Stereotaxic Kirurgi for Excitotoxic lesjon i spesifikke hjerneområder i Adult Rat

Summary

Målrettet ablasjon av spesifikke hjerne region (er) ved infusjon av en excitotoxin bruke stereotaxic koordinater er beskrevet. Denne teknikken kan også være tilrettelagt for tilførsel av andre kjemikalier i rottehjernen.

Abstract

Mange atferdsmessige funksjoner i pattedyr, inkludert gnagere og mennesker, formidles i hovedsak av diskrete hjernen regioner. En vanlig metode for kresne funksjonen til ulike områder av hjernen for oppførsel eller andre eksperimentelle resultater er å gjennomføre en lokal ablasjon av funksjon. Hos mennesker er pasientgrupper med lokaliserte hjerneskader ofte studert for underskudd, i håp om å avsløre den underliggende funksjon det skadede området. I gnagere, kan man eksperimentelt indusere lesjoner av spesifikke områder av hjernen.

Lesjon kan oppnås på flere måter. Electrolytic lesjoner kan føre til lokaliserte skader, men vil ødelegge en rekke celletyper samt krysser fibre fra andre områder av hjernen som tilfeldigvis være i nærheten av lesjon nettstedet. Induserbar genetiske teknikker ved hjelp av celle-type spesifikke arrangører kan også aktivere stedsspesifikke målretting. Disse teknikkene er komplekse og ikke alltid praktisk avhengig av målet hjernen området. Excitotoksisk lesjon bruker stereotaxic kirurgi, derimot, er en av de mest pålitelige og praktiske metoder for lesioning eksitatoriske nerveceller uten å skade lokale gliacellene eller traversering fibre.

Her presenterer vi en protokoll for stereotaxic infusjon av excitotoxin, N-methyl-D-aspartat (NMDA), inn i basolateral amygdala komplekset. Ved hjelp av anatomiske indikasjonene, bruker vi stereotaxic koordinater for å bestemme plasseringen av vår målgruppe hjerne region og senke en kanyle på plass like over målet. Så tilfører vår excitotoxin inn i hjernen, resulterer i excitotoxic død av nærliggende nevroner. Mens vår forsøkspersonen av valget er en rotte, kan de samme metodene brukes til andre pattedyr, med de nødvendige justeringer i utstyr og koordinater.

Denne metoden kan brukes på en rekke områder av hjernen, inkludert basolateral ^1-6 amygdala, andre amygdala kjerner ^{6, 7, 8} hippocampus, entorhinal cortex ⁹ og prefrontal cortex ^10. Den kan også brukes til å sette mot biologiske forbindelser som for eksempel virale vektorer ^{1, 11.} Den grunnleggende stereotaxic teknikken kan også være tilrettelagt for implantasjon av mer permanente osmotiske pumper, slik at mer langvarig eksponering for en forbindelse av interesse.

Protocol

Anestesi og analgesi: Tretti minutter før anestesi, injisere rotte med 0,05 mg / kg subkutan buprenorfin for smertelindring. Initiere anestesi med 30-40 mg / kg intraperitoneal natrium pentobarbital. På dette punktet, også injisere atropin for å hindre respirasjonssvikt (0,4 mg / kg, subkutant) og meloksikam som ytterligere smertestillende (2 mg / kg subkutant). Hvis etter 5 minutter, er rotta fremdeles mobil eller lydhør til tå klype, gi flere doser av natrium pentobarbital på 5 mg / kg (intraperitoneal) til rotte ikke svarer til smerte. Før du utfører den første snitt, injisere lidokain (5 mg / kg, intradermal) på snittet stedet for lokalbedøvelse. Seks til åtte timer etter første injeksjon, injisere rotte med 0,05 mg / kg subkutan buprenorfin for smertelindring. Buprenorfin kan injiseres hver 6-8 timer senere om nødvendig, men dette er vanligvis ikke nødvendig.

Det er viktig å merke seg at andre former for anestesi cen forstyrre excitotoxic lesjoner. Selv om for eksempel ketamin er en vanlig form for anestesi i gnagere, kan det forstyrre lesjoner indusert med NMDA fordi det er en NMDA reseptor antagonist. Det er viktig å velge en metode for å indusere anestesi som ikke reduserer lesjon størrelse. Hvis gassanestesi er ønsket, kan de fleste stereotaxic enheter inkludert de som er beskrevet her imøtekomme gassmasken adaptere.

Merk: Materialer er nærmere beskrevet i tabellen over spesifikke reagenser og utstyr nedenfor.

1. Forberedelse av pumpen og Stereotax

1. Fyll en 10 mL Hamilton sprøyte med sterilt vann og montere den i caddy av en 6 sprøyte programmerbar pumpe. Fest enden av stempelet inn i festet holderen på pumpen.
2. Forhåndsutfyll gass-steriliseres PE20 rør med sterilt vann ved hjelp av en nål og 1 ml sprøyte. Skyv den åpne enden av slangen videre til Hamilton sprøyten, som omsorgful å unngå å skape luftbobler i røret.
3. Klem 30ga, flat-cut, 1 tomme infusjon nål enden av slangen på armen til en stereotaxic enhet ved hjelp av en tønne-stil elektroden manipulator. Sett infusjon nålen mellom klemmen og grooved fat. Fest klemmen over et stykke av slangen inneholder metall nål i det å unngå å flate ut slangen og begrense væskestrøm.
4. Juster pumpen sats til> 5 mL / min og slå på pumpen. En perle av vann skal vises på tuppen av infusjonen nålen. Sjekk lengden av slangen og skjøtene for å sikre at det ikke er noen lekkasjer.
5. Tørk bort vannet perle med en steril vattpinne og sette pumpen å trekke seg. Trekk en 2 mL luftboble. Toppen av boblen skal være synlig i slangen.
6. Senk infusjon nålespissen i en 20 mg / ml løsning av NMDA i sterile 0.1m PBS og trekke 4-5 mL. En luftboble skal være synlig mellom sterilt vann og NMDA løsningeni spissen. Det er viktig å merke seg at NMDA er en potent nervegift og forsiktighet bør brukes i forberedelse og håndtering av denne løsningen. Hansker og øyevern rådes til enhver tid.

2. Monter Rat i Stereotaxic Device

1. Figur 1 viser de grunnleggende delene av stereotaxic enheten. Etter barbering rotta hode fra linjen av øynene til ørene, legger rotte fortennene over bitt baren, med rotta kropp hviler på en varmepute satt på medium. Tungen skal henge under bittet bar, med underkjeven. Hvis tilgjengelig, vil en temperatur tilbakemeldinger varmeputen være å foretrekke. Overvåking rektal temperatur vil også være ideelt.
2. Hold rotte halsen med tommel og pekefinger, flytt rett horisontal øregangen på høyre øre bar. Baren skal føle seg som det hviler på en solid plass, ikke som den synker langt inn i hodet. Hold høyre side av hodet stødig, skyv venstre øresperrer inn rotta venstre horisontal øregangen. Det skal føles som den hviler på en solid plass. Den ører bør se symmetrisk og bør synes å ligge flatt på øret barer. Oppover fakling av ører tyder feilaktig plassering av øret barer. Hodet skal ikke vingle som svar på press på nakken.
3. Skru ned nesen bar. Vær forsiktig. Knoklene i nesen er delikat og nesen baren trenger ikke å være stram. Sjekk at rotta er fortsatt bedøvet før du fortsetter.

3. Klargjøre Rat for kirurgi

1. Ved hjelp av en steril vattpinne, forsiktig plasserer en liten mengde veterinær oftalmologiske smøre salve i hver av rotte øyne for å beskytte dem fra tørking og rusk.
2. Konsentrisk fra den planlagte snittet nettstedet til kanten av barbert regionen, tørk rotte hodebunnen med 2% klorheksidin løsning fulgt 70% etanol tre ganger. Chlorhexidine scrub kan også brukes hvis mer effektivt desinfeksjonsmiddel er ønsket.Avslutt med å tørke over med 10% povidon jod-løsning. Det preparerte hodebunnen er nå steril og bør bare berøres med sterile materialer.
3. Don sterile hansker for ytterligere tiltak fordi du vil neste håndtere den tilberedte operasjonsstedet.
4. Plasser et sterilt drapere slik at fenestrasjon eksponerer operasjonsstedet.

4. Opprette Kirurgisk Window

1. Bruke en 10 skalpell blad, gjør et snitt (ca 2 cm i lengde) langs langsgående midtlinjen av hodebunnen. Snittet bør begynne posteriort for linjen av øynene. Med tommel og pekefinger av den ikke-dominante hånden holder skalp i spenning vinkelrett på retningen av snittet.
2. Trekk fascia overliggende skallen overflaten til kanten av det kirurgiske området ved hjelp av sterile Cotton-tips. Det vil ta litt kraft for å fjerne skallen slik at den kan sees.
3. Bruk fire buede, sterile hemostats å opprette et kirurgisk vindu. Clamp fascia (IKKE hud) på each side av fremre og bakre deler av såret og deretter legge klemmene langs dyret, og dermed trekke snittet åpen og fullt utsette skallen.

5. Planering Skull and Opprette Pilot Hole

1. Finn bregma, fremre punkt der de tre viktigste platene i skallen møtes, som vist i Figur 2. Flytt infusjon nålen slik at nålespissen bare berører skallen på bregma. Legg merke til dorsal-ventral koordinat. Figur 3 viser hvordan å lese koordinater på en Stoelting stereotaxic enhet. Obs, på dette punktet, hansker er ikke lenger steril og bør ikke berøre sterilt kirurgi nettstedet direkte. Merk: Etter å berøre usterile stereotaxic enheten, er kirurgen ikke lenger steril og bør ikke berøre det kirurgiske området eller deler av utstyr som vil berøre det kirurgiske området.
2. Finn lambda, den bakre punktet der de tre viktigste platene i skallen møtes, som depicted i figur 2. Hev infusjon nålen litt og flytte det rett tilbake til lambda. Senk nålen inntil det bare berører skallen på lambda. Les dorsal-ventral koordinat. Hvis skallen er nivået, vil det være innenfor 0,1 mm av bregma lesing. Hvis det er lenger unna enn dette, flytte nålen opp (ut av veien), løsne nesen baren, enten heve eller senke bittet bar plattformen, avhengig av hvilken ende av hodet er altfor høyt, og deretter re-tiltak.
3. Flytt infusjon p over bregma og registrere anterior-posterior og medial-lateral koordinater. Beregn hvor nålen må flyttes basert på koordinatene av hjernen området av interesse i henhold til en hjerne atlas ^12. For BLA, trekker 2,8 mm fra anterior-posterior koordinat og enten legge til eller trekke fra 5,1 mm til / fra den mediale-laterale koordinat avhengig av om du ønsker å målrette venstre eller høyre. Flytt infusjon nålen til den beregnede posisjon.
4. Sving needle ut av veien, ta vare å holde rede på hvor den ble plassert, og deretter bore et hull ca 2 mm i diameter på dette stedet ved hjelp av en Dremel Moto-verktøy med en steril dental bor. Bor forsiktig som når boret bryter gjennom skallen, vil det en tendens til å trekke ned, muligens skade dura og hjernevev under. Ream hullet for å forstørre det.
5. Absorber noe blod med en steril bomullspinne.

6. Infusjon av neurotoxin

1. Sving nålen tilbake på plass. Senk nålen til den berører overflaten av hjernen. Noter dorsal-ventral koordinat. Dette er det nivået av dura. Trekk den aktuelle verdien å nå hjernen regionen av interesse. For basolateral amygdala, trekke 6,7 mm.
2. Senk infusjon nålen til beregnet nivå sakte. Da reise det opp igjen, godt over skallen. Bruk en Hamilton sprøyte rengjøring ledning for å rense spissen av infusjon nålen, være forsiktig med å tAu slutten av ledningen som kommer i kontakt med infusjon nål med ikke-sterile hansker.
3. Kjør pumpen på> 5 mL / min, og sørg for at du ser en perle av væske kommer ut av infusjon nålen. Hvis ikke, rense med wire og prøv igjen.
4. Senk infusjon nålen til ønsket dorsal / ventrale nivå sakte.
5. Sett kursen på infusjonspumpen til 0,1 mL / min og starte infusjonen. Trekke i 2 min.
6. Når infusjonen har startet, merker de to endene av luftboble i slangen med en sort tusj. Hvis begge ender ikke flytter, er nålen tett. Stopp infusjonen, heve nålen, rense med wire, sjekk for flyt med en høy vannmengde, re-senke nålen og prøv igjen.
7. Når infusjonen er fullført, stopper pumpen og vente 5 min for NMDA å spre bort fra nålespissen.
8. Hev nålen 0,5 mm, og fylle igjen i 1 min. Vent 2,5 min til NMDA å spre bort fra nålen-tips. Denne ekstra infusjon hanLPS sikre alle BLA dekkes av infusjon. Hvorvidt dette er nødvendig for andre områder av hjernen må bestemmes eksperimentelt.
9. Hev nålen ut av hjernen langsomt og sving stereotaxic arm ut av veien.

7. Lukke Innsnitt

1. Don nye sterile hansker å lukke såret.
2. Tørk bort overflødig blod på skallen med sterile bomull-tips og fjerne klemmer fra fascia.
3. Bruker London tang, skyver de to sidene av snittet sammen. De indre kantene på huden bør møtes, og den ytre kanten av huden bør ikke tillates å krølle i snittet. Mens du trykker snittet stengt, gjelder sår klipp for å lukke protrusion fast. Fortsett å skyve huden sammen og stifte langs snittet. Dette tar vanligvis 3-5 sår klipp.
4. Etter å ha satt alle sår klippene, bruke tang for å klype stiftene igjen, noe som gjør at de er sikre. Jo sikrere tHan klipp, vil mindre sannsynlig en rotte trekke dem ut før snittet har grodd.
5. Pinnen på stiftet snittet med 10% povidon jod-løsning og returnere rotte til sitt hjem bur og skjermen inntil mobilitet er gjenopprettet (vanligvis 1-2 timer etter anestesi, total kirurgi tid fra induksjon til nedleggelse være 30-45 min). På dette punktet kan rotte bli returnert til kolonien rommet. Etter en uke, fjerner stifter med en stift remover verktøyet under isofluran anestesi.
6. Bruk en varm perle sterilisator å sterilisere spissen overflater av alle instrumentene før bruk på neste rotte. Instrumenter skal senkes ned i perlene for ikke lenger enn 15 sekunder, eller de kan bli for varmt å håndtere. Instrumenter skal være helt avkjølt før brukes på et annet dyr.

8. Recovery

1. Det er mulig at rotter vil stille anfall aktivitet i dagene etter lesjon. Avhengig av hjernen regionen skadede, andre handlinger, for eksempel matforbruk eller Grooming kan påvirkes. Det er viktig at dyr skal overvåkes på daglig basis for å sikre at de forblir friske under gjenoppretting. Støttebehandling, som for eksempel flytende mat, høy-kalori mat, eller ekstra analgesi kan være nødvendig. Dødelighet som følge av anestesi forekommer i en lav prosentandel av rotter, vanligvis mindre enn 5%. Dødelighet på grunn av andre årsaker (infeksjon, blødning) er svært sjeldne. Eventuelle tegn på stress etter utvinning av anestesi kan føre til utelukkelse fra fremtidige studier, men er svært sjeldne. Figur 4 viser vekttapet i løpet av de første dagene etter operasjonen som det bør forventes. Kroppsvekt bør returen innen 1 uke.

9. Representative Resultater

En uke eller mer etter NMDA infusjon, kan lesjonen bli visualisert ved hjelp av en cresyl-fiolett counterstain og lysfelt mikroskopi. Hjerner bør perfused med iskald 4% paraformaldehyde, likevekt i 30% sukrose i 0.1m PBS og frozno. De bør da skiver på 30-60 mikrometer, i en serie 01:06 til 01:12 og monteres på gelatin-belagt glassplater før under en standard cresyl fiolett counterstain. Den lesjon skal tilsvare en "skallet flekk" eller et område av redusert cresyl fiolett farge på grunn av celledød etter skade. Tall 5A og B viser en representant lesjon av BLA og CEA. Dette bildet ble innhentet ved hjelp av en planskanner med høy oppløsning skanning (1200 dpi). For å visualisere lesjon, hjelper det å counterstain en rekke seksjoner gjennom store deler av vevet rundt målområdet slik at en feilplassert lesjon kan lokaliseres.

Figur 1. Stereotaxic oppsett. Denne figuren viser rotte stereotaxic med relevante deler merket.

Figur 2. Bregma og lambda på rotte SKUll. Denne illustrasjonen viser plasseringen av bregma og lambda. Alle koordinatene er målt i forhold til bregma. Lambda brukes til å sikre at hodeskallen er nivået.

Figur 3. Reading stereotaxic koordinater. Denne tegningen viser en standard stereotaxic lesing. For å få tallene til venstre for desimalen, bruke markører på høyre side. Det merket siffer tilsvarer titalls sted (dvs 1 = 10, 2 = 20). De hash merkene mellom de merkede sifrene tilsvarer de enkelte enhetene (1-9). Null linjen angir hva heltall den stereotax er satt. Her er det null linjen mellom 10 og 11 markører, noe som indikerer at lesing er mellom 10 og 11. For å bestemme tallene til høyre for desimalen, bruke markører på venstre side. De hash merker på venstre er nummerert 0 til 10, med hver umerkede hasj representerer en enhet forskjell frade ved siden av den. Uansett hvilken av de hash merker på venstre linjene opp best med hasj merker på høyre viser den første desimal av koordinatsystemet lesing. Her hash-merket på venstre tilsvarende tall 9 linjer opp beste med den høyre hasj merkene så desimalplassen er ni. Den endelige lesing er 10,9 mm.

Figur 4. Vekt endring etter operasjonen. Denne grafen viser gjennomsnittlig (± SEM) Vekten av rotter som gjennomgikk stereotaxic kirurgi (n = 17) eller ikke har kirurgi (n = 6). Dag 0 er dagen for kirurgi. Etter kirurgi, vekten av rotter redusert til 2-3 dager etter operasjonen og deretter økes rundt dag 5-6.

Figur 5. Excitotoxic lesjon eksempel. A) Dette bildet viser en cresyl fiolett counterstain på en 30 mikrometer coronal skive med "skalletspot "fra NMDA lesjon av basolateral amygdala. De hvite pilene skissere lesjon. Det kan sammenlignes med motsatt side av hjernen skive som ikke har lesjon. B) En lignende lesjon i den sentrale kjernen amygdala.

Discussion

Den stereotaxic Metoden som presenteres her kan for excitotoxic lesjon i spesifikke hjerneområder via infusjon av NMDA. De grunnleggende stereotaxic metoder kan tilpasses for å påvirke en rekke farmakologiske og biologiske midler i en stedsspesifikk måte. Det kan også tilpasses å målrette en rekke hjerneområder, definert av sine stereotaxic koordinatene i en hjerne atlas ^12. Tilpasning til andre arter som mus kan gjøres med lignende utstyr bygget for mindre dyr. Dagens rutiner er optimalisert for 3 mnd gamle voksne rotter, men de kunne brukes til en rekke aldre fra yngel gjennom eldre voksne. Ved arbeid med yngre dyr som kanskje ikke er representert i en standard hjerne atlas, kan utforskende surgeries infusjonen en fargerik fargestoff å fastslå riktig nål plassering empirisk.

For etterforskere som krever langsiktig implantasjon av en kanyle med stereotaxic kirurgi, Geiger mfl.. ¹³ pmisliker en alternativ protokoll med riktig snitt nedleggelse og ettervern instruksjoner. Hvis målretting mindre områder av hjernen er ønskelig, men bør det bemerkes at den nåværende protokollen tilbyr mer presise metoder for hode plassering og utjevning i stereotaxic enheten. Denne protokoll tilbyr også innsnitt fastspenning metoder som åpner for en bredere kirurgisk vindu, ofte nødvendig når du målretter laterale strukturer som BLA.

Etter operasjonen, sammenlignet vekttap for å kontrollere dyr er normalt og forventet. Figur 4 viser endringen i vekt av voksne hannrotter som gjennomgikk kirurgi versus unmanipulated kontroller fra samme kohort. Rotter kan forventes å vise vekttap for de første 2-3 dagene etter operasjonen, og deretter begynne å få vekten igjen etter 5-6 dager. Mer langvarig vekttap kan tyde på infeksjon eller andre problemer.

Noen ganger vil en rotte fjerne sine sår klipp. Hvis snittet hsom helbredet, ikke dette presentere et problem. Dersom snittet ikke har grodd og er åpen, må såret klippet erstattes enten med et annet klipp eller med sting, som begge kan utføres under isofluran anestesi. Inkludert antibiotika (80-96 mg trimetoprim sulfa / kg / dag, 240 mg / 5 ml vann) i drikkevannet for de neste 5 dagene kan også være lurt å forebygge infeksjon hvis såret var åpent for miljøet.

Kanskje den mest utfordrende delen av denne protokollen er plassering av øret barer. Eksperimentelle surgeries med fargestoff infusjon etterfulgt av umiddelbar oppofrelse anbefales å sjekke nøyaktigheten av både øre bar plassering og de valgte stereotaxic koordinater. Hvis hjernen regionen til å være målrettet er i midtlinjen, anbefaler vi at du bruker en vinklet tilnærming fra begge sider av hjernen som store blodkar i midtlinjen kan hindre en direkte midtlinjen tilnærming.

Selv når utført så godt som mulig, stereotaxic surGery innebærer fortsatt tung eksponering for analgetika og bedøvelse, vevsskade og immunrespons. Alle disse faktorene kan påvirke eksperimentelle resultater, særlig nær tidspunktet for kirurgi. Bivirkninger av kirurgi kan minimeres ved å tillate for god utvinning tid (minst en uke) før du begynner eksperimentelle prosedyrer. Alternative tilnærminger som målrettede genetiske knockouts kan være mulig i mus, men kan være mye mer komplisert enn stereotaxic kirurgi.

I sammendraget, gjør den beskrevne metoden for lokaliserte lesjoner av hjernen områder uten å skade passerer fibrene. Det kan tilpasses til mange formål og er svært pålitelig og verifiserbar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-Methyl-D-aspartic Acid 98%	Fisher Scientific	AC32919-0500
Dual Lab Standard Stereotaxic w/45 deg. Ear Bars	Stoelting	51653	Alternative vendor: Kopf *note of caution: assure compatibility of stereotaxic accessories if purchasing from multiple vendors
10μl SYR SPECIAL (*/*/*)	Hamilton	701SN
Dremel Moto-Tool	Stoelting	58600	Alternative vendor: Kopf
Carbide burs, handpiece HP, size 2	Schein Dental	2284578
St–lting 6 Syringe Programmable Pump	Stoelting	53140	Alternative vendor: Kopf
Stainless Steel 316 Hypodermic Regular Wall Tubing 30 Gauge .0123" OD x .00625" ID x .003" Wall (infusion needle)	Small Parts	HTXX-30R-06-05
Intramedic PE 20 tubing (infusion tubing)	VWR	63019-025
Reflex Clips, 9mm, non-sterile	Kent Scientific Corp.	INS500346	Alternative vendor: Fine Science Tools
Reflex Clip Applier for 9mm clips	Kent Scientific Corp.	12031-09	Alternative vendor: Fine Science Tools
Curved Hartman hemostat	Fine Science Tools	13003-10
London forceps	Fine Sceince Tools	11080-02
2% chlorhexidine solution	Allivet	30159	Alternative vendor: PetSolutions
10% povidone iodine solution	CVS	SKU #739575
Hot bead sterilizer	Harvard Apparatus	610183
Table 1. Table of specific reagents and equipment.