Summary
Чик в ово электропорации это техника, которая позволяет генетические манипуляции птичьего эмбриона. Общие применения этого метода относятся функциональный анализ генов и предполагаемых элементов усилителя. Это видео демонстрирует нейронных электропорации трубки в HH 10 куриных эмбрионов. Техника инъекций и надлежащее обращение с яйцом обсуждаются.
Abstract
Большой размер и внешний развития куриного эмбриона уже давно сделали его ценным инструментом в изучении биологии развития. С появлением молекулярно-биологических методов, цыпленок стал полезной системой, в которой для изучения регуляции генов и функции. По electroporating ДНК или РНК конструкции в развивающихся куриных эмбрионов, гены могут быть выражены или сбит с целью анализа в функции гена естественных условиях. Аналогичным образом, репортер конструкций может быть использован для отображения судьбы или для изучения предполагаемых генов регуляторных элементов. По сравнению с аналогичными экспериментами в мыши, птенец электропорации имеет преимущества быть быстрым, простым и недорогим. Это видео демонстрирует первых, как сделать окно в яичной скорлупе манипулировать эмбриона. Затем эмбрион визуализируется с разбавленным раствором тушь вводили ниже эмбриона. Иглой стекло и пипетки используются для введения ДНК и быстрый зеленый краситель в развивающихся нервной трубки, то платиновые электроды расположены параллельно эмбриона и короткие электрические импульсы вводятся с генератора импульсов. Наконец, яйцо запечатанных скотчем и положил обратно в инкубатор для дальнейшего развития. Кроме того, видео показывает правильное хранение и обращение с яйцом и обсуждаются возможные причины эмбриона электропорации следующие потери.
Protocol
Яйцо обработке
- Яйца можно хранить при температуре 13 ° С не более одной недели до инкубации без значительной потери жизнеспособности (небольшой кулер вино идеально подходит для этой цели).
- До инкубации яиц позволяют нагреться до комнатной температуры, затем поместить в увлажненной куриный инкубатор набор до 37,8 ° C (100 ° F).
- Мы обычно electroporate эмбрионов около 48 часов от начала инкубации, когда эмбрион достиг Гамбургер и Гамильтон этапе 10.
- Время инкубации может меняться в зависимости от желаемого Гамбургер и Гамильтон стадии. Температура имеет большое значение и отклонение от оптимальной температуры инкубации изменит времени инкубации и жизнеспособность снижение эмбриона.
- Во время инкубации, яйца должны храниться на боку так, что эмбрион будет правильно позиционируется для электропорации. Эмбрион будет плавать сверху желтком и было бы полезно, чтобы отметить начало яйцо с карандашом перед оконной, чтобы вы знали, где резать.
Подготовка
- Теплый Лейбовиц L-15 средств массовой информации до 37 ° C. Вытяните стеклянных капилляров в иглы. Позиция электродов и микроманипулятора и подключения электродов генератора импульсов.
Windowing
- Использование шприц с иглой большого диаметра, прокалывают оболочку на маленький конец яйца.
- Указывая иглу осторожно вниз, чтобы предотвратить нарушение желток, удалите около 5 мл альбумина.
- Печать дыра с небольшой кусочек ленты.
- Обложка верхней части яйца с другой частью ленты (около 4х4 см).
- Использование изогнутые ножницы, и стараясь не нарушить эмбриона, вырезать отверстие достаточно большой, чтобы обеспечить окно, в котором к работе.
Дополнительно: Для визуализации нервной трубки, инъекционные чернил решение с 26 иглы под эмбриона (вставить иглу под эмбриона из-за пределов крови кольца). Тушь следует разбавить 1:5 Хэнкса или сопоставимой стерильный буферный раствор.
Инъекции и Электропорация
- Перерыв капиллярного кончика желаемого диаметра с помощью пинцета
- Использование рот пипеткой, нагрузка капилляр с плазмиды / Быстро зеленый краситель.
- Позиция эмбриона с головы по направлению к себе и вставьте иглу в нервной трубки под небольшим углом.
- Inject плазмиды раствора в просвет нервной трубки, пока краска заполняет все пространство.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не иметь наконечник больше, то нейронные диаметра трубы. В общем, вы сможете узнать, есть ли оптимальный размер наконечника была достигнута насколько легко или трудно тянуть жидкость в капилляр. Если есть крайняя устойчивость, открытие, вероятно, слишком мал, и кончик должен быть разбит еще раз выше. Если нет или почти никакого сопротивления, открытия слишком велик, и новая игла должна быть использована.
- Место 1:59 капли стерильные L-15 средств массовой информации на эмбрион.
- Сразу же месте электродами по обе стороны от эмбриона, параллельно нервной трубки, и пульс 5 раз в 10-24 вольт на 50 mseconds интервалом в 1 секунду. Вы увидите пузырьки вблизи электродов, если он работал должным образом.
- Осторожно снимите электроды, поставить 5 капель L-15 в верхней части эмбрионов и печатью яйцо с лентой. Убедитесь, что яйца хорошо запечатаны, как сушка одной из основных причин потери эмбриона следующие электропорации.
- Место яйца обратно в инкубатор, окна вверх, и инкубировать пока они не достигают желаемого H & H стадии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол обеспечивает пошаговое руководство для нейронных электропорации трубки HH10 куриных эмбрионов. В дополнение к показу техники, рекомендации по хранению и обработке яиц также предоставляется. Эта методика имеет широкий спектр применения для генетического анализа, а легкость и низкая стоимость экспериментов делает их возможным для многих лабораториях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken egg incubator | humidified, set to 37.80°C (100F). | ||
| Pulse generator | Genetronics | BTX T820 | Square wave generator or comparable |
| Electrodes | our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart | ||
| Connecter cables | |||
| Micromanipulator | |||
| Dissecting scope | with large working distance | ||
| Glass capillaries | and capillary puller or commercial glass needles | ||
| Leibovitz’s L-15 media | |||
| chicken eggs | fertilized | ||
| Curved scissors | |||
| 10 ml syringe | |||
| Large bore needle | 16-18G | ||
| Mouth pipette | |||
| India ink | |||
| Insulin syringe/syringe | |||
| Plasmid DNA | ≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye |
References
- 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
