Summary
비켜 electroporation의 여자는 조류 배아의 유전자 조작을 허용하는 기법입니다. 이 기법의 일반적인 응용 프로그램은 유전자와 putative 향상제 요소의 기능 분석을 포함합니다. 이 동영상은 HH 10 여자는 배아에서 신경 튜브 electroporation을 보여줍니다. 사출 기술과 적절한 계란 처리는 설명합니다.
Abstract
대형 크기와 닭 배아의 외부 개발 오래 발달 생물학 연구에 가치있는 도구가 만들었습니다. 분자 생물 학적 기법의 도래와 함께, 여자가 유전자 조절과 기능을 연구하는 유용한 시스템이되고있다. 개발 닭 배아에 DNA 또는 RNA 구조를 electroporating함으로써, 유전자는 명시적 또는 생체내 유전자 기능의 분석을 위해 무너뜨렸다 수 있습니다. 마찬가지로 기자의 구성은 운명 매핑에 사용할 수 또는 putative 유전자 규제 요소를 검사합니다. 마우스에서 유사한 실험에 비해, 여자의 electroporation은 빠르고 쉽고 저렴한되는 장점이 있습니다. 이 비디오는 배아를 조작하기 위해 달걀 껍질에 창문을 만드는 방법 첫째 보여줍니다. 다음, 난자는 배아 아래 주입 인도 잉크의 희석 용액과 시각이다. 유리 바늘과 피펫은 개발 신경 튜브 다음, 백금 전극이 배아로 병렬 배치하고 짧은 전기 펄스가 펄스 발생기와 함께 관리되는에 DNA와 빠른 그린 염료를 주입하는 데 사용됩니다. 마지막으로 계란은 테이프로 밀봉하고 발전을위한 인큐베이터에 다시 배치. 또한, 비디오 적절한 계란 보관 및 처리를 보여줍 배아 손실 다음의 electroporation의 가능한 원인에 대해 설명합니다.
Protocol
에그 처리
- 계란이 생존에 상당한 손실 (작은 와인 쿨러는 이러한 용도에 이상적입니다)없이 부화하기 전에 최대 1 주일 13 ° C에 보관 수 있습니다.
- 이전 부화하기 위해 달걀이 인큐베이터는 37.8로 설정 humidified 닭고기에 다음 상온, 장소에 따뜻한 있도록 ° C (100 ° F).
- 우리는 일반적으로 배아가 햄버거와 해밀턴 단계 10에 도달 인큐베이션의 시작에서 태아에게 약 48 시간 electroporate.
- 부화의 시간 원하는 햄버거와 해밀턴 단계에 따라 다를 수 있습니다. 온도가 최적 배양 온도에서 중요하고 편차 것은 배양 시간 및 감소 배아 생존을 변경합니다.
- 부화 기간 동안, 계란은 배아가 제대로 electroporation에 대한 위치를되도록 자신의 양쪽에 보관해야합니다. 난자는 노른자 위에 떠되며 어디자를 알고 그래서 윈도우 전에 연필로 계란의 맨 위에 표시하기 위해 도움이됩니다.
준비
- 37 ° C.에 따뜻한 Leibovitz L - 15 미디어 바늘에 유리 모세관을 당기세요. 위치 전극과 micromanipulator 및 펄스 발생기에 전극을 연결합니다.
윈도우
- 피어스 계란의 작은 끝에 껍질, 큰 구멍 바늘로 주사를 사용합니다.
- 노른자의 중단을 방지하기 위해 조심스럽게 아래 바늘 가리키며, 알부민의 5ml에 대한 제거합니다.
- 테이프의 작은 조각으로 구멍을 밀봉합니다.
- 테이프의 또 다른 조각 (4X4 cm 정도)와 계란의 상단 커버.
- 곡선 가위를 사용하고 배아를 방해하지를 돌보는 작업에 창문을 제공하기 위해 충분 큰 구멍을 뚫고.
옵션 : 신경 튜브를 시각화하려면, 배 (胚) 아래에 26 게이지 바늘 (혈액 링 밖에서 배아 아래에 바늘을 삽입)와 잉크 솔루션을 주입. 인도 잉크는 행크스 또는 유사한 살균 버퍼 솔루션 1시 5분 희석해야합니다.
사출 및 Electroporation
- 핀셋을 사용하여 원하는 직경으로 모세관 팁을 브레이크
- 입 피펫을 사용하여 플라스미드 / 빠른 그린 염색과 모세를로드합니다.
- 여러분쪽으로 머리와 배아를 위치와 얕은 각도로 신경 튜브에 바늘을 삽입합니다.
- 염료가 전체 공간을 채우고까지 신경 튜브의 루멘에 플라스미드 솔루션을 주사.
참고 : 다음 끝 큰 신경 튜브 직경을하지 않도록주의하십시오. 일반적으로 최적의 팁 크기는 모세관에 액체를 뽑아 얼마나 쉽게 또는 하드에 의해 달성되었는지 말할 수있을 것입니다. 극단적인 저항이있다면, 시작은 아마도 너무 작습니다 그리고 끝까지 높은 망가해야합니다. 거의 또는 전혀 저항이있다면, 오프닝이 너무 큽니다 새로운 주사 바늘을 사용해야합니다.
- 배아에서 멸균 L - 15 미디어의 장소는 1-2 방울.
- 당장 1 초 간격으로 50 mseconds 위해 10-24 볼트의 신경 튜브에 평행 배아의 양쪽에 전극, 및 펄스 5 번 놓으십시오. 그것이 제대로 작동하면 전극 근처에 거품을 볼 수 있습니다.
- 조심스럽게, 전극을 제거 배아 위에 L - 15의 5 방울을 넣고 테이프로 계란을 밀봉. 건조가 electroporation 다음 배아 손실에 비만으로 계란이 잘, 밀봉되어 있는지 확인합니다.
- 인큐베이터에 다시 플레이스 계란, 창 측면까지, 그들이 H & H 단계를 원하는 도달할 때까지 알을 품다.
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Discussion
이 프로토콜은 HH10 여자는 태아의 신경 튜브 electroporation 단계 가이드에 의해 단계를 제공합니다. 기술을 보여주는 이외에도, 스토리지 및 계란의 취급에 대한 지침도 제공됩니다. 이 기술은 유전자 분석을위한 어플 리케이션의 광범을 가지고 있으며, 실험의 용이성과 낮은 비용으로 많은 실험실 위해이 가능합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken egg incubator | humidified, set to 37.80°C (100F). | ||
| Pulse generator | Genetronics | BTX T820 | Square wave generator or comparable |
| Electrodes | our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart | ||
| Connecter cables | |||
| Micromanipulator | |||
| Dissecting scope | with large working distance | ||
| Glass capillaries | and capillary puller or commercial glass needles | ||
| Leibovitz’s L-15 media | |||
| chicken eggs | fertilized | ||
| Curved scissors | |||
| 10 ml syringe | |||
| Large bore needle | 16-18G | ||
| Mouth pipette | |||
| India ink | |||
| Insulin syringe/syringe | |||
| Plasmid DNA | ≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye |
References
- 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
