特定脑区的兴奋毒性损伤的成年大鼠立体定向手术治疗

Summary

靶向消融特定的大脑区域使用立体坐标excitotoxin输液（S）描述。这项技术也可以适用于其他化学品的输液进入大鼠脑组织。

Abstract

在许多哺乳动物，包括啮齿类动物和人类行为的功能是介导主要由分立的大脑区域。一个常用的方法是雪亮的行为或其他实验结果不同的大脑区域的功能来实现功能的局部消融。在人类中，经常研究与局部脑病变的患者人群赤字，希望揭示的基本功能受损区域。在啮齿类动物中，一个实验能引起特定的大脑区域的病变。

病变可几种方法来实现。电解病变可引起局部损坏，但损坏的多种细胞类型，以及从其他大脑区域发生病变部位附近穿越纤维。诱导细胞类型特异性启动子的基因技术也可能使站点的具体目标。这些技术是复杂的，总是不踏实，取决于目标的大脑区域。 excitot相比之下，采用立体定向手术的好氧病变是不破坏当地的神经胶质细胞或穿越纤维的兴奋性神经元的损毁最可靠，最实用的方法之一。

在这里，我们提出了一个协议的excitotoxin，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA），到基底外侧杏仁核复合体的立体输液。用解剖的迹象，我们应用立体坐标，以确定​​我们的目标的大脑区域的位置，并在上述目标的地方，降低注射针。然后，我们的大脑注入我们excitotoxin，导致附近的神经元的兴奋性死亡。虽然我们选择的实验对象是老鼠，同样的方法可以适用于其他哺乳动物，在设备和坐标进行适当的调整。

这种方法可用于各种不同的大脑区域，包括基底外侧杏仁核^1-6，其他的杏仁核^6，7，8海马，耳鼻喉科orhinal ⁹皮 ​​层和前额叶皮层^10。它也可以用于注入生物化合物，如病毒载体^1，11。基本的立体定位技术也可被改编为更持久的渗透泵植入，允许更长时间暴露在利益的化合物。

Protocol

0.05毫克/千克皮下注射丁丙诺啡镇痛麻醉和镇痛：30分钟前麻醉，注入老鼠。启动30-40毫克/公斤腹腔钠巴比妥麻醉。在这一点上，也进一步镇痛（2毫克/公斤皮下注射）注射阿托品，以防止呼吸衰竭（0.4毫克/千克，皮下）和昔。如果5分钟后，老鼠仍是移动或脚趾掐响应，随后剂量巴比妥钠5毫克/千克（腹腔），直到老鼠对疼痛反应迟钝。在执行的第一个切口，在切口部位注射局部麻醉利多卡因（5毫克/公斤，皮）。初次注射后六至八个小时，0.05毫克/千克皮下注射丁丙诺啡镇痛注入老鼠。注射丁丙诺啡可每6-8小时以后，如果需要，虽然这通常是没有必要的。

重要的是要注意麻醉ç其他形式干扰兴奋性病变。例如，虽然氯胺酮是在啮齿类动物麻醉常用的形式，它可以干扰NMDA诱导的病变，因为它是一种NMDA受体拮抗剂。重要的是要选择一个诱导麻醉的方法，不减少病灶大小。如果需要气体麻醉，最立体的设备，包括这里所描述的，可容纳防毒面具适配器。

注：材料在特定的试剂和设备下面的表进一步描述。

1。泵和Stereotax的的制备

1. 填充用无菌水10μLHamilton注射器，并安装到一个6注射器可编程的泵的球童。确保年底到注射器的活塞泵上的钳制持有。
2. 充液气体消毒用无菌水，用针和1毫升注射器PE20管材。汉密尔顿注射器滑动开放的油管年底，被照顾FUL，以避免产生任何气泡管。
3. 打击30ga，平切，1英寸的油管输液针结束立体定向设备使用桶式电极操纵臂。插入输液针钳和沟槽每桶之间。确保了一个片内含有金属针，避免压扁油管和限制流体流动管钳。
4. > 5μL/ min的调节泵的速度，打开泵。应该出现在输液针的尖端的水珠。检查，以确保没有泄漏的油管及其接头的长度。
5. 珠用无菌棉签擦去水和设置泵撤回。撤回2μL气泡。上面的泡沫应该是在油管可见。
6. 浸入20毫克/毫升无菌0.1M PBS溶液中NMDA受体的输液针头，并撤回4-5微升。应该是无菌水和NMDA受体的解决方案之间的可见气泡在尖。重要的是要注意，NMDA受体是一种强力的毒素，应谨慎使用这一解决方案的编制和处理。在任何时候都手套和保护眼睛的建议。

2。安装在立体定位装置鼠

1. 图1描绘的立体装置的基本组成部分。剃须后大鼠的头部从眼睛，耳朵，加载了老鼠的门牙咬栏，老鼠的身体搁在培养基上设置一个加热垫。应挂咬栏下面的舌头，下颚。如果可以，温度反馈加热垫将是可取的。监测直肠温度也将是理想选择。
2. 用拇指和食指拿着老鼠的脖子，将到右耳栏上的权利的水平耳道。酒吧应该觉得这是在一个坚实的地方休息，不喜欢它下沉到头部。持稳定的头部右侧，滑动左耳扎入老鼠的左水平耳道。应该觉得这是在一个坚实的地方休息。 ，羽片应该对称，应该出现平趴在耳朵上酒吧。向上燃烧的羽片表示耳棒放置不当。头部不应摇晃在脖子上的压力。
3. 拧鼻子酒吧。温柔。在鼻子的骨骼很微妙，鼻栏并不需要紧。检查的老鼠仍是出发前的麻醉。

3。准备手术的大鼠

1. 用消毒棉签，轻轻地放到每个老鼠的眼睛少量的兽医眼科润滑软膏，以保护他们从干燥和碎片。
2. 同心从计划切口部位到剃光地区的边缘，用2％洗必泰溶液擦拭大鼠的头皮，其次70％的乙醇三次。也可以使用，如果需要更有效的消毒剂洗必泰擦洗。完成10％碘伏溶液擦拭。现在准备的头皮是无菌的，应该只用无菌材料感动。
3. 唐无菌手套，作进一步的步骤，因为你将在下准备手术部位的处理。
4. 将无菌的悬垂性，使开窗暴露手术部位。

4。创建外科窗口

1. 用10号手术刀刀片，使头皮的纵向中线沿切口（约2厘米长）。切口应启动后的眼睛。与非惯用手的拇指和食指，按住紧张垂直方向的切口在头皮上。
2. 颅骨表面覆的手术用无菌棉提示网站的边缘拉筋膜。这将需要一些力量，因此它可以被看作清除头骨。
3. 使用四个弯曲，无菌止血创建一个手术的窗口。对EA钳筋膜（皮肤）通道一侧的前部和后部方面的切口，然后躺在旁边的动物夹子，从而拉动打开切口，充分暴露颅骨。

5。练级的头骨和创建的先导孔

1. 找到前囟门，前点头骨的三个主要板块相遇， 如图2所示。将输液针，使针尖刚好接触前囟门颅骨。注意：背腹坐标图3演示了如何读取Stoelting立体设备上的坐标。请注意，在这一点上，手套不再是无菌的，而不应直接接触无菌手术部位。注：触摸立体消毒的设备后，医生不再是无菌的，不应该接触的手术部位，也没有将触摸手术部位的设备零件。
2. 作为depicte定位的lambda，后点头骨的三个主要板块，D 图2。稍微提高了输液针，直背到拉姆达移动它。降低针，直到它刚好接触拉姆达头骨。读背腹坐标。如果头骨是水平的，这将是在0.1毫米，前囟门读数。如果它是进一步又比，移动针（的方式），松开鼻子酒吧，无论是提高或降低咬酒吧平台，根据头端太高，然后重新测量。
3. 移到前囟门的输液针，并记录前，后部和内侧的横向坐标。计算必须移动针的基础上的利益根据一个脑图谱^12的大脑区域的坐标。血乳酸，前后的坐标减去2.8毫米，添加或减去5.1毫米/从内侧的横向坐标，取决于您是否要针对向左或向右。将输液针，以计算出的位置。
4. 图形界面的东东DLE的方式，照顾，以保持它位于轨道，然后钻了孔在用无菌牙钻位，使用1德雷梅尔摩托车工具的位置在直径约2毫米。仔细钻钻时通过头骨打破，往往会拉下，硬脑膜及脑组织下有可能损坏。进行划眼洞放大。
5. 用无菌棉签吸收血液。

6。输液毒素

1. 摆动针进入位置回。降低针，直到它触及大脑表面。记录背腹的坐标。这是的硬膜水平。减去适当的数值，以达到利益的大脑区域。为基底外侧杏仁核，减去6.7毫米，。
2. 计算的水平慢慢降低输液针。然后提高它的备份，以及上述的头骨。用微量注射器将清洗线疏通输液针的尖端，小心，不要到T哎哟线在接触与非无菌手套输液针的末端。
3. > 5μL/ min的泵运行，并确保你看到的液体珠出来的输液针。如果没有，疏通线，并再次尝试。
4. 所需的背/腹水平慢慢降低输液针。
5. 设置为0.1μL/ min的速度对输液泵，并开始输液。注入为2分钟。
6. 一旦已经开始输液气泡在油管用黑色标记，标记的两端。如果两端不动，你的针被堵塞。停止输液，提高针，线的畅通，检查与高流速的流量，重新降低针，并再次尝试。
7. 一旦输液完成后，停泵，并等待5分钟的NMDA弥漫针尖。
8. 提高针0.5毫米，并再次注入1分钟。等待2.5分钟的NMDA弥漫针尖。他这额外输液LPS确保所有的血乳酸输液覆盖。这是否是必要的其他大脑区域必须确定实验。
9. 提高针慢慢的大脑和立体手臂摆动的方式。

7。关闭切口

1. 唐新的无菌手套，关闭切口。
2. 用无菌棉提示擦去头骨上的任何多余的血液，去除筋膜夹。
3. 使用伦敦钳，共同推动双方的切口。应该满足和皮肤的内边缘，卷曲成切口外缘的皮肤不应该被允许。封闭而紧迫的切口，伤口剪辑应用坚决关闭前伸。继续推进沿切口的长度皮肤和主食。这通常需要3-5伤口剪辑。
4. 把所有的伤口剪辑后，使用的镊子，再次掐的主食，并确保他们是安全的。更安全的ţ他剪辑的可能性就越小老鼠会拉出来之前，切口愈合。
5. 拭装订与10％的碘伏溶液，直到流动性恢复（通常1-2小时后，麻醉，手术时间从诱导封30-45分钟），返回到其家笼和显示器大鼠切口。在这一点上，老鼠可能会返回到殖民地室。一个星期后，与异氟醚麻醉下取出主食卸妆工具的主食。
6. 使用热珠的灭菌消毒之前，未来的老鼠上使用的所有仪器尖端表面。沉浸在珠文书应当不超过15秒，或他们可能会变得太热处理。文书应当充分冷却后才能使用其他动物。

8。复苏

1. 这是可能的，老鼠将展现在病变后的天癫痫发作。不同的大脑区域损坏的其他行为，如食品消费或GRO可能会受影响oming。这是重要的动物进行监测，以确保它们保持健康的恢复过程中，每天。支持治疗，如流质食物，高热量的食物，或额外的镇痛，可能需要。麻醉死亡率发生在大鼠，通常小于5％的比例很低。因其他原因死亡（感染，出血）是极为罕见的。麻醉恢复后，遇险的任何迹象排除未来的研究可能会导致，但极为罕见。 图4描述了在手术后的最初几天的减肥，因为它应预期。体重应在1周内反弹。

9。代表结果

NMDA受体输液一个星期或更长时间后，病变可以可视化使用甲酚紫染液和明场显微镜。灌注冰冷的4％多聚甲醛，平衡大脑应在30％蔗糖0.1M PBS和froz恩。然后，他们应该在30-60微米切片，在一系列的1:6到1:12，并安装在之前接受的标准甲酚紫染液明胶涂层玻片。病变相对应的“秃斑”或面积下降甲酚紫染色细胞死亡后病变。 图5A和B代表病灶的血乳酸和CEA。这张照片是平板扫描仪采用了高分辨率扫描（1200 dpi）的获得。以可视化的病变，它可以帮助染液通过一系列节的大部分，所以放错了地方的病变可位于目标区域周围的组织。

图1。立体设置，这个数字显示大鼠脑立体定位与标记的相关部分。

图2。前囟门和lambda对大鼠SKULL。此图描绘的前囟门和lambda的位置。所有的坐标测量相对前囟门。 lambda是用来确保头骨是水平。

图3。阅读立体坐标。这幅画描绘了一个标准的立体阅读。要获取数字的小数位的左侧，使用右侧的标记。标记的数字对应的十位（即1 = 10，2 = 20）。之间的标有数字的散列标记对应的单一单位（1-9）。零线表示什么整数的stereotax设置。在这里，零线之间的10个和11个标记，表示读数是10和11之间。要确定小数点右侧的数字，使用左侧的标记。在左边的哈希标记的编号为0到10，每个无标签代表一个单位的差异，从哈希那些在它旁边。无论左线右侧的哈希标记最多最好的散列标记的坐标读数表示小数点第一位。在这里，左边的对应数9线与右侧的哈希标记最多最好的哈希标记，所以小数位是9。最后的读数为10.9毫米。

图4。手术后的重量变化。该图显示了大鼠接受立体定向手术组（n = 17）的平均（±标准差）重量或没有手术组（n = 6）。 0天是手术的日子。手术后，大鼠体重下降为2-3天，手术后，再增加5-6天左右。

图5。兴奋性病变例如A）此图像显示了30微米的冠状片1甲酚紫染液与“光头当场从NMDA受体病变的基底外侧杏仁核“。白色箭头勾勒出病灶。它可以较对侧没有病变B）一个中央核杏仁核类似病变的脑片。

Discussion

这里介绍的立体定向的方法可以通过注射NMDA受体的特定脑区的兴奋性病变。立体的基本方法，可适应在站点特定的方式注入各种药物和生物制剂。它也可以适应目标的大脑区域的品种，在脑图谱¹²立体坐标定义。小动物建立了类似的设备，可适应其他物种如老鼠。本程序为3月龄成年大鼠进行了优化，但它们可以被用来从青少年通过各种年龄的老年人。如果与年轻的动物，不得在标准脑图谱代表工作，探索手术注入丰富多彩的染料可以帮助确定合适的针安置经验。

为那些需要长期使用，盖革等立体定向手术导管植入的调查^，13个P怨恨一个适当的切口缝合和善后指令的替代协议。但是，如果需要针对更小的大脑区域，应指出的是，本协议的头放置在平整的立体装置提供更精确的方法。本协议还提供了切口夹紧方法，使手术更广泛的窗口，常常需要针对如血乳酸的横向结构。

手术后，减肥相比，控制动物是正常的和预期的。 图4显示了在成年雄性大鼠接受手术与未添加从同一队列的控制体重的变化。可以预期大鼠显示减肥手术后第2-3天，然后开始再次获得后5-6天体重。更长时间的减肥可能表明感染或其他问题。

偶尔，一只老鼠将删除其伤口剪辑。如果切口Ĥ愈合，不会出现问题。如果切口不愈合，是开放的，必须更换伤口剪辑与另一片段或缝线，都可以进行异氟醚麻醉下。包括饮用水中的抗生素（甲氧苄磺胺80-96毫克/千克/天，240毫克/ 5毫升的水）未来5天，也可能是可取的，以防止感染，如果伤口是开放的环境。

也许这个协议中最具挑战性的是耳棒的位置。建议立即牺牲的染料注入实验手术检查两个耳朵栏的位置和选定的立体坐标的准确性。如果有针对性的大脑区域是在中线，我们建议使用一个倾斜的做法，从大脑两侧在中线大血管，可以防止直接中线的方法。

即使执行时尽可能好，立体河畔盖瑞仍然带来沉重的接触和麻醉剂，组织损伤和免疫反应。所有这些因素都可能影响实验结果，尤其是靠近手术时间。允许充足的恢复时间（至少一个星期），才开始实验程序，可以尽量减少手术副作用。是可能的替代办法，如针对性的基因敲除小鼠，但可以比立体定向手术复杂得多。

总之，所描述的方法可以不破坏传递纤维脑区的局部病变。它可以适用于许多用途，是高度可靠和可核查的。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-Methyl-D-aspartic Acid 98%	Fisher Scientific	AC32919-0500
Dual Lab Standard Stereotaxic w/45 deg. Ear Bars	Stoelting	51653	Alternative vendor: Kopf *note of caution: assure compatibility of stereotaxic accessories if purchasing from multiple vendors
10μl SYR SPECIAL (*/*/*)	Hamilton	701SN
Dremel Moto-Tool	Stoelting	58600	Alternative vendor: Kopf
Carbide burs, handpiece HP, size 2	Schein Dental	2284578
St–lting 6 Syringe Programmable Pump	Stoelting	53140	Alternative vendor: Kopf
Stainless Steel 316 Hypodermic Regular Wall Tubing 30 Gauge .0123" OD x .00625" ID x .003" Wall (infusion needle)	Small Parts	HTXX-30R-06-05
Intramedic PE 20 tubing (infusion tubing)	VWR	63019-025
Reflex Clips, 9mm, non-sterile	Kent Scientific Corp.	INS500346	Alternative vendor: Fine Science Tools
Reflex Clip Applier for 9mm clips	Kent Scientific Corp.	12031-09	Alternative vendor: Fine Science Tools
Curved Hartman hemostat	Fine Science Tools	13003-10
London forceps	Fine Sceince Tools	11080-02
2% chlorhexidine solution	Allivet	30159	Alternative vendor: PetSolutions
10% povidone iodine solution	CVS	SKU #739575
Hot bead sterilizer	Harvard Apparatus	610183
Table 1. Table of specific reagents and equipment.