereotaktische Infusion der Excitotoxin, N-Methyl-D-Aspartat (NMDA), in der basolateralen Amygdala komplex. Mit anatomischen Indikation, wenden wir stereotaktischen Koordinaten, um die Position der Ziel-Hirn-Region zu bestimmen und zu senken einer Injektionsnadel an Ort und Stelle direkt über dem Ziel. Wir haben dann erfüllt unsere Excitotoxin in das Gehirn, was zu exzitotoxische Tod von Neuronen in der Nähe. Während unsere Versuchsperson der Wahl ist eine Ratte, können die gleichen Methoden zu anderen Säugetieren angewandt werden, mit den entsprechenden Einstellungen in Einrichtungen und Koordinaten.

Dieses Verfahren kann auf einer Vielzahl von Hirnregionen verwendet werden, einschließlich der basolateralen Amygdala 1-6, anderen Amygdala Kerne 6, 7, Hippocampus 8, entorhinal Cortex 9 und 10 präfrontalen Kortex. Es kann auch verwendet werden, um biologische Verbindungen, wie virale Vektoren 1, 11 infundieren werden. Die grundlegende stereotaktischen Technik könnte auch für die Implantation von mehr permanente osmotische Pumpen angepasst werden, so dass mehr längerer Exposition zu einer Verbindung von Interesse.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Anästhesie und Analgesie: Dreißig Minuten vor der Narkose, injizieren die Ratte mit 0,05 mg / kg subkutan zur Analgesie Buprenorphin. Initiieren einer Narkose mit 30-40 mg / kg intraperitoneal Natrium-Pentobarbital. An diesem Punkt auch zu injizieren, um respiratorische Insuffizienz Atropin (0,4 mg / kg, subkutan) und Meloxicam weitere Schmerz (2 mg / kg subkutan) zu verhindern. Wenn nach 5 Minuten, ist die Ratte immer noch mobil oder als Reaktion auf Zehen und Zuziehen, geben weitere Dosen von Natrium-Pentobarbital bei 5 mg / kg (intraperitoneal), bis die Ratte ist nicht mehr auf die Schmerzen. Vor der Durchführung des ersten Schnittes injizieren Lidocain (5 mg / kg, intradermal) an der Einschnittstelle zur Lokalanästhesie. Sechs bis acht Stunden nach der ersten Injektion, injizieren die Ratte mit 0,05 mg / kg subkutan zur Analgesie Buprenorphin. Buprenorphin kann alle 6-8 Stunden danach injiziert werden, wenn nötig, auch wenn dies meist nicht erforderlich.

Es ist wichtig zu beachten, dass andere Formen der Anästhesie cein mit exzitotoxische Läsionen stören. Zum Beispiel, obwohl Ketamin ist eine häufig verwendete Form der Anästhesie bei Nagetieren, kann es mit Läsionen mit NMDA-induzierte stören, weil es ein NMDA-Rezeptorantagonist ist. Es ist wichtig, ein Verfahren zum Induzieren Anästhesie, die nicht reduziert Läsionsgröße auszuwählen. Wenn Gas Anästhesie gewünscht wird, können die meisten stereotaktischen Geräten wie den hier beschriebenen unterbringen Gasmaske Adapter.

Hinweis: Materialien werden in der Tabelle der Reagenzien und Ausrüstung beschrieben.

1. Vorbereitung der Pumpe und Stereotax

  1. Füllen Sie eine 10 ul Hamilton-Spritze mit sterilem Wasser und montieren Sie ihn in den Einkaufskorb einer Spritze 6 programmierbare Pumpe. Sichern des Endes des Spritzenkolbens in die geklemmte Halter an der Pumpe.
  2. Prefill PE20-Schlauch mit sterilem Wasser unter Verwendung einer Nadel und 1 ml Spritze gassterilisiert. Schieben des offenen Endes des Schlauches auf der Hamilton-Spritze, wobei PflegeFUL nicht entstehen Luftblasen in dem Rohr.
  3. Einspannen 30ga, flach geschnittenen, 1 Zoll Infusionsnadel Ende des Schlauchs an den Arm eines stereotaktischen Vorrichtung unter Verwendung eines Barrel-Stil-Elektrode Manipulators. Legen Sie die Infusionsnadel zwischen der Klemme und der gerillten Barrel. Sichern der Klammer um ein Stück des Schlauchs mit Metallnadel darin zu vermeiden Abflachen des Schlauchs und die Beschränkung Fluidströmung.
  4. Stellen Sie die Pumpe zu Rate> 5 ml / min und schalten Sie die Pumpe. Ein Wulst aus Wasser sollte an der Spitze der Infusionsnadel angezeigt. Prüfen Sie die Länge des Schlauchs und seine Gelenke, um sicherzustellen, keine Lecks vorhanden sind.
  5. Wischen Sie das Wasser Wulst mit einem sterilen Tupfer und die Pumpe auf, sich zurückzuziehen. Ziehen Sie einen 2 ul Luftblase. Der obere Teil der Blase sichtbar sein soll in dem Schlauch.
  6. Tauchen der Infusionsnadel Spitze in einer 20 mg / ml Lösung von NMDA in sterilem 0,1 M PBS und zurückzuziehen 4-5 ul. Eine Luftblase sichtbar sein zwischen dem sterilen Wasser und der NMDA-Lösungin der Spitze. Es ist wichtig anzumerken, dass NMDA ein starkes Nervengift ist und Vorsicht ist bei der Herstellung und Handhabung dieser Lösung verwendet werden. Handschuhe und Schutzbrille sind zu jeder Zeit beraten.

2. Montieren Sie die Ratte in der stereotaktischen Gerät

  1. Abbildung 1 zeigt die grundlegenden Teile der stereotaktischen Gerät. Nach dem Rasieren der Ratte den Kopf von der Linie der Augen zu den Ohren, laden der Ratte Frontzähne über die Biss-Bar, mit der Ratte der Körper ruht auf einem Heizkissen auf Medium gesetzt. Die Zunge sollte unter dem Stich-Bar hängen, mit dem Unterkiefer. Falls vorhanden, wäre ein Temperatur-Feedback Heizkissen vorzuziehen sein. Die Überwachung Rektaltemperatur wäre auch ideal.
  2. Halten der Ratte Hals mit Daumen und Zeigefinger, bewegen Sie den rechten horizontalen Gehörgang auf dem rechten Ohr bar. Die Bar sollte das Gefühl, es auf eine feste Stelle ruht, nicht wie es sinkt tief in den Kopf. Halten Sie die rechte Seite der Kopf ruhig, schieben Sie den linken Ohrbar in der Ratte linken horizontalen Gehörgang. Es sollte das Gefühl, es auf einem soliden Platz ruht. Die Ohrmuscheln aussehen sollte symmetrisch und sollte angezeigt werden, zu lügen am Ohr Bars flach. Nach oben Abfackeln von Ohrmuscheln zeigt falsche Platzierung der Ohr Bars. Der Kopf sollte nicht als Reaktion auf Druck am Hals wackeln.
  3. Schrauben Sie die Nase bar. Seien Sie sanft. Die Knochen in der Nase sind empfindlich und die Nase Bar muss nicht dicht sein. Prüfen Sie, ob die Ratte noch bevor betäubt.

3. Vorbereiten der Rat für Chirurgie

  1. Mit einem sterilen Tupfer leicht mit einer geringen Menge der veterinärmedizinischen ophthalmisches Schmiermittel Salbe in jedem der Mausaugen um sie vor dem Austrocknen und Schmutz zu schützen.
  2. Konzentrisch von der geplanten Inzisionsstelle an den Rand des dem rasierten Bereich, wischen der Ratte Kopfhaut mit 2% Chlorhexidin-Lösung 70% Ethanol gefolgt dreimal. Chlorhexidin Peeling können ebenfalls verwendet, wenn mehr wirksame Desinfektionsmittel erwünscht ist.Beenden Sie durch Abwischen mit 10% Povidon-Iod-Lösung. Die vorbereitete Kopfhaut ist jetzt steril und sollte nur mit sterilen Materialien berührt werden.
  3. Don sterile Handschuhe für weitere Schritte, weil Sie mit dem vorbereiteten Operationsstelle nächste wird umzugehen.
  4. Legen Sie eine sterile Abdeckung, so dass die Fensterung der chirurgischen Stelle verfügbar macht.

4. Erstellen des OP-Fenster

  1. Mit einem Skalpell Nr. 10, einen Einschnitt (ca. 2 cm lang) entlang der Längs-Mittellinie der Kopfhaut. Der Schnitt sollte beginnen hinter der Linie der Augen. Mit dem Daumen und Zeigefinger der nicht-dominanten Hand halten die Kopfhaut in Spannung senkrecht zur Richtung des Einschnitts.
  2. Ziehen Sie die Faszie über den Schädel Oberfläche an den Kanten der chirurgischen Stelle mit sterilen Baumwoll-Tipps. Es wird einige Kraft, um den Schädel zu löschen, damit sie angezeigt werden kann.
  3. Verwenden Sie vier gebogenen, steril Hämostaten, um eine chirurgische Fenster zu erstellen. Clamp-Faszie (NICHT Haut) auf EAch Seite der vorderen und hinteren Aspekte des Einschnitts und dann lag die Klammern neben dem Tier aus, wodurch sie den Einschnitt offen und vollständig Aussetzen des Schädels.

5. Ausrichten der Schädel und Erstellen der Vorbohrung

  1. Suchen Bregma, der vordere Punkt, wo die drei Platten des Schädels, wie in 2 dargestellt. Bewegen Sie die Infusionsnadel so die Nadelspitze gerade berührt den Schädel an Bregma. Beachten Sie die dorsal-ventrale Koordinatensystem. Abbildung 3 zeigt, wie Koordinaten auf einer Stoelting stereotaktischen Gerät lesen können. Hinweis an dieser Stelle, sind Handschuhe nicht mehr steril und sollten nicht berührt werden sterile Operation direkt vor Ort. Hinweis: Nach Berühren des unsterilen stereotaktischen Gerät, ist der Chirurg nicht mehr steril und sollten nicht berührt werden Operationsstelle noch Teile der Einrichtung, der das Operationsfeld berühren wird.
  2. Suchen Lambda, der hintere Punkt, wo die drei wichtigsten Platten des Schädels gerecht zu werden, als depicted in 2. Heben Sie die Infusionsnadel leicht und bewegen Sie ihn sofort wieder auf Lambda. Senken Sie die Nadel bis sie berührt nur den Schädel bei Lambda. Lesen Sie die dorsal-ventrale Koordinatensystem. Wenn der Schädel ist flach, wird sie innerhalb von 0,1 mm des Bregma Lektüre sein. Wenn es weiter geht als das ist, bewegen Sie die Nadel nach oben (aus dem Weg), lösen Sie die Nase bar, entweder anheben oder absenken Beißwulst Plattform, je nachdem, welches Ende des Kopfes ist zu hoch, und dann noch einmal nachgemessen werden.
  3. Bewegen Sie die Infusionsnadel über Bregma und notieren Sie die anterior-posterior und medial-lateralen Koordinaten. Berechnen, wo die Nadel basierend auf den Koordinaten des Gehirns Bereich von Interesse gemäß einer Hirnatlas 12 bewegt werden muss. Für die BLA, subtrahieren 2,8 mm von der Vorwärts-Rückwärts-Koordinate und entweder addieren oder subtrahieren 5,1 mm nach / von der medial-lateralen Koordinate je nachdem, ob Sie wünschen, um die nach links oder rechts zielen. Bewegen der Infusionsnadel in die berechnete Position.
  4. Schwenken Sie die needle aus dem Weg, wobei darauf zu verfolgen, wo es sich befand halten und dann ein Loch bohren, ca. 2 mm Durchmesser an dieser Stelle mit einem Dremel Moto-Tool mit einer sterilen zahnärztlichen Bohrer befestigt. Bohren Sie sorgfältig, wie wenn der Bohrer die Schädeldecke durchstößt, wird er dazu neigen, nach unten ziehen, möglicherweise eine Beschädigung der Dura und Hirngewebe darunter. Nachreiben Loch, um es zu vergrößern.
  5. Sie nehmen selbst Blut mit einem sterilen Wattestäbchen.

6. Die Infusion von Neurotoxin

  1. Schwenken Sie die Nadel wieder in Position. Senken Sie die Nadel bis sie die Oberfläche des Gehirns berührt. Notieren Sie sich die dorsal-ventrale Koordinatensystem. Dies ist die Ebene von Dura. Subtrahieren Sie den entsprechenden Wert, um das Gehirn Region von Interesse zu erreichen. Für den basolateralen Amygdala, subtrahieren 6,7 mm.
  2. Senken Sie die Infusionsnadel auf die berechnete Niveau langsam. Dann heben sie wieder auf, deutlich über dem Schädel. Verwenden Sie eine Hamilton-Spritze Reinigung Draht an die Spitze der Infusionsnadel unclog, ohne sie zu tSchmerzempfinden das Ende des Drahtes, der in Kontakt mit der Infusionsnadel mit nicht-sterile Handschuhe kommt.
  3. Führen Sie die Pumpe bei> 5 ml / min und stellen Sie sicher, Sie sehen einen Wulst von Flüssigkeit aus der Infusionsnadel kommen. Wenn nicht, mit dem Draht befreien und erneut versuchen.
  4. Senken Sie die Infusionsnadel in die gewünschte dorsal / ventral Niveau langsam.
  5. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf der Infusionspumpe bis 0,1 ml / min und starten Sie die Infusion. Die Infusion für 2 min.
  6. Sobald die Infusion gestartet wurde, markieren die beiden Enden der Luftblase im Schlauch mit einem schwarzen Marker. Wenn beide Enden nicht bewegen, wird die Nadel verstopft. Stoppen Sie die Infusion, heben Sie die Nadel, unclog mit dem Draht, für den Durchfluss mit einem hohen Durchsatz zu überprüfen, neu zu senken und die Nadel erneut versuchen.
  7. Sobald die Infusion beendet ist, stoppen Sie die Pumpe ein und warten 5 Minuten für den NMDA-zu diffundieren weg von der Nadelspitze.
  8. Heben Sie die Nadel 0,5 mm, und ziehen erneut für 1 min. Warten 2,5 min für den NMDA-zu diffundieren von der Nadelspitze. Diese zusätzliche Infusion erLPS sicherzustellen, dass alle von der BLA durch die Infusion abgedeckt wird. Ob dies für die anderen Hirnregionen müssen experimentell bestimmt.
  9. Heben Sie die Nadel aus dem Gehirn langsam und schwingen Sie den stereotaktischen Arm aus dem Weg.

7. Das Schließen der Inzision

  1. Don neue sterile Handschuhe, um den Schnitt zu schließen.
  2. Wischen Sie überschüssiges Blut auf dem Schädel mit steriler Baumwolle-Tipps und entfernen Sie die Klemmen von der Faszie.
  3. Mit Hilfe einer Pinzette London, drücken Sie die beiden Seiten des Schnittes zusammen. Die inneren Ränder der Haut erfüllen sollten und die Außenkante der Haut sollten nicht gestattet, in den Einschnitt rollen werden. Halten Sie den Einschnitt geschlossen, gelten Wundklammern, um den Vorsprung fest zu schließen. Fortfahren, um die Haut zusammen und heften sich entlang der Länge des Einschnitts zu drücken. Dies dauert normalerweise 3-5 Wundklammern.
  4. Nach dem Platzieren alle Wundklammern, verwenden Sie die Zange, um die Klammern wieder kneifen, so dass sie sicher sind. Je sicherer ter Clips, desto weniger wahrscheinlich eine Ratte ziehen Sie sie heraus, bevor der Schnitt verheilt ist.
  5. Swab der geheftete Schnitt mit 10% Povidon-Jod-Lösung und gibt die Ratte auf seinem eigenen Käfig und Monitor, bis die Mobilität wieder hergestellt ist (in der Regel 1-2 Stunden nach der Anästhesie, Chirurgie insgesamt Induktion von Zeit zu Schließung als 30-45 min). An diesem Punkt kann die Ratte in die Kolonie Raum wieder zugeführt werden. Nach einer Woche entfernen Heftklammern mit einer Heftklammer-Entferner Tool unter Isofluran-Narkose.
  6. Verwenden Sie eine heiße Perle Sterilisator, um die Spitze Oberflächen aller Instrumente vor Gebrauch auf der nächsten Ratte zu sterilisieren. Die Instrumente sollten in den Perlen für nicht länger als 15 Sekunden getaucht werden, oder sie können zu heiß werden zu handhaben. Die Instrumente sollten vollständig abgekühlt sein, bevor an einem anderen Tier verwendet.

8. Erholung

  1. Es ist möglich, dass Ratten wird epileptischer Aktivität in den Tagen nach der Läsion zeigen. Je nach Hirnregion beschädigt, andere Verhaltensweisen wie Nahrungsaufnahme oder GROoming können betroffen sein. Es ist wichtig, dass die Tiere auf einer täglichen Basis, um sicherzustellen, dass sie gesund bleiben während der Wiederherstellung überwacht werden. Unterstützende Maßnahmen, wie flüssige Nahrung, kalorienreiche Nahrung oder zusätzliche Analgesie erforderlich sein kann. Die Mortalität durch Anästhesie tritt in einem kleinen Anteil von Ratten, in der Regel weniger als 5%. Die Sterblichkeit durch andere Ursachen (Infektionen, Blutungen) ist extrem selten. Jegliche Anzeichen von Leiden nach der Wiederherstellung der Anästhesie kann für den Ausschluss von zukünftigen Studien werden dazu führen, sind aber extrem selten. Abbildung 4 zeigt den Gewichtsverlust während der ersten Tage nach der Operation, wie es zu erwarten wäre. Das Körpergewicht sollte innerhalb von 1 Woche erholen.

9. Repräsentative Ergebnisse

Eine Woche oder länger nach NMDA-Infusion kann die Läsion wird über einen Kresyl-violett Gegenfärbung und Hellfeldmikroskopie. Gehirne sollte mit eiskaltem 4% Paraformaldehyd, äquilibriert in 30% Saccharose in 0,1 M PBS und gefr perfundiert werdenen. Sie sind dann bei 30-60 um geschnitten zu werden, in einer Reihe von 1:6 bis 1:12 und montiert auf mit Gelatine beschichteten Objektträger bevor sie einer Standard-Cresylviolett Gegenfärbung. Die Läsion sollte zu einer "Glatze" oder einer Fläche von verringerten Kresylviolett Fleck aufgrund Zelltod nach Läsion entsprechen. 5A und B zeigen einen repräsentativen Läsion des BLA und CEA. Dieses Bild wurde mit einem Flachbettscanner mit einer hochauflösenden Scan (1200 dpi). Um die Läsion zu visualisieren, hilft es, eine Reihe von Schnitten durch einen Großteil der Gewebe rund um das Zielgebiet so ein verlegter Läsion gefunden werden kann Gegenfärbung.

1
Abbildung 1. Stereotaktische Setup. Diese Abbildung zeigt die Ratte mit stereotaktischen relevanten Teile beschriftet.

2
Abbildung 2. Bregma und Lambda an der Ratte skull. Diese Abbildung zeigt die Standorte der Bregma und Lambda. Alle Koordinaten werden relativ zum Bregma gemessen. Lambda wird verwendet, um sicherzustellen, daß der Schädel Pegel ist.

Abbildung 3
Abbildung 3. Lesen stereotaktischen Koordinaten. Diese Zeichnung zeigt einen Standard-stereotaktischen Lesen. Um die Ziffern nach links von der Dezimalstelle zu erhalten, verwenden Sie die Markierungen auf der rechten Seite. Die markierte Stelle entspricht der Zehnerstelle (dh 1 = 10, 2 = 20). Die Striche zwischen den markierten Stellen auf die einzelnen Einheiten (1-9) entsprechen. Die Null-Linie zeigt an, was die ganze stereotax eingestellt ist. Hier ist die Null-Linie zwischen dem Marker 10 und 11, was anzeigt, dass der Messwert zwischen 10 und 11 ist. Um die Zahlen auf der rechten Seite von der Dezimalstelle zu bestimmen, verwenden Sie die Markierungen auf der linken Seite. Die Striche auf der linken Seite werden von 0 bis 10 nummeriert, wobei jede unmarkierte Hash repräsentiert eine Einheit Unterschied ausdiejenigen daneben. Unabhängig von der Hash-Markierungen auf der linken Linien bis am besten mit den Hash-Zeichen auf der rechten Seite zeigt die erste Dezimalstelle des Koordinatensystems Lesen. Hier wird der Hash-Symbol auf der linken Seite entsprechend Nummer 9 Zeilen am besten mit der rechten Seite Hash-Zeichen, so dass die Dezimalstelle ist 9. Die abschließende Lesung ist 10,9 mm.

Abbildung 4
Abbildung 4. Gewichtsveränderung nach der Operation. Diese Grafik zeigt die durchschnittliche (± SEM) Gewicht der Ratten, die stereotaktische Operation unterzogen (n = 17) oder hatten keine Operation (n = 6). Tag 0 ist der Tag der Operation. Nach der Operation wird das Gewicht der Ratten für 2-3 Tage nach der Operation verringert und dann erhöht um Tag 5-6.

Abbildung 5
Abbildung 5. Exzitotoxische Läsion Beispiel. A) Dieses Bild zeigt ein Kresylviolett auf einem 30 pm koronare Schicht Gegenfärbung mit der "Glatzespot "von NMDA-Läsion der basolateralen Amygdala. Die weißen Pfeile skizzieren die Läsion. Es auf der kontralateralen Seite des Gehirns Scheibe, die keine Läsion. B) Eine ähnliche Läsion des zentralen Kern der Amygdala hat verglichen werden kann.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Die stereotaktische hier vorgestellte Methode ermöglicht exzitotoxische Läsion von bestimmten Hirnarealen durch Infusion von NMDA. Die grundlegenden stereotaktischen Verfahren können adaptiert werden, um eine Vielzahl von pharmakologischen und biologischer Agenzien in einer ortsspezifischen Weise durchdringen werden. Es kann auch dazu ausgelegt, eine Vielzahl von Bereichen des Gehirns, die durch ihre Koordinaten in einem stereotaktischen Hirnatlas 12 definiert abzuzielen. Eine Anpassung an andere Arten, wie Mäusen mit ähnlichen Anlagen, die kleinere Tiere aufgebaut wurden. Die vorliegenden Verfahren sind für 3 Mo alt erwachsenen Ratten optimiert, aber sie konnten für eine Vielzahl von Alters von Jugendlichen werden durch ältere Erwachsene verwendet. Wenn die Arbeit mit jüngeren Tieren, die nicht in einem Standard-Gehirn-Atlas dargestellt werden kann, können explorativen Operationen Infusion einer bunten Farbstoff helfen, den richtigen Sitz der Nadel empirisch.

Für Forscher, langfristige Implantation einer Kanüle mit stereotaktischen Chirurgie, Geiger et al erfordern. S. 13übel eine alternative Protokoll mit entsprechenden Einschnitt Stilllegung und Nachsorge Anweisungen. Wenn Targeting kleineres Gehirn Regionen gewünscht wird, jedoch ist anzumerken, dass der vorliegende Protokoll präzisere Methoden zur Platzierung Kopf und Nivellierung in der stereotaktischen Gerät bietet. Das vorliegende Protokoll bietet auch Einschnitt Einspannen Methoden, die für eine breitere chirurgische Fenster erlauben, oft notwendig, wenn Targeting laterale Strukturen wie der BLA.

Nach der Operation, Gewichtsverlust im Vergleich zu Kontrolltieren ist normal und erwartet. Abbildung 4 zeigt die Änderung des Gewichts von erwachsenen männlichen Ratten, die Operation gegen unmanipulierten Kontrollen aus der gleichen Kohorte erhielten. Ratten zu erwarten, dass Gewichtsverlust für die ersten 2-3 Tage nach der Operation zeigen, und dann beginnen, wieder an Gewicht gewinnen werden nach 5-6 Tagen. Länger andauernde Gewichtsabnahme könnten darauf hinweisen, Infektion oder andere Probleme.

Gelegentlich wird eine Ratte zu entfernen seine Wunde Clips. Wenn der Einschnitt hals geheilt, bedeutet dies nicht ein Problem darstellen. Wenn der Einschnitt nicht geheilt ist und geöffnet ist, muss die Wundklammer entweder mit einem anderen Clip oder mit Nähten, die beide unter Isofluran-Anästhesie durchgeführt werden kann ersetzt werden. Einschließlich Antibiotika (80-96 mg Trimethoprim Sulfa / kg / Tag, 240 mg / 5 ml Wasser) in das Trinkwasser für die nächsten 5 Tage kann auch ratsam sein, eine Infektion zu verhindern, wenn die Wunde war offen für die Umwelt.

Vielleicht der schwierigste Aspekt dieses Protokolls ist die Platzierung der Ohr Bars. Experimentelle Chirurgie mit Farbstoff Infusion durch unmittelbare Opfer gefolgt werden empfohlen, um die Genauigkeit der beide Ohr bar Platzierung und den ausgewählten stereotaktischen Koordinaten überprüfen. Wenn das Gehirn Region ins Visier genommen werden ist in der Mittellinie, empfehlen wir die Verwendung eines abgewinkelten Ansatz von beiden Seiten des Gehirns, wie große Blutgefäße in der Mittellinie einen direkten Zugang in der Mittellinie verhindern kann.

Selbst wenn so gut wie möglich durchgeführt, stereotaktische surGery noch bringt schwere Belastung durch Analgetika und Anästhetika, Gewebeschäden und Immunantwort. Alle diese Faktoren können experimentellen Ergebnisse, insbesondere in der Nähe der Zeitpunkt der Operation. Nebenwirkungen der Chirurgie kann, indem für einen ausreichenden Erholungszeit (mindestens eine Woche) vor Beginn experimentellen Verfahren minimiert werden. Alternative Ansätze wie die gezielte genetische Vorprägung kann bei Mäusen möglich, kann aber sehr viel komplexer als stereotaktischen Chirurgie.

Zusammenfassend ermöglicht das beschriebene Verfahren für die lokalisierte Läsion Hirnregionen ohne Beschädigung vorbei Fasern. Es kann für viele Zwecke angepasst werden und ist äußerst zuverlässig und überprüfbar sein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt ya CIRM Promotionsstipendium (EDK), NARSAD Young Investigator Award (DK) und das NIMH BRAINS Auszeichnung (R01MH087495) (DK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-Methyl-D-aspartic Acid 98% Fisher Scientific AC32919-0500
Dual Lab Standard Stereotaxic w/45 deg. Ear Bars Stoelting 51653 Alternative vendor: Kopf *note of caution: assure compatibility of stereotaxic accessories if purchasing from multiple vendors
10μl SYR SPECIAL (*/*/*) Hamilton 701SN
Dremel Moto-Tool Stoelting 58600 Alternative vendor: Kopf
Carbide burs, handpiece HP, size 2 Schein Dental 2284578
St–lting 6 Syringe Programmable Pump Stoelting 53140 Alternative vendor: Kopf
Stainless Steel 316 Hypodermic Regular Wall Tubing 30 Gauge .0123" OD x .00625" ID x .003" Wall (infusion needle) Small Parts HTXX-30R-06-05
Intramedic PE 20 tubing (infusion tubing) VWR 63019-025
Reflex Clips, 9mm, non-sterile Kent Scientific Corp. INS500346 Alternative vendor: Fine Science Tools
Reflex Clip Applier for 9mm clips Kent Scientific Corp. 12031-09 Alternative vendor: Fine Science Tools
Curved Hartman hemostat Fine Science Tools 13003-10
London forceps Fine Sceince Tools 11080-02
2% chlorhexidine solution Allivet 30159 Alternative vendor: PetSolutions
10% povidone iodine solution CVS SKU #739575
Hot bead sterilizer Harvard Apparatus 610183

Table 1. Table of specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kirby, E. D. Basolateral amygdala regulation of adult hippocampal neurogenesis and fear-related activation of newborn neurons. Mol. Psychiatry. Forthcoming (2011).
  2. Goosens, K. A., Maren, S. Contextual and auditory fear conditioning are mediated by the lateral, basal, and central amygdaloid nuclei in rats. Learn Mem. 8, 148-155 (2001).
  3. Korz, V., Frey, J. U. Bidirectional modulation of hippocampal long-term potentiation under stress and no-stress conditions in basolateral amygdala-lesioned and intact rats. J. Neurosci. 25, 7393-7400 (2005).
  4. Bhatnagar, S., Vining, C., Denski, K. Regulation of chronic stress-induced changes in hypothalamic-pituitary-adrenal activity by basolateral amygdala. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1032, 315-319 (2004).
  5. Ikegaya, Y., Saito, H., Abe, K. Attenuated hippocampal long-term potentiation in basolateral amygdala-lesioned rats. Brain Res. 656, 157-164 (1994).
  6. Ikegaya, Y., Saito, H., Abe, K. The basomedial and basolateral amygdaloid nuclei contribute to the induction of long-term potentiation in the dentate gyrus in vivo. Eur. J. Neurosci. 8, 1833-1839 (1996).
  7. Carter, R. N., Pinnock, S. B., Herbert, J. Does the amygdala modulate adaptation to repeated stress. Neurosciene. 126, 9-19 (2004).
  8. Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Basolateral amygdala lesions block the memory-enhancing effects of glucocorticoid administration in the dorsal hippocampus of rats. Eur. J. Neurosci. 9, 76-83 (1997).
  9. Roesler, R., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Basolateral amgdala lesions block the memory-enhancing effect of 8-Br-cAMP infused into the entorhinal cortex of rats after training. Eur. J. Neurosci. 15, 905-910 (2002).
  10. Roozendaal, B. Glucocorticoid effects on memory consolidation depend on functional interactions between the medial prefrontal cortex and basolateral amygdala. J. Neurosci. 29, 14299-14308 (2009).
  11. Kaufer, D. Restructuring the neuronal stress response with anti-glucocorticoid gene delivery. Nat. Neurosci. 7, 947-953 (2004).
  12. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain: in stereotaxic coordinates-the new coronal set. Elsevier Academic Press. Burlington, MA. (2004).
  13. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).
Stereotaktischen Chirurgie für Exzitotoxische Läsion Spezifische Hirnareale in der erwachsenen Ratte
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079, doi:10.3791/4079 (2012).More

Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079, doi:10.3791/4079 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter