Summary
يوصف الاجتثاث استهدفت منطقة محددة في الدماغ (ق) عن طريق التسريب من excitotoxin باستخدام الإحداثيات التجسيمي. ويمكن أيضا هذه التقنية يمكن تكييفها للتسريب من غيرها من المواد الكيميائية في الدماغ الفئران.
Abstract
وتتوسط العديد من الوظائف السلوكية في الثدييات، بما في ذلك القوارض والبشر، وبصورة رئيسية من قبل مناطق الدماغ منفصلة. وهناك طريقة مشتركة لوظيفة المميزين من مناطق الدماغ المختلفة للسلوك أو النتائج التجريبية الأخرى هو تنفيذ الاجتثاث المترجمة من وظيفة. في البشر، وغالبا ما تتم دراسة السكان المريض مع آفات الدماغ المترجمة للعجز، أملا في الكشف عن وظيفة الكامنة وراء المنطقة المتضررة. في القوارض، يمكن للمرء أن تحفز تجريبيا آفات من مناطق محددة في الدماغ.
ويمكن تحقيق آفة في عدة طرق. يمكن للآفات كهربائيا تسبب أضرارا موضعية ولكن سيضر مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، وكذلك الألياف العبور من مناطق أخرى من الدماغ الذي يحدث ليكون بالقرب من موقع الآفة. محرض قد تقنيات وراثية باستخدام خلية من نوع المروجين محددة تمكن أيضا في مواقع محددة الاستهداف. هذه التقنيات معقدة وليس من العملي دائما اعتمادا على المنطقة المستهدفة في المخ. Excitotآفة أوضاع مؤكسدة تستخدم جراحة التجسيمي، على النقيض من ذلك، هو واحد من الأساليب الأكثر موثوقية والعملية لlesioning الخلايا العصبية مثير دون الإضرار الخلايا الدبقية المحلية أو العبور الألياف.
هنا، نقدم بروتوكولا للتسريب التجسيمي للexcitotoxin، ن ميثيل مد اسبارتاتي (NMDA)، في مجمع اللوزة basolateral. باستخدام مؤشرات التشريحية، ونحن نطبق إحداثيات التجسيمي لتحديد موقع لدينا هدف المنطقة من المخ وخفض إبرة حقن في مكان أعلى بقليل من الهدف. نحن لبث ثم excitotoxin لدينا في الدماغ، مما يؤدي إلى موت الخلايا العصبية excitotoxic قريب. بينما موضوعنا التجريبية من الاختيار هو فأر، يمكن تطبيق نفس الأساليب إلى غيرها من الثدييات، مع التعديلات المناسبة في المعدات والإحداثيات.
ويمكن استخدام هذه الطريقة على مجموعة متنوعة من مناطق الدماغ، بما في ذلك اللوزة basolateral 1-6، وغيرها من اللوزة نوى 6، 7، 8 الحصين، والأنف والحنجرةorhinal قشرة (9) وقشرة الفص الجبهي 10. ويمكن أيضا استخدامه للبث المركبات البيولوجية مثل ناقلات فيروسية 1 و 11. ويمكن أيضا هذه التقنية الأساسية التجسيمي يمكن تكييفها لزرع المزيد من مضخات التناضحي دائم، مما يسمح للمزيد من التعرض لفترات طويلة الى مجمع المصالح.
Protocol
التخدير والتسكين: ثلاثون دقيقة قبل التخدير، وحقن الفئران مع 0.05 البوبرينورفين تحت الجلد مغ / كغ للوعي. بدء التخدير مع الصوديوم ملغم / كغم من 30-40 داخل الصفاق بنتوباربيتال. عند هذه النقطة، حقن الأتروبين أيضا لمنع فشل في الجهاز التنفسي (0.4 ملغم / كغم، تحت الجلد)، وmeloxicam كما مسكن آخر (2 مغ / كغ تحت الجلد). إذا بعد 5 دقائق، والفئران لا يزال المحمول أو استجابة لقرصة اصبع القدم، واعطاء جرعات لاحقة من الصوديوم بنتوباربيتال في 5 مغ / كغ (داخل الصفاق) حتى الفئران لا يستجيب للألم. قبل تنفيذ الشق الأول، حقن الليدوكائين (5 مغ / كغ، الأدمة) في موقع شق لتخدير موضعي. ست إلى ثماني ساعات بعد الحقن الأولى، حقن الفئران مع 0.05 البوبرينورفين تحت الجلد مغ / كغ للوعي. ويمكن حقن البوبرينورفين كل 6-8 ساعات بعد ذلك إذا لزم الأمر، على الرغم من هذا هي عادة ليست ضرورية.
من المهم أن نلاحظ أن أشكال أخرى من التخدير ج1 تتداخل مع الآفات excitotoxic. على سبيل المثال، على الرغم من الكيتامين هو شكل استخداما التخدير في القوارض، ويمكن ان تتداخل مع الآفات التي يسببها مع NMDA لأنها مستقبلات NMDA. من المهم تحديد أسلوب التخدير حمل هذا لا يقلل من حجم الآفة. إذا كان المطلوب غاز التخدير، يمكن أن معظم الأجهزة التجسيمي بما في ذلك تلك الموصوفة هنا استيعاب محولات قناع غاز.
ملاحظة: يتم وصف مواد أخرى في جدول معين الكواشف والمعدات أدناه.
1. التحضير للمضخة وStereotax
- شغل لمدة 10 حقنة هاميلتون ميكرولتر مع الماء المعقم وتركيبها في العلبة من مضخة للبرمجة 6 حقنة. تأمين نهاية الغطاس حقنة في حامل فرضت على المضخة.
- ملء مسبق للغاز تعقيم PE20 أنابيب مع الماء المعقم باستخدام إبرة حقنة و 1 مل. أزح نهاية مفتوحة للأنابيب إلى حقنة هاملتون، ويجري الرعايةفول لتجنب خلق أي فقاعات الهواء في الأنبوب.
- المشبك 30ga، شقة المعالم وإبرة الحقن 1 بوصة نهاية للأنابيب إلى ذراع لجهاز التجسيمي باستخدام مناور القطب برميل على غرار. إدراج إبرة الحقن بين الشبك ومخدد برميل. تأمين المشبك على قطعة من الأنابيب التي تحتوي على إبرة معدنية في داخلها لتجنب تسطيح الأنبوب وتقييد تدفق السوائل.
- ضبط معدل الضخ إلى> 5 ميكروليتر / دقيقة وتشغيل المضخة. وينبغي أن يكون حبة من الماء تظهر في رأس الإبرة التسريب. تحقق من طول الأنبوب والمفاصل لها للتأكد من عدم وجود تسرب.
- يمسح الماء حبة مع مسحة معقمة ووضع مضخة لسحب. سحب (أ) 2 فقاعة هواء ميكرولتر. وينبغي أن الجزء العلوي من فقاعة تكون واضحة في الأنبوب.
- تزج رأس إبرة الحقن في حل 20 ملغ / مل من NMDA في معقم 0.1M برنامج تلفزيوني وسحب ميكرولتر 4-5. وينبغي أن فقاعة هواء تكون واضحة بين الماء المعقم والحل NMDAفي الطرف. من المهم أن نلاحظ أن NMDA هو عصبي قوي وينبغي توخي الحذر في إعداد والتعامل مع هذا الحل. وينصح القفازات وحماية العين في جميع الأوقات.
2. تحميل الجرذ في الجهاز التجسيمي
- الشكل 1 يصور أجزاء أساسية من الجهاز التجسيمي. بعد حلق رأس فأر من خط للعيون الى الاسماع، وتحميل أسنان الفأر الأمامية فوق العارضة لدغة، مع جسم فأر يستريح على وسادة التدفئة على مجموعة المتوسط. يجب على لسان شنق أسفل شريط لدغة، مع الفك السفلي. إذا كانت متوفرة، فإن ردود الفعل وسادة التدفئة درجة الحرارة يكون من الأفضل. ومراقبة درجة حرارة الجسم أيضا أن تكون مثالية.
- عقد رقبة الفأر مع الإبهام والسبابة، نقل حق قناة الأذن أفقي على شريط الأذن اليمنى. شريط ينبغي أن أشعر بأن ذلك يوضع على مكان صلب، وليس مثل ما تغوص بعيدا في الرأس. عقد الجانب الأيمن من الرأس ثابت، مرر الأذن اليسرىمنع في الجرذ اليسار قناة الأذن أفقي. يجب أن أشعر بأن ذلك يوضع على مكان صلب. ينبغي أن ننظر pinnae متناظرة ويجب أن تظهر إلى شقة تقع على أشرطة الأذن. حرق التصاعدي ليشير إلى وضع غير لائق pinnae من القضبان الأذن. ينبغي للرئيس لا تمايل استجابة لضغوط في الرقبة.
- برغي أسفل شريط الأنف. أن يكون لطيف. العظام في الأنف حساسة وشريط الأنف لا تحتاج إلى أن تكون ضيقة. تأكد من أن الفئران لا يزال تخدير قبل الشروع.
3. إعداد الجرذ لجراحة
- باستخدام مسحة معقمة، وضع بلطف على كمية صغيرة من مرهم البيطرية العيون التشحيم في كل من العيون والفئران لحمايتهم من الجفاف والحطام.
- بتكثف من موقع شق مقررة الى حافة منطقة حلق، مسح فروة الرأس الفأر مع حل الكلورهيكسيدين 2٪ تليها الايثانول 70٪ ثلاث مرات. ويمكن أيضا فرك الكلورهيكسيدين ان تستخدم اذا كان هو المطلوب مطهر أكثر فعالية.الانتهاء من مسح مع 10٪ البوفيدون محلول اليود. فروة الرأس استعدادا الآن عقيمة وينبغي ألا يكون لمست بمواد معقمة.
- قفازات معقمة دون لاتخاذ مزيد من الخطوات لأنك سوف تعامل المقبل مع موقع الجراحية المعدة.
- وضع الستارة عقيم بحيث نوفذة الكشف عن موقع الجراحية.
4. خلق نافذة الجراحية
- باستخدام شفرة # 10 مشرط، إجراء شق (ما يقرب من 2 سم في الطول) على طول خط الوسط الطولي للفروة الرأس. يجب أن يبدأ شق الخلفي إلى خط العينين. مع الإبهام والسبابة من يد غير المهيمنة، والاستمرار على فروة الرأس في توتر عمودي على اتجاه شق.
- سحب اللفافة التي تغمر سطح الجمجمة إلى حواف موقع جراحية معقمة باستخدام القطن نصائح. سوف يستغرق الأمر بعض القوة لمسح الجمجمة حتى يمكن النظر إليه.
- استخدام أربعة المنحني، المرقأة العقيمة لإنشاء إطار العمليات الجراحية. فآسيا المشبك (وليس الجلد) على عصاموضع الفصل جانب من الجوانب الأمامية والخلفية من شق ومن ثم المشابك جنبا إلى جنب مع الحيوانات، وسحب بالتالي شق مفتوحة تماما وتعريض الجمجمة.
5. تسوية الجمجمة وخلق هول الطيار
- تحديد موقع bregma، وهذه النقطة الأمامية حيث لوحات الثلاثة الرئيسية للجمجمة الوفاء، كما هو مبين في الشكل 2. تحريك الإبرة التسريب ذلك غيض إبرة يمس فقط الجمجمة في bregma. لاحظ ظهري، بطني تنسيق. الشكل 3 يوضح كيفية قراءة الإحداثيات على جهاز التجسيمي Stoelting. ملاحظة، عند هذه النقطة، والقفازات لم تعد معقمة ويجب أن لا تلمس موقع عملية جراحية معقمة مباشرة. ملاحظة: بعد لمس الجهاز nonsterile التجسيمي، وجراح لم تعد معقمة ويجب أن لا تلمس موقع الجراحية ولا أجزاء من المعدات التي سوف تلمس موقع الجراحية.
- تحديد موقع لامدا، وهذه النقطة الخلفية حيث لوحات الثلاثة الرئيسية للجمجمة الوفاء، كما depicteد في الشكل 2. رفع إبرة حقن قليلا ونقله مرة أخرى مباشرة إلى امدا. خفض الإبرة حتى أنها تمس فقط الجمجمة في امدا. قراءة إحداثيات ظهري، بطني. إذا الجمجمة هو المستوى، سيكون من ضمن 0.1 ملم من القراءة bregma. إذا كان الخروج إلى أبعد من هذا، تحريك الإبرة حتى (للخروج من الطريق)، وتخفيف شريط الأنف، وإما رفع أو خفض منصة شريط لدغة، استنادا إلى أي حد من الرأس مرتفعة جدا، ومن ثم إعادة التدبير.
- تحريك الإبرة ضخ أكثر من bregma وتسجيل إحداثيات الأمامي، والخلفي الأنسي الأطراف. حساب حيث يجب أن يتم نقل إبرة استنادا إلى إحداثيات منطقة الدماغ التي تهم وفقا لأطلس الدماغ 12. لجيش تحرير بلوشستان، وطرح 2،8 ملم من تنسيق الأمامي الخلفي، وإما إضافة أو طرح 5.1 ملم إلى / من تنسيق وسطي، الأفقي اعتمادا على ما إذا كنت ترغب في استهداف اليسار أو اليمين. تحريك الإبرة التسريب لموقف محسوب.
- سوينغ نيDLE للخروج من الطريق، مع الحرص على تتبع المكان الذي كان يقع عليه وحفر حفرة ثم ما يقرب من 2 مليمتر في القطر في هذا المكان باستخدام الدراجات النارية DREMEL الأدوات مع مثقاب الأسنان معقمة المرفقة. حفر بعناية كما هو الحال عندما التدريبات يكسر من خلال الجمجمة، وسوف تميل إلى هدم، وإلحاق أضرار ربما الجافية وأنسجة المخ تحت. ماعون ثقب لتكبيرها.
- استيعاب أي دم مع مسحة القطن المعقم.
6. التسريب من عصبي
- تأرجح إبرة الظهر في موضعه. خفض الإبر حتى تلامس سطح الدماغ. تسجيل إحداثيات ظهري، بطني. هذا هو مستوى الجافية. طرح القيمة المناسبة للوصول إلى منطقة الدماغ من الفائدة. لوزة basolateral، طرح 6.7 مم.
- خفض إبرة الحقن إلى المستوى المحسوب ببطء. ثم رفع إعادته، أعلى بكثير من الجمجمة. استخدام تنظيف حقنة هاميلتون الأسلاك لتنشيط رأس الإبرة التسريب، والحرص على عدم تيأوتش نهاية الأسلاك التي تأتي في اتصال مع إبرة الحقن مع قفازات غير معقمة.
- تشغيل المضخة في> 5 ميكروليتر / دقيقة، وتأكد من رؤية حبة من السائل يخرج من إبرة الحقن في الوريد. إن لم يكن، مع كسر جمود السلك وحاول مرة أخرى.
- خفض إبرة الحقن إلى مستوى ظهري / بطني المطلوب ببطء.
- تعيين معدل على مضخة التسريب إلى 0.1 ميكرو لتر / دقيقة وبدء ضخ. يبث لمدة 2 دقيقة.
- مرة واحدة في التسريب قد بدأت، بمناسبة طرفي فقاعة الهواء في الأنبوب مع علامة سوداء. إذا كلا الطرفين لا تتحرك، وانسداد إبرة الخاص. توقف ضخ ورفع الإبرة، وكسر جمود مع الأسلاك، والتحقق من وجود تدفق مع معدل تدفق عالية، وإعادة خفض إبرة وحاول مرة أخرى.
- مرة واحدة في ضخ كاملة، ووقف الضخ وانتظر 5 دقائق لNMDA لنزع فتيل بعيدا من طرف الإبرة.
- رفع إبرة 0.5 ملم، ومرة أخرى للبث 1 دقيقة. انتظر 2،5 دقيقة لNMDA لنزع فتيل بعيدا عن معلومات سرية إبرة. هذا التسريب إضافي هوLPS ضمان تغطية كل من جيش تحرير بلوشستان من قبل التسريب. يجب أن إذا كان هذا ضروريا لمناطق أخرى من الدماغ تجريبيا.
- رفع إبرة من الدماغ ببطء وتأرجح الذراع التجسيمي للخروج من الطريق.
7. إغلاق الشق
- دون قفازات معقمة جديدة لإغلاق الجرح.
- امسحي أي زيادة الدم في الجمجمة مع نصائح عقيمة القطن وإزالة المشابك من لفافة.
- باستخدام ملقط لندن، ودفع الجانبين للشق معا. وينبغي أن الحواف الداخلية للجلد، وينبغي ألا يجتمع الحافة الخارجية من الجلد يسمح للحليقة في شق. أثناء الضغط على شق مغلقة، وتطبيق مقاطع الجرح لإغلاق نتوء بحزم. مواصلة دفع الجلد معا، والأساسية على طول الشق. هذا عادة ما يستغرق مقاطع الجرح 3-5.
- بعد وضع جميع مقاطع الجرح، واستخدام الملقط لقرصة من المواد الغذائية مرة أخرى، والتأكد من أنها آمنة. ر أكثر أمناانه لقطات، فإن أقل احتمالا فأر تسحبهم قبل شق تعافى.
- مسحة شق مدبس مع 10٪ البوفيدون حل اليود والعودة إلى قفص الفئران وطنه، ورصد حتى يتم استعادة الحركة (عادة ما تكون 1-2 ساعات بعد التخدير، ومجموع وقت لعملية جراحية من الحث على إغلاق يجري 30-45 دقيقة). عند هذه النقطة، قد يكون عاد الى غرفة الفئران مستعمرة. بعد أسبوع واحد، وإزالة المواد الغذائية الأساسية مع أداة مزيل التيلة تحت التخدير isoflurane.
- استخدام معقم ساخن حبة لتعقيم الأسطح غيض من جميع الأدوات قبل استخدامها على الفئران المقبل. وينبغي أن تكون مغمورة الصكوك في الخرز مدة لا تزيد عن 15 ثانية، أو أنها قد تصبح حارة جدا في التعامل معها. وينبغي أن الصكوك تبرد تماما قبل استخدامها على حيوان آخر.
8. انتعاش
- فمن الممكن أن الفئران التي ستعرض نشاط مصادرة في الأيام التي تلت الآفة. اعتمادا على المنطقة التالفة في المخ، والسلوكيات الأخرى مثل استهلاك الأغذية أو غروقد تتأثر oming. من المهم أن يتم رصد الحيوانات على أساس يومي للتأكد من أنها لا تزال سليمة خلال فترة الانتعاش. قد تكون هناك حاجة الرعاية الداعمة، مثل المواد الغذائية السائلة والمواد الغذائية ذات السعرات الحرارية العالية، أو تسكين إضافي. معدلات الوفيات الناجمة عن التخدير يحدث في نسبة قليلة من الفئران، وعادة أقل من 5٪. معدل وفيات نتيجة لأسباب أخرى (العدوى، النزيف) نادرة للغاية. يجوز لأية علامات توتر بعد الشفاء من التخدير يمكن أن يسبب للاستبعاد من الدراسات المستقبلية، ولكنها نادرة للغاية. الشكل 4 يصور فقدان الوزن خلال الأيام القليلة الأولى بعد الجراحة كما ينبغي أن يتوقع ذلك. وينبغي أن وزن الجسم ينتعش في حدود 1 في الاسبوع.
9. ممثل النتائج
أسبوع واحد أو أكثر بعد التسريب NMDA، لا يمكن للآفة يمكن تصور استخدام ملون مباين cresyl البنفسجية والمجهري brightfield. وينبغي perfused أدمغة مع امتصاص العرق البارد الجليد، ومعايرتها 4٪ في السكروز 30٪ في برنامج تلفزيوني 0.1M وfrozEN. وينبغي بعد ذلك أن شرائح في 30-60 ميكرون، في سلسلة من 1:06 حتي 1:12، والتي شنت على لشرائح الزجاج الجيلاتين المغلفة قبل ان يخضع لمعيار ملون مباين البنفسجي cresyl. يجب أن تتوافق مع آفة "بقعة صلعاء" أو مساحة اللون البنفسجي cresyl انخفضت صمة عار بسبب موت الخلايا بعد الآفة. أرقام 5A وباء تظهر الآفة ممثل جيش تحرير بلوشستان وCEA. تم الحصول على هذه الصورة باستخدام ماسح مسطحة مع مسح ارتفاع القرار (1200 نقطة في البوصة). لتصور الآفة، فإنه يساعد على ملون مباين سلسلة من المقاطع من خلال الكثير من الأنسجة المحيطة بها المنطقة المستهدفة حتى يمكن أن يكون موجودا آفة في غير محله.
الشكل 1. الإعداد التجسيمي. يعرض هذا الشكل التجسيمي الفئران مع الجهات ذات الصلة وصفت.
الشكل 2. Bregma وامدا على SKU الفئرانليرة لبنانية. هذا التوضيح يصور مواقع bregma وامدا. ويتم قياس جميع الإحداثيات النسبية إلى bregma. ويستخدم لامدا للتأكد من أن الجمجمة هو مستوى.
الشكل 3. قراءة إحداثيات التجسيمي. هذا الرسم يصور القراءة معيار التجسيمي. للحصول على أرقام إلى يمين المكان العشرية، واستخدام علامات على الجانب الأيمن. الرقم المسمى يتوافق مع عشرات مكان (أي 1 = 10، 2 = 20). علامات التجزئة بين الأرقام وصفت تتوافق مع وحدة واحدة (1-9). خط الصفر يدل على ما تم تعيين عدد صحيح stereotax. هنا، خط الصفر ما بين 10 و 11 علامات، مشيرا الى ان القراءة هي ما بين 10 و 11. لتحديد الأرقام إلى يمين المكان العشرية، واستخدام علامات على الجانب الأيسر. يتم ترقيم علامات التجزئة على اليسار 0 إلى 10، مع كل تجزئة الخالي من الملصقات التي تمثل فارق واحد من وحدةتلك لأنها المقبل. أيهما من علامات التجزئة على غرار اليسار حتى أفضل مع علامات التجزئة على اليمين يشير في المقام الأول عشري من القراءة تنسيق. هنا، علامة التجزئة على المناظرة اليسار إلى الرقم 9 يصطف مع أفضل علامات الجانب الأيمن التجزئة وبالتالي فإن عشرية هو 9. القراءة النهائية هي 10.9 ملم.
الشكل 4. تغير الوزن بعد الجراحة. يوضح هذا الرسم البياني متوسط (± SEM) وزن الفئران الذي خضع لعملية جراحية التجسيمي (ن = 17) أو لم يكن لديهم لعملية جراحية (ن = 6). اليوم 0 هو اليوم من عملية جراحية. بعد الجراحة، ووزن الفئران انخفض لمدة 2-3 أيام بعد الجراحة وبعد ذلك زادت في جميع أنحاء يوم 5-6.
الشكل 5. Excitotoxic سبيل المثال الآفة. A) وهذه الصورة يظهر اللون البنفسجي cresyl ملون مباين على شريحة الاكليلية 30 ميكرون مع أصلع "بقعة "من آفة NMDA من اللوزة basolateral. السهام البيضاء الخطوط العريضة للآفة. ويمكن مقارنة وعلى الجانب المقابل للشريحة الدماغ التي لا يوجد لديه الآفة. B) وآفة مماثلة من اللوزة النواة المركزية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة التجسيمي المقدمة هنا يسمح لآفة excitotoxic من مناطق الدماغ محددة عن طريق ضخ NMDA. ويمكن تكييف الطرق الأساسية التجسيمي الى بث مجموعة متنوعة من وكلاء الدوائية والبيولوجية بطريقة مواقع محددة. يمكن أيضا أن يتم تكييفها لاستهداف مجموعة متنوعة من مناطق الدماغ، التي يحددها إحداثياتها التجسيمي في دماغ أطلس 12. ويمكن إجراء التكيف مع الأنواع الأخرى مثل الفئران مع معدات مماثلة بنيت للحيوانات أصغر حجما. يتم تحسين هذه الإجراءات لمدة 3 الفئران مو البالغين من العمر، ولكن يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من الأحداث الذين تتراوح أعمارهم من خلال كبار السن. إذا كان يعمل مع الحيوانات الأصغر سنا والتي قد لا تكون ممثلة في أطلس الدماغ القياسية، ويمكن جراحات استكشافية غرس صبغة ملونة تساعد في تحديد موضع إبرة السليم تجريبيا.
بالنسبة للمحققين الذين يحتاجون على المدى الطويل غرس قنية باستخدام جراحة التجسيمي، جيجر وآخرون. 13 فاستاء بروتوكول بديل مع إغلاق شق المناسبة وتعليمات الرعاية اللاحقة. إذا استهداف مناطق صغيرة في المخ هو المطلوب، ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول يوفر وسائل أكثر دقة عن وضع الرأس والتسوية في الجهاز التجسيمي. هذا البروتوكول كما يقدم شق طرق التثبيت التي تسمح نافذة أوسع الجراحية، وغالبا ما يكون ضروريا عند استهداف البنى الجانبية مثل جيش تحرير بلوشستان.
بعد الجراحة، وفقدان الوزن مقارنة مع الحيوانات الشاهدة أمر طبيعي ومتوقع. ويبين الشكل 4 تغير في وزن الفئران الذكور البالغين الذي خضع لعملية جراحية في مقابل الضوابط unmanipulated من الفوج نفسه. ويمكن توقع الفئران لتظهر خسارة الوزن في الأيام الأولى بعد الجراحة 2-3 ثم تبدأ في اكتساب الوزن مرة أخرى بعد 5-6 أيام. يمكن أن أكثر لفترات طويلة وفقدان الوزن تشير إلى عدوى أو غيرها من المشاكل.
في بعض الأحيان، فإن الفئران إزالة مقاطع الجرح لها. إذا شق حكما تلتئم، وهذا لا يمثل مشكلة. إذا لم يلتئم الجرح ومفتوحة، لا بد من استبدال مقطع الجرح إما مع مقطع آخر أو مع الخيوط الجراحية، وكلاهما لا يمكن أن يؤديها تحت التخدير isoflurane. قد تشمل المضادات الحيوية (80-96 ملغ تريميثوبريم السلفا / كغ / يوم، 240 ملغ / 5 مل من الماء) في المياه الصالحة للشرب لمدة 5 أيام القادمة ستكون أيضا ينصح للوقاية من العدوى إذا كان الجرح مفتوحا للبيئة.
ولعل الجانب الأكثر تحديا من هذا البروتوكول هو وضع قضبان الأذن. ويوصى العمليات الجراحية التجريبية مع ضخ صبغة تليها التضحية فوري للتحقق من دقة على حد سواء الأذن وضع شريط وإحداثيات المحدد التجسيمي. إذا كانت منطقة الدماغ لتكون مستهدفة في خط الوسط، ونحن نوصي باستخدام نهج الزاوية من كل من جانبي الدماغ والأوعية الدموية الكبيرة في خط الوسط يمكن ان يمنع توجها مباشرا خط الوسط.
حتى عندما يقوم وكذلك ممكن، سور التجسيميجيري لا يزال ينطوي على التعرض بشكل كبير للالمسكنات وأدوية التخدير، تلف الأنسجة واستجابة جهاز المناعة. كل هذه العوامل قد تؤثر على النتائج التجريبية، وثيقة خاصة إلى وقت الجراحة. يمكن التقليل من الآثار الجانبية للجراحة من خلال السماح لفترة انتعاش كبيرة (ما لا يقل عن أسبوع واحد) قبل البدء في إجراءات تجريبية. قد النهج البديلة مثل بالضربة القاضية الجينية استهدفت يكون من الممكن في الفئران لكن يمكن أن يكون أكثر تعقيدا من عملية جراحية التجسيمي.
وباختصار، فإن الطريقة الموصوفة يسمح لآفة المترجمة من مناطق الدماغ دون الاضرار ألياف عابرة. يمكن تكييفها لأغراض عديدة وغير موثوق بها للغاية ويمكن التحقق منها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل يا CIRM زمالة predoctoral (EDK)، NARSAD جائزة الباحث الصغير (DK)، وجائزة أدمغة NIMH (R01MH087495) (DK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-Methyl-D-aspartic Acid 98% | Fisher Scientific | AC32919-0500 | |
| Dual Lab Standard Stereotaxic w/45 deg. Ear Bars | Stoelting | 51653 | Alternative vendor: Kopf *note of caution: assure compatibility of stereotaxic accessories if purchasing from multiple vendors |
| 10μl SYR SPECIAL (*/*/*) | Hamilton | 701SN | |
| Dremel Moto-Tool | Stoelting | 58600 | Alternative vendor: Kopf |
| Carbide burs, handpiece HP, size 2 | Schein Dental | 2284578 | |
| St–lting 6 Syringe Programmable Pump | Stoelting | 53140 | Alternative vendor: Kopf |
| Stainless Steel 316 Hypodermic Regular Wall Tubing 30 Gauge .0123" OD x .00625" ID x .003" Wall (infusion needle) | Small Parts | HTXX-30R-06-05 | |
| Intramedic PE 20 tubing (infusion tubing) | VWR | 63019-025 | |
| Reflex Clips, 9mm, non-sterile | Kent Scientific Corp. | INS500346 | Alternative vendor: Fine Science Tools |
| Reflex Clip Applier for 9mm clips | Kent Scientific Corp. | 12031-09 | Alternative vendor: Fine Science Tools |
| Curved Hartman hemostat | Fine Science Tools | 13003-10 | |
| London forceps | Fine Sceince Tools | 11080-02 | |
| 2% chlorhexidine solution | Allivet | 30159 | Alternative vendor: PetSolutions |
| 10% povidone iodine solution | CVS | SKU #739575 | |
| Hot bead sterilizer | Harvard Apparatus | 610183 | |
Table 1. Table of specific reagents and equipment. |
|||
References
- Kirby, E. D. Basolateral amygdala regulation of adult hippocampal neurogenesis and fear-related activation of newborn neurons. Mol. Psychiatry. , Forthcoming (2011).
- Goosens, K. A., Maren, S. Contextual and auditory fear conditioning are mediated by the lateral, basal, and central amygdaloid nuclei in rats. Learn Mem. 8, 148-155 (2001).
- Korz, V., Frey, J. U. Bidirectional modulation of hippocampal long-term potentiation under stress and no-stress conditions in basolateral amygdala-lesioned and intact rats. J. Neurosci. 25, 7393-7400 (2005).
- Bhatnagar, S., Vining, C., Denski, K. Regulation of chronic stress-induced changes in hypothalamic-pituitary-adrenal activity by basolateral amygdala. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1032, 315-319 (2004).
- Ikegaya, Y., Saito, H., Abe, K. Attenuated hippocampal long-term potentiation in basolateral amygdala-lesioned rats. Brain Res. 656, 157-164 (1994).
- Ikegaya, Y., Saito, H., Abe, K. The basomedial and basolateral amygdaloid nuclei contribute to the induction of long-term potentiation in the dentate gyrus in vivo. Eur. J. Neurosci. 8, 1833-1839 (1996).
- Carter, R. N., Pinnock, S. B., Herbert, J. Does the amygdala modulate adaptation to repeated stress. Neurosciene. 126, 9-19 (2004).
- Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Basolateral amygdala lesions block the memory-enhancing effects of glucocorticoid administration in the dorsal hippocampus of rats. Eur. J. Neurosci. 9, 76-83 (1997).
- Roesler, R., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Basolateral amgdala lesions block the memory-enhancing effect of 8-Br-cAMP infused into the entorhinal cortex of rats after training. Eur. J. Neurosci. 15, 905-910 (2002).
- Roozendaal, B. Glucocorticoid effects on memory consolidation depend on functional interactions between the medial prefrontal cortex and basolateral amygdala. J. Neurosci. 29, 14299-14308 (2009).
- Kaufer, D. Restructuring the neuronal stress response with anti-glucocorticoid gene delivery. Nat. Neurosci. 7, 947-953 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain: in stereotaxic coordinates-the new coronal set. , Elsevier Academic Press. Burlington, MA. (2004).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).
