Stereotaktisk kirurgi for excitotoksiske læsion af specifikke områder i hjernen i den voksne rotte

Summary

Målrettet ablation af specifikke område af hjernen (r) ved infusion af en excitotoxin anvendelse stereotaxiske koordinater er beskrevet. Denne teknik kan også tilpasses til infusion af andre kemikalier i rottehjernen.

Abstract

Mange adfærdsmæssige funktioner i pattedyr, herunder gnavere og mennesker, medieres hovedsageligt ved diskrete hjerneområder. En almindelig metode til at skelne funktionen af ​​forskellige hjerneområder for adfærd eller andre eksperimentelle resultater er at gennemføre en lokal ablation af funktion. Hos mennesker er patientpopulationer med lokaliserede hjerneskader ofte undersøgt for underskud, i håb om at afsløre den underliggende funktion af det beskadigede område. Hos gnavere, kan en eksperimentelt inducere læsioner i specifikke hjerneregioner.

Læsion kan opnås på adskillige måder. Elektrolytisk læsioner kan forårsage lokal skade, men vil skade en række celletyper samt gennemløber fibre fra andre områder af hjernen, der tilfældigvis er i nærheden af ​​læsion site. Inducerbare genetiske teknikker, der anvender celletypespecifik promotorer kan også muliggøre stedspecifik målretning. Disse teknikker er kompleks og ikke altid praktisk, afhængigt af mål-hjerneområde. Excitotiltede læsionen ved hjælp af stereotaktisk kirurgi, derimod, er en af ​​de mest pålidelige og praktiske metoder til læsion excitatoriske neuroner uden at beskadige lokale gliaceller eller foregaar fibre.

Her præsenteres en protokol for stereotaktisk infusion af excitotoxin, N-methyl-D-aspartat (NMDA), i den basolaterale amygdala komplekset. Ved hjælp af anatomiske indikationer, vi anvender stereotaksiske koordinater til at bestemme placeringen af ​​vores target hjerne region og sænke en kanyle på plads lige over målet. Vi derefter tilføre vores excitotoxin i hjernen, hvilket resulterer i excitotoksisk død nærliggende neuroner. Mens vores eksperimentelle genstand valg er en rotte, kan de samme fremgangsmåder kan anvendes til andre pattedyr, idet de passende justeringer i udstyr og koordinater.

Denne fremgangsmåde kan anvendes på en række hjerneområder, herunder den basolaterale amygdala ^1-6 anden amygdala kerner ^{6, 7,} hippocampus ^8, ENTorhinal cortex ⁹ og præfrontale cortex ^10. Det kan også anvendes til infusion af biologiske forbindelser, såsom virale vektorer ^{1, 11.} Den grundlæggende stereotaktisk teknik kunne også være indrettet til implantering af flere permanente osmotiske pumper, der tillader mere langvarig udsættelse for en forbindelse af interesse.

Protocol

Anæstesi og analgesi: Tredive minutter før anæstesi injiceres rotten med 0,05 mg / kg subkutant buprenorphin for analgesi. Initiere anæstesi med 30-40 mg / kg intraperitoneal natriumpentobarbital. På dette tidspunkt, injiceres også atropin at forhindre respiratorisk svigt (0,4 mg / kg, subkutant) og meloxicam som yderligere analgetisk (2 mg / kg subkutant). Hvis efter 5 minutter, rotte stadig mobil eller reagerer på tå pinch, giver efterfølgende doser af natriumpentobarbital ved 5 mg / kg (intraperitoneal), indtil rotten ikke reagerer på smerte. Før udførelse af den første indsnit injicere lidocain (5 mg / kg, intradermal) på snitstedet til lokal anæstesi. Seks til otte timer efter første injektion, injicere rotte med 0,05 mg / kg subkutant buprenorphin for analgesi. Buprenorphin kan injiceres hver 6-8 timer derefter om nødvendigt, selv om dette er normalt ikke nødvendigt.

Det er vigtigt at bemærke, at andre former for anæstesi cen interfererer med excitotoksiske læsioner. For eksempel, skønt ketamin er en almindeligt anvendt form for bedøvelse i gnavere kan interferere med læsioner induceret med NMDA, fordi det er en NMDA-receptorantagonist. Det er vigtigt at vælge en fremgangsmåde til inducering af anæstesi, der ikke reducerer læsionsstørrelse. Hvis gassen anæstesi ønskes, kan de fleste stereotaksiske enheder, herunder dem beskrevet her rumme gasmasketyper adaptere.

Bemærk: materialer er beskrevet yderligere i tabel specifikke reagenser og udstyr nedenfor.

1. Udarbejdelse af pumpen og Stereotax

1. Fyld en 10 ul Hamilton-sprøjte med sterilt vand og montere det i caddie af en 6 sprøjte programmerbar pumpe. Fastgøre enden af ​​sprøjtestemplet i fastspændt holderen på pumpen.
2. Prefill gas-steriliseret PE20 rør med sterilt vand ved anvendelse af en nål og 1 ml sprøjte. Skubbe den åbne ende af røret på Hamilton sprøjte, idet plejeful at undgå eventuelle luftbobler i røret.
3. Fastklemme 30ga, flad udskæring, en inch infusionsnålen ende af slangen på armen af ​​en stereotaktisk anordning ved hjælp af en cylinder-stil elektrode manipulator. Indsætte infusionsnålen mellem klemmen og den rillede cylinderen. Fastgøre klemmen over et stykke af slangen indeholdende metalnål inden det at undgå at udflade røret og begrænser fluidstrømmen.
4. Justere pumpehastigheden til> 5 ul / min, og tænd pumpen. En vulst vand komme til syne på spidsen af ​​infusionsnålen. Kontroller længden af ​​slangen og dets samlinger til at sikre, at der ikke er utætheder.
5. Tør vandet perle med en steril vatpind og indstille pumpen til at trække. Træk en 2 gl luftboble. Toppen af ​​boblen skal være synligt i røret.
6. Fordyb infusionen kanylespidsen i en 20 mg / ml opløsning af NMDA i sterilt 0,1 M PBS og trække 4-5 gl. En luftboble skal være synlig mellem sterilt vand og NMDA opløsningeni spidsen. Det er vigtigt at bemærke, at NMDA er en potent neurotoksin og forsigtighed skal anvendes til fremstilling og håndtering af denne opløsning. Handsker og beskyttelsesbriller anbefales, på alle tidspunkter.

2. Monter rotte i stereotaksiske Device

1. Figur 1 viser de grundlæggende dele af stereotaktisk anordning. Efter barbering rottens hoved fra linje øjnene til ørerne, indlæse rottens fortænder over bid bar, med rottens krop hviler på en varmepude indstillet på medium. Tungen skal hænge under bid bar, med underkæben. Hvis det er tilgængeligt, vil en temperatur feedback varmepude være at foretrække. Overvågning rektal temperatur ville også være ideelt.
2. Hold rottens hals med tommel-og pegefinger, flytte højre vandrette øregangen på højre øre bar. Baren skal føles som om den hviler på et solidt sted, ikke som det synker langt ind i hovedet. Hold højre side af hovedet konstant, skubbe venstre ørebar i rottens venstre vandrette øregang. Det skal føles som den hviler på et solidt sted. Den ørerne skal se symmetrisk og skal synes at ligge fladt på øret barer. Opad afbrænding af ørerne viser forkert placering af øret barer. Hovedet skal ikke slingre som reaktion på tryk ved halsen.
3. Skru ned næsen bar. Vær blid. Knoglerne i næsen er sarte og trykbjælke behøver ikke at være tæt. Kontroller, at rotten er stadig bedøvet, før du fortsætter.

3. Klargøring af Rat for Kirurgi

1. Ved hjælp af en steril vatpind, anbring forsigtigt en lille mængde af veterinær oftalmologisk smøre salve i hver af rotte øjne for at beskytte dem mod udtørring og snavs.
2. Koncentrisk fra den planlagte incisionsstedet til kanten af ​​den barberede område, rotte hovedbund tørres med 2% chlorhexidin-opløsning efterfulgt 70% ethanol tre gange. Chlorhexidin scrub kan også anvendes, hvis mere effektivt desinfektionsmiddel er ønsket.Afslut ved aftørring med 10% povidon jodopløsning. Den klargjorte hovedbunden er nu steril og bør kun berøres med sterile materialer.
3. Don sterile handsker til yderligere skridt, fordi du næste vil beskæftige sig med den klargjorte operationsstedet.
4. Placere et sterilt afdækningsstykke, således at fenestration udsætter det kirurgiske sted.

4. Oprettelse af Kirurgisk vinduet

1. Anvendelse af en # 10 skalpel, en indsnit (ca. 2 cm i længde) gør langs den langsgående midterlinje af hovedbunden. Snittet skal starte posterior til den linje i øjnene. Med tommelfingeren og pegefingeren på den ikke-dominerende hånd holder hovedbunden i spænding vinkelret på retningen af ​​snittet.
2. Træk fascia overliggende kraniet overflade til kanterne af det kirurgiske sted ved hjælp af sterile bomuld-spidser. Det vil tage nogen kraft for at rydde kraniet, så det kan ses.
3. Anvender fire buede, sterile hemostats at skabe en kirurgisk vindue. Clamp fascia (ikke hud) på eaCH side af de anteriore og posteriore sider af snittet, og derefter lægge beslag langs dyret, hvorved trække snittet åbne og fuldt eksponere skallen.

5. Udjævne Skull and Oprettelse af Pilot Hole

1. Lokalisere bregma, det forreste punkt, hvor de tre plader i kraniet mødes, som afbildet i figur 2. Flyt infusionsnålen så nålespidsen netop rører kraniet på bregma. Bemærk dorsal-ventral koordinatsystem. Figur 3 viser, hvordan man læser koordinater på en Stoelting stereotaxisk enhed. Bemærk, at dette punkt er handsker længere steril og må ikke røre sterile operationsstedet direkte. Bemærk: Når berøre usterilt stereotaktisk anordning, er kirurgen ikke længere steril og må ikke røre operationsstedet eller dele af udstyr, som vil berøre det kirurgiske sted.
2. Lokalisere lambda, den bageste punkt, hvor de tre plader i kraniet mødes, som depicted i figur 2. Hæv infusionsnålen lidt og flytte det direkte tilbage til lambda. Sænke nålen, indtil den netop rører kraniet ved lambda. Læse dorsal-ventrale koordinat. Hvis kraniet er plan, vil det være inden for 0,1 mm af bregma læsning. Hvis det er længere væk end dette, skal du flytte nålen op (ud af vejen), løsne næsen baren, enten at hæve eller sænke bide bar platform, afhængigt af, hvilken ende af hovedet er for høj, og derefter re-foranstaltning.
3. Bevæge infusionsnålen løbet bregma og registrere de anteriore-posteriore og medial-lateral koordinater. Beregne, hvor nålen skal bevæges baseret på koordinaterne af hjernen område af interesse i overensstemmelse med en hjerne atlas ^12. For BLA, trække 2,8 mm fra anterior-posterior koordinat og enten tilføje eller trække fra 5,1 mm til / fra den mediale-laterale koordinat afhængigt af om du ønsker at målrette venstre eller højre. Flytte infusionsnålen til den beregnede position.
4. Sving Neeeneste måde at håndtere ud af vejen, idet man holde styr på hvor det blev placeret, og derefter bore et hul ca 2 mm i diameter på det sted ved hjælp af en Dremel Moto-værktøj med en steril dental bor monteret. Bore omhyggeligt, da, når boret bryder gennem kraniet, vil den have tendens til at nedbryde eventuelt beskadige dura og hjernevæv nedenunder. Oprømme hullet for at forstørre det.
5. Absorbere enhver blod med en steril vatpind.

6. Infusion af neurotoksin

1. Svinge nålen på plads. Sænke nålen, indtil den rører overfladen af ​​hjernen. Optag dorsal-ventral koordinat. Dette er niveauet af dura. Subtrahere den passende værdi til hjernen regionen af ​​interesse. For den basolaterale amygdala, trække 6,7 mm.
2. Sænk infusionsnålen til det beregnede niveau langsomt. Så hæve den op igen, et godt stykke over kraniet. Brug en Hamilton sprøjte rengøring ledning til unclog spidsen af ​​infusionsnålen, være omhyggelig med ikke at tav enden af ​​wiren, der kommer i kontakt med infusionsnålen med ikke-sterile handsker.
3. Kør pumpen ved> 5 ul / min, og sørg for at se en perle af væske komme ud af infusionen nålen. Hvis ikke, unclog med wiren, og prøv igen.
4. Sænk infusionsnålen til den ønskede dorsale / ventral niveau langsomt.
5. Sæt kursen på infusionspumpen til 0,1 ul / min, og start infusionen. Gennemtrænge i 2 min.
6. Når infusionen er startet, markerer de to ender af luftboblen i røret med en sort markør. Hvis begge ender ikke flytter, er nålen tilstoppet. Stop infusionen, hæve nålen, unclog med wiren, så tjek for flow med en høj flow hastighed, re-sænke nålen og prøv igen.
7. Når infusionen er fuldført, standses pumpen, og vent 5 min for NMDA at diffundere bort fra nålespidsen.
8. Hæve nålen 0,5 mm, og tilføre igen i 1 min. Vent 2,5 min for NMDA at diffundere bort fra kanylen-spids. Denne ekstra infusion hanLPS sikre al BLA er dækket af infusionen. Hvorvidt dette er nødvendigt for andre områder af hjernen, skal bestemmes eksperimentelt.
9. Hæve nålen ud af hjernen langsomt og svinge det stereotaksiske arm af vejen.

7. Lukning af Incision

1. Don nye sterile handsker for at lukke snittet.
2. Tør overskydende blod på kraniet med sterile bomuld-tips og fjerne klemmerne fra fascia.
3. Med London pincet, skubbe de to sider af snittet sammen. De indvendige kanter af huden bør opfylde, og den ydre kant af huden bør ikke tillades at krølle i indsnittet. Mens du trykker snittet lukket, gælder sårklips at lukke fremspring fast. Fortsætter med at presse på huden sammen og hæfteklammen langs længden af ​​snittet. Det tager normalt 3-5 sårklemmer.
4. Efter at have placeret alle sårklips, bruge pincet til at knibe hæfteklammer igen, og sørg for de er sikre. Den mere sikker tHan klip, jo mindre sandsynligt en rotte trække dem ud, før snittet er helet.
5. Aftør hæftet snittet med 10% povidon jodopløsningen og vende tilbage rotten til sit hjem bur og monitoren, indtil mobilitet er genoprettet (som regel 1-2 timer efter anæstesi, total kirurgi tid fra induktion til lukningen være 30-45 min). På dette punkt kan rotten returneres til kolonien rummet. Efter en uge, fjerne hæfteklammer med en klammefjerner værktøjet under isofluran anæstesi.
6. Brug en varm perle sterilisator til at sterilisere spids overfladerne på alle instrumenter inden brug på den næste rotte. Instrumenterne bør være nedsænket i perlerne ikke længere end 15 sekunder, eller de kan blive for varmt til at håndtere. Instrumenterne bør være fuldt afkølet før brugt på et andet dyr.

8. Recovery

1. Det er muligt, at rotter vil udvise anfaldsaktivitet i dag efter læsionen. Afhængigt af hjernen regionen beskadigede andre adfærd, såsom føde-eller Grooming kan blive påvirket. Det er vigtigt, at dyrene overvåges dagligt for at sikre, at de forbliver sunde under opsving. Understøttende behandling, såsom flydende fødevarer, højt kalorieindhold fødevarer, eller yderligere analgesi kan være påkrævet. Dødeligheden anæstesi forekommer i en lav procentdel af rotter, sædvanligvis mindre end 5%. Dødelighed på grund af andre årsager (infektion, blødning) er yderst sjældent. Eventuelle tegn på lidelse efter helbredelse af anæstesi kan være årsag til udelukkelse fra fremtidige undersøgelser, men er ekstremt sjældne. Figur 4 viser vægttab i løbet af de første par dage efter operation, da det må forventes. Kropsvægt skulle stige igen inden for 1 uge.

9. Repræsentative resultater

En uge eller mere efter NMDA infusion, kan læsionen visualiseres under anvendelse af en cresyl-violet kontrastfarve og lysfeltmikroskopi. Hjerner bør perfunderes med iskold 4% paraformaldehyd, ækvilibreret i 30% sucrose i 0,1 M PBS og frozen. De skal derefter skåret på 30-60 um, i en serie af 1:06 til 1:12 og er monteret på gelatine-coatede objektglas før de undergår en standard cresylviolet kontrastfarve. Læsionen bør svare til en "skaldet spot" eller et område af formindsket cresylviolet farvning skyldes celledød efter læsion. Figurerne 5A og B viser en repræsentativ læsion af BLA og CEA. Dette billede blev opnået ved hjælp af en flatbed scanner med en høj opløsning scanning (1200 dpi). At visualisere læsionen, hjælper til at kontrastfarve en række sektioner gennem det meste af det væv, der omgiver mål-område, så en forlagt læsion kan placeres.

Figur 1. Stereotaxiske opsætning. Denne figur viser rotte stereotaksiske med relevante mærkede dele.

Figur 2. Bregma og lambda på rotte SKUll. Denne illustration viser placeringen af bregma og lambda. Alle koordinater er målt i forhold til bregma. Lambda anvendes til at sikre, at skallen er plan.

Figur 3. Læsning stereotaksiske koordinater. Denne tegning viser en standard stereotaktisk aflæsning. For at opnå de cifre til venstre for decimal, skal du bruge markører på højre side. Det mærkede ciffer svarer til et tocifret sted (dvs. 1 = 10, 2 = 20). De hash mærker mellem de mærkede cifre svarer til de enkelte enheder (1-9). Den nul linje angiver, hvad heltal i stereotax er indstillet. Her, nullinie er mellem 10 og 11 markører, hvilket indikerer, at aflæsningen er mellem 10 og 11. For at bestemme tallene til højre for den decimal, skal du bruge markører i venstre side. Hash mærker på venstre er nummereret 0 til 10, hvor hver umærket hash repræsenterer en enhed forskel fradem ved siden af ​​den. Uanset hvilken af ​​de hash mærker på venstre liner op bedst med hash mærker på højre viser den første decimal i koordinat læsning. Her hash mærke på venstre side, der svarer til antallet 9 linjer op bedst med højre side hash mærker, så decimal er 9. Den endelige aflæsning er 10,9 mm.

Figur 4. Vægtændring efter operationen. Denne graf viser den gennemsnitlige (± SEM) vægten af rotter, som fik stereotaktisk kirurgi (n = 17) eller ikke har kirurgi (n = 6). Dag 0 er dagen for kirurgi. Efter kirurgi, nedsat vægten af ​​rotter i 2-3 dage efter kirurgi og derefter steg omkring dag 5-6.

Figur 5. Excitotoksiske læsion eksempel. A) Dette billede viser en cresylviolet kontrastfarve på en 30 um koronale skive med "skaldedespot "fra NMDA læsion af den basolaterale amygdala. De hvide pile angiver de læsionen. Det kan sammenlignes med den kontralaterale side af hjernen skive, der ikke har nogen læsion. B) En lignende læsion af den centrale kerne amygdala.

Discussion

De stereotaxiske Fremgangsmåden præsenteres her tillader excitotoksisk læsion af specifikke områder i hjernen via infusion af NMDA. De grundlæggende stereotaksiske metoder kan tilpasses til at indgyde en række farmakologiske og biologiske agenter i et site-specifik måde. Det kan også være indrettet til at målrette en række områder i hjernen, der er defineret ved deres stereotaksiske koordinater i et hjerne atlas ^12. Tilpasning til andre arter, såsom mus kan fremstilles med lignende udstyr udviklet til mindre dyr. De foreliggende fremgangsmåder er optimeret til 3 mo gamle voksne rotter, men de kan anvendes til en lang række aldre fra unge gennem ældre voksne. Hvis du arbejder med unge dyr, der kan ikke være repræsenteret i en standard hjernen atlas, kan sonderende kirurgi infusion af en farverig farvestof hjælpe med at bestemme den korrekte nåleplacering empirisk.

For forskere, der kræver langvarig implantation af en kanyle med stereotaktisk kirurgi, Geiger et al. ¹³ s.harmes en alternativ protokol med passende snit lukning og efterbehandling instruktioner. Hvis nå ud til mindre områder af hjernen der ønskes, dog skal det bemærkes, at den nuværende protokol giver mere præcise metoder til hoved placering og nivellering i stereotaktisk enhed. Den foreliggende protokol tilbyder også snit fastspænding metoder, der giver mulighed for en bredere kirurgisk vindue, ofte nødvendig, når målrette laterale strukturer såsom BLA.

Efter kirurgi, sammenlignet vægttab med kontroldyr er normalt og forventet. Figur 4 viser ændringen i vægten af voksne hanrotter, der undergik kirurgi versus manipuleret kontroller fra samme kuld. Rotter kan forventes at vise vægttab i de første 2-3 dage efter kirurgi og derefter begynder at tage på i vægt igen efter 5-6 dage. Forlænget vægttab kunne indikere infektion eller andre problemer.

Lejlighedsvis vil en rotte fjerne dens sårklemmer. Hvis snittet hsom helbredt, er dette ikke et problem. Hvis snittet ikke er helet, og er åben, må såret klemmen erstattes enten med en anden klemme eller med suturer, der begge kan udføres under isofluran-anæstesi. Herunder antibiotika (80-96 mg trimethoprim sulfa / kg / dag, 240 mg / 5 ml vand) i drikkevandet for de næste 5 dage kan også være tilrådeligt at forhindre infektion, hvis såret var åbent for miljøet.

Måske er det mest udfordrende aspekt af denne protokol, er placering af øre barer. Eksperimentelle operationer med farvestof infusion efterfulgt af umiddelbar offer anbefales at kontrollere rigtigheden af ​​begge øre bar placering og de udvalgte stereotaksiske koordinater. Hvis det område af hjernen, der skal målrettes, er i midterlinjen vi anbefaler anvendelse af en vinklet fremgangsmåde fra hver side af hjernen som store blodkar i midterlinien kan forhindre en direkte midterlinjen fremgangsmåde.

Selv når de udføres så godt som muligt, stereotaxic surGery stadig medfører kraftig eksponering for analgetika og anæstetika, vævsbeskadigelse og immunrespons. Alle disse faktorer kan påvirke eksperimentelle resultater, især tæt på tidspunktet for operationen. Bivirkninger af kirurgi kan minimeres ved at tillade for rigelig inddrivelse tid (mindst en uge), før du begynder eksperimentelle procedurer. Alternative tilgange såsom målrettede genetiske knockouts kan være muligt i mus, men kan være langt mere kompleks end stereotaxic kirurgi.

Sammenfattende tillader den beskrevne fremgangsmåde til lokaliseret læsion af områder i hjernen uden at beskadige passerer fibre. Det kan tilpasses til mange formål og er meget pålidelig og verificerbar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-Methyl-D-aspartic Acid 98%	Fisher Scientific	AC32919-0500
Dual Lab Standard Stereotaxic w/45 deg. Ear Bars	Stoelting	51653	Alternative vendor: Kopf *note of caution: assure compatibility of stereotaxic accessories if purchasing from multiple vendors
10μl SYR SPECIAL (*/*/*)	Hamilton	701SN
Dremel Moto-Tool	Stoelting	58600	Alternative vendor: Kopf
Carbide burs, handpiece HP, size 2	Schein Dental	2284578
St–lting 6 Syringe Programmable Pump	Stoelting	53140	Alternative vendor: Kopf
Stainless Steel 316 Hypodermic Regular Wall Tubing 30 Gauge .0123" OD x .00625" ID x .003" Wall (infusion needle)	Small Parts	HTXX-30R-06-05
Intramedic PE 20 tubing (infusion tubing)	VWR	63019-025
Reflex Clips, 9mm, non-sterile	Kent Scientific Corp.	INS500346	Alternative vendor: Fine Science Tools
Reflex Clip Applier for 9mm clips	Kent Scientific Corp.	12031-09	Alternative vendor: Fine Science Tools
Curved Hartman hemostat	Fine Science Tools	13003-10
London forceps	Fine Sceince Tools	11080-02
2% chlorhexidine solution	Allivet	30159	Alternative vendor: PetSolutions
10% povidone iodine solution	CVS	SKU #739575
Hot bead sterilizer	Harvard Apparatus	610183
Table 1. Table of specific reagents and equipment.