Summary
צ'יק ב electroporation אובו היא טכניקה המאפשרת מניפולציה גנטית של העובר העופות. יישומים נפוצים של טכניקה זו כוללות אנליזה פונקציונלית של גנים המשוערת אלמנטים משפר. וידאו זה מדגים electroporation neural tube אצל ה"ה 10 עוברי אפרוח. טכניקת הזרקת וטיפול נאות ביצה הם דנו.
Abstract
גודל גדול והתפתחות חיצונית של העובר עוף הפכו זמן זה כלי חשוב בחקר הביולוגיה ההתפתחותית. עם כניסתו של שיטות ביולוגיות מולקולריות, האפרוח הפך שימושי מערכת שבה ללמוד ויסות הגנים ותפקוד. עד electroporating בונה DNA או RNA לתוך העובר המתפתח עוף, גנים יכול לבוא לידי ביטוי או הפילו על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo. כמו כן, בונה הכתב יכול לשמש למיפוי גורל או לבחון אלמנטים גנים המשוערת הרגולציה. לעומת ניסויים דומים העכבר, electroporation חומוס יש את היתרונות של להיות מהירה, קלה וזולה. וידאו זה מדגים הראשונה איך לעשות חלון קליפת כדי לתפעל את העובר. בשלב הבא, העובר הוא מדמיין בתמיסה מדוללת של דיו הודו מוזרק מתחת העובר. מחט זכוכית פיפטה משמשים להזריק דנ"א צבען הירוק מהיר לתוך הצינור העצבי המתפתח, אז אלקטרודות פלטינה ממוקמים במקביל העובר ואת פולסים חשמליים קצרים מנוהלים עם גנרטור הדופק. לבסוף, הביצה היא חתומה עם סרט והניח בחזרה באינקובטור להמשך פיתוח. בנוסף, הוידאו מראה אחסון ביצה טיפול נאות ודן גורמים אפשריים electroporation אובדן העובר הבא.
Protocol
ביצה טיפול
- ביצים יכול להיות שמר על 13 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפני הדגירה ללא אובדן משמעותי של הכדאיות (א מקרר יין קטן הוא אידיאלי למטרה זו).
- לפני הדגירה, לאפשר ביצים לחמם לטמפרטורת החדר, ואז מקום תרנגולת humidified חממה מוגדר 37.8 ° C (100 ° F).
- בדרך כלל אנחנו עוברים electroporate כ 48 שעות מתחילת הדגירה, כאשר העובר הגיע לשלב המבורגר המילטון 10.
- זמן הדגירה של עשויים להשתנות בהתאם המבורגר הרצוי בשלב המילטון. טמפרטורה היא ביקורתית חריגה בטמפרטורת הדגירה אופטימלי ישנו זמן דגירה העובר ואת הכדאיות ירידה.
- במהלך הדגירה, ביצים יש לשמור על צדם כך העובר תהיה ממוצבת כהלכה electroporation. העובר יצוף על גבי החלמון ואת כדאי לסמן את החלק העליון של הביצה בעיפרון לפני חלונאית, כך שאתה יודע איפה לקצץ.
הכנה
- חם ליבוביץ L-15 מדיה 37 ° C. משוך זכוכית לתוך הנימים מחטים. מיקום אלקטרודות micromanipulator ולהתחבר אלקטרודות מחולל את הדופק.
Windowing
- בעזרת מזרק עם מחט נשא גדול, לחדור את הקליפה בקצה הקטן של הביצה.
- הצבעה המחט כלפי מטה בזהירות, כדי למנוע שיבוש של החלמון, להסיר כ 5 מ"ל של אלבומין.
- חותם את החור עם חתיכה קטנה של נייר.
- מכסים את החלק העליון של הביצה עם חתיכה נוספת של סרט (כ 4x4 ס"מ).
- בעזרת מספריים מעוקל, והקפידו שלא לשבש את העובר, לחתוך חור גדול מספיק כדי לספק חלון שבו לעבוד.
אופציונלי: כדי להמחיש את בצינור העצבי, להזריק פתרון דיו עם מחט מד 26 מתחת העובר (להכניס מחט תחת העובר מבחוץ הטבעת דם). דיו בהודו יש לדלל 1:05 עם פתרון הנקס או דומה שנאגרו סטרילית.
הזרקת electroporation
- שוברים את קצה נימי לקוטר הרצוי באמצעות פינצטה
- בעזרת פיפטה בפה, לטעון את נימי עם צבע ירוק פלסמיד / מהיר.
- מקם את העובר עם הראש כלפי לך להכניס את המחט לתוך הצינור העצבי בזווית רדוד.
- להזריק את הפתרון הפלסמיד לתוך לומן של הצינור העצבי עד לצבוע ממלא את החלל כולו.
הערה: היזהר לא לקבל טיפ גדול ואז בצינור העצבי קוטר. באופן כללי, תוכל לדעת אם הגודל האופטימלי קצה הושגה על ידי כמה קל או קשה למשוך נוזל לתוך הנימים. אם יש התנגדות קיצוניים, פתיחת הוא כנראה קטן מדי קצה צריך להיות שבור שוב גבוה יותר. אם יש התנגדות קטנה או לא, פתיחת גדול מדי מחט חדשה יש להשתמש.
- מקום 1-2 טיפות של L-15 מדיה סטרילי על העובר.
- מיד למקום אלקטרודות משני צידי העובר, במקביל הצינור העצבי, והדופק 5 פעמים ב 10-24 וולט עבור 50 mseconds ב 1 במרווחים השני. אתה תראה בועות ליד האלקטרודות אם זה עבד כראוי.
- מוציאים בזהירות אלקטרודות, לשים 5 טיפות של L-15 על גבי העוברים ואת החותם את הביצה עם הקלטת. ודא ביצה אטום היטב, כמו ייבוש הוא התורם העיקרי לאובדן העובר הבאים electroporation.
- מניחים ביצים לתוך האינקובטור, בצד החלון למעלה, לדגור עד שהם מגיעים הרצוי H & H הבמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק צעד אחר צעד מדריך כדי electroporation בצינור העצבי של HH10 עוברי אפרוח. בנוסף מראה את הטכניקה, הנחיות לאחסון וטיפול ביצים הוא גם סיפק. טכניקה זו יש מגוון רחב של יישומים עבור ניתוח גנטי ואת עלות נמוכה וקלות של ניסויים גורם להם ריאלי עבור מעבדות רבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken egg incubator | humidified, set to 37.80°C (100F). | ||
| Pulse generator | Genetronics | BTX T820 | Square wave generator or comparable |
| Electrodes | our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart | ||
| Connecter cables | |||
| Micromanipulator | |||
| Dissecting scope | with large working distance | ||
| Glass capillaries | and capillary puller or commercial glass needles | ||
| Leibovitz’s L-15 media | |||
| chicken eggs | fertilized | ||
| Curved scissors | |||
| 10 ml syringe | |||
| Large bore needle | 16-18G | ||
| Mouth pipette | |||
| India ink | |||
| Insulin syringe/syringe | |||
| Plasmid DNA | ≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye |
References
- 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
