Summary
פרוטוקול זה מאפשר לזהות את הגורמים לווסת את תפקודי התא המוני ביתא למצוא מטרות טיפוליות אפשריות לטיפול בסוכרת. פרוטוקול מורכבת השיטה יעילה להעריך איון שכפול של התא פונקציה בטא עכברוש איים מבודדים בעקבות מניפולציה של ביטוי גנים עם adenoviruses.
Abstract
הומאוסטזיס הגלוקוז נשלטת בעיקר על ידי אינסולין האנדוקרינית ההורמונים גלוקגון, המופרש מן הלבלב ביתא מתאי אלפא, בהתאמה. מסת התפקוד תא הבטא נקבעת על ידי מסת תאים אנטומי בטא, כמו גם את יכולתם של תאים בטא להגיב עומס התזונתי. אובדן מסת בטא תפקודית תא מרכזי שני צורות עיקריות של סוכרת 1-3. ואילו ירידה תפקודית תאים בטא תוצאות המונית התקפה אוטואימונית סוכרת מסוג 1, סוכרת מסוג 2, הפחתה זו מפתחת גם מחוסר היכולת של תאים בטא להפריש אינסולין כראוי והרס תאים בטא מתוך קאדר של מנגנונים. לפיכך, המאמצים לשקם תא תפקודית המוני ביתא הם עליונה לטיפול טוב יותר ותרופות פוטנציאל לסוכרת.
נערכים מאמצים לזהות מסלולים מולקולריים, שניתן לנצלן כדי לעורר את השכפול ולשפר את תפקוד תאים בטא.באופן אידיאלי, מטרות טיפוליות תשפר גם את גדילת התאים לתפקד בטא. אולי חשוב יותר אף היא לזהות אם האסטרטגיה מעורר צמיחת תאים בטא מגיע במחיר של תפקוד התא ופגיעה בטא (כמו עם אונקוגנים מסוימים), ולהיפך.
על ידי ביטוי בדיכוי שיטתי או overexpressing של גני מטרה של איים מבודדים חולדה, אפשר לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאל הגדלת מסת תאים פונקציונלית בטא 4-6. וקטורים adenoviral יכול להיות מועסק על חלבונים overexpress ביעילות או מציאה של איים מבודדים 4,7-15 חולדה. כאן, אנו מציגים שיטה לתפעל ביטוי גנים ניצול התמרה adenoviral ולהעריך איון שכפול של התא פונקציה בטא עכברוש איים מבודדים (איור 1). בשיטה זו נעשה שימוש בעבר כדי לזהות מטרות חדשות, כי לווסת את שכפול התא בטא או פונקציה 5,6,8,9,16,17.
Protocol
1. פרידמן וקיבל הד עולמי culturing adenoviral של איי עכברוש
- הכן 6-גם רקמת לא הצלחת התרבות מצופה על ידי הוספת 2 מ"ל של התקשורת (RPMI 1640 Media המכילים גלוקוז 8 מ"מ, 10% בסרום שור עוברית, 50 יחידות למ"ל פניצילין, ו 50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין) למספר הנדרש של וולס. לדוגמה, בניסוי טיפוסי עשוי לדרוש משלוש בארות - אחד עבור כל וירוס, בקרת וירוס (למשל, ה-GFP-להביע adenovirus), וכן קבוצת הניסוי.
- לחמם את הצלחת כדי 37 מעלות צלזיוס ידי הצבתו בתוך רקמת התרבות בחממה דקות לפחות 30.
- מיד לאחר איון עכברוש בידוד 18,19, במקום 100-200 איים לתוך בארות בודדים של צלחת רקמות בלתי-6-גם תרבות מצופה. איים שישים נדרשים עבור הפרשת אינסולין ההתאגדות מבחני תימידין. איים הנותרים ניתן להשתמש לצורך בידוד RNA לביטוי מחקרים גנטיים או בידוד חלבון עבור immunoblotting.
[הערה: מכאן ואילך, בצע פרוטוקולים מוסדיים לטיפול, שימוש וסילוק של חומרים ביולוגית מסוכנת.]
- מערבולת בעדינות את הצלחת להביא את איים למרכז גם.
- פיפטה adenovirus ישירות על גבי איים במרכז צלחת. השתמש 100-500 multiplicities של זיהום (משרד הפנים, היחס בין התאים היעד ל פלאק יוצרי יחידות ויראלי).
- תן את שאר איים דקות 5.
- מניחים את הצלחת התרבות רקמת אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
- לאחר 24 שעות, מערבולת בעדינות את הצלחת להביא את איים למרכזי הבארות ולהעביר את איים באמצעות micropipette P200 ל באר חדשה ובה התקשורת טריים. אם איים להתקשר לצלחת, הם יכולים להיות וחילצה בעדינות עם קצה פיפטה.
[הערה: כדי לוודא efficien התמרה נאותהסי, את השימוש של ה-GFP השליטה וירוס ביטוי מועיל, כמו איים לאחר מכן ניתן צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal לאמת את חדירת adenovirus לתוך הליבה איון.]
- תרבות איים עבור שעות נוספות 24-72, תלוי העיתוי הרצוי של הניסוי ממחקרים טייס אופטימיזציה. כך, למשל, אינדוקציה של תגובת שגשוג עשוי לדרוש הזמנים החל 24-72 שעות או מציאה של הגן של עניין עשוי לדרוש 48 או 72 שעות. להעביר את איים למדיה טריים מדי יום.
- עבור H 24 הסופי של הניסוי, תרבות איים בתקשורת המכילים 1 μCi [מתיל-3 H] -thymidine/ml התקשורת (בדרך כלל 1 μl תימידין / מ"ל התקשורת).
[הערה: מכאן ואילך, בצע פרוטוקולים מוסדיים לטיפול, שימוש וסילוק של חומרים רדיואקטיביים.]
2. הפרשת אינסולין Assay
- להכין אתassay הפרשת חיץ (SAB) פתרון המניות 10X (1.14 M NaCl, KCl 47 מ"מ, 12 מ"מ KH 2 PO 4, 11.6 mM MgSO 4) ו - CaCl 2 פתרון המניות 100x (0.25 מ 'CaCl 2). פתרונות אלו המניות עשוי להיות מוכן מראש ולאחסן בטמפרטורת החדר.
- טרי להכין 50 מ"ל של SAB עבודה (5 מ"ל של SAB 10X, 1 מ"ל של 1 HEPES M, 0.5 מ"ל של 100x CaCl 2, 0.28 מ"ל של BSA 35%, 0.11 גרם NaHCO 3, מים סטריליים עד 50 מ"ל) ב 50 מ"ל חרוטי הצינור חמים 37 ° C על ידי הצבת ב 37 ° C waterbath.
- פיפטה 10 מ"ל של SAB עבודה לתוך צינור של 15 מ"ל חרוטי ולהוסיף 66.8 μl של 2.5 גלוקוז-D M להכין גלוקוז גבוהה (16.7 mM) SAB.
- הוסף 44.8 μl של 2.5 גלוקוז-D M כדי מ"ל 40 הנותרים של SAB לעבוד כדי להכין גלוקוז נמוכה (2.8 מ"מ) SAB.
- שלושה תווית 1.7-מ"ל microcentrifuge צינורות עבור כל אחד גם צלחת 6-גם ולהוסיף 1 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). [הערה: איים הם רדיואקטיבי, בצע פרוטוקולים מוסדיים לטיפול, שימוש וסילוק של חומרים רדיואקטיביים.]
- מניחים 20 איים לתוך צינור אחד microcentrifuge. נעשה כל ניסיון להוסיף איים בגודל comparably לצינור כל microcentrifuge. כך, למשל, צינור זה עשוי להכיל 5 בינוני, קטן, 10 ו -5 גדולה בגודל איים (ראה איור 1).
- לאחר איים התיישבו על החלק התחתון של הצינור על ידי כוח הכבידה (~ 2 דקות), לשאוב PBS עם micropipette וזורקים.
- על דגירה מראש, הוסף 400 μl של Glu נמוכהcose SAB, למקם את צינורות (עם כובעי שלהם פתוח) אל התרבות רקמת אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2), מראש דגירה של 60 דקות. Aspirate מראש הדגירה גלוקוז SAB נמוך וזורקים.
- על הפרשת האינסולין הבזאלי, הוסף 400 μl של גלוקוז SAB נמוך, למקם את צינורות (עם כובעי שלהם פתוח) אל התרבות רקמת אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2), דגירה של 60 דקות. איסוף SAB גלוקוז נמוכה ולשמור על radioimmunoassay אינסולין.
- על הפרשת אינסולין מגורה, הוסף 400 μl של SAB גלוקוז גבוהה, למקם את צינורות (עם כובעי שלהם פתוח) אל התרבות רקמת אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2), דגירה של 60 דקות. איסוף SAB גלוקוז גבוהה ולשמור על radioimmunoassay אינסולין.
- הוסף 1 מ"ל PBS, לאחר איים התיישבו על החלק התחתון של הצינור על ידי כוח הכבידה, לשאוב PBS עם micropipette, למחוק, ולחזור על זהלדרוך פעם אחת.
- הוסף 500 μl קרח קר חומצה Trichloroacetic (TCA, 10% w / v) ו - דגירה על קרח למשך 30 דקות.
- בצנטריפוגה צינורות ב 000 XG 16 דקות 3 על 4 ° C.
- Aspirate TCA, הוסף 80 μl של 0.3 N NaOH, ו דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך תקופה זו, מערבולת במרץ דגימות של 5-10 עבור כל 10 דקות.
- הוסף 4 מ"ל של קוקטייל Econo כספת לספור עד 7 מ"ל נוזל צינורות נצנץ הספירה.
- הוסף 50 μl של המדגם כדי צינור הנצנץ ספירה, מכסה את הצינור, ללחוץ בקצרה, ולספור על הדלפק נצנץ נוזלי.
- למדוד את ריכוז החלבון באמצעות חומצה assay bicinchoninic (BCA) ו - 10 μl של מדגם לפי הפרוטוקול של היצרן.
- בצע radioimmunoassay אינסולין בעקבות פרוטוקול של היצרן.
- לנרמל את הפרשת האינסולין ושילוב נתונים תימידין קונצרט כלשהו עם חלבוןentration.
[הערה: איי ניתן דמיינו באמצעות אחת stereoscope לנתח או מיקרוסקופ רגיל.]
[הערה: כחלופה ליישוב על ידי כוח המשיכה, את הצינורות ניתן centrifuged ב XG 300 דקות 1.]
3. התאגדות תימידין Assay
4. ניתוח נתונים
5. נציג תוצאות
למשל הניסוי להעריך איון שכפול של התא פונקציה בטא איים חולדה מוצג באיור 2. דוגמה זו מראה כי overexpression adenoviral של "גן # 6" היפותטית וחסונה מגרה שכפול איון מבלי לשנות את תפקוד התא בטא. בלוח העליון, התוצאות assay שילוב תימידין להוכיח כי הגברת הביטוי של "גן # 6" מגביר סינתזה של DNA, כפי שנמדד על ידי שילוב של תימידין. כי רוב התאים איון עכברוש הם תאים בטא, סביר להניח כי עלייה זו מצביעה על שילוב תימידין עלייה שכפול התא בטא. עם זאת, ניסויים מאשרות יש לבצע ביסוס זה. בלוח התחתונה, התוצאות assay הפרשת אינסולין להוכיח כי ביטוי יתר של "גן מס '6" לא שינה אחד התפקידים העיקריים תא בטא, כלומר, אניnsulin על הפרשת גלוקוז נמוך וגבוה. איכות הבידוד איון והבריאות של איים בעקבות טיפול adenoviruses מצוין על ידי עלייה של פי הפרשת אינסולין בריכוזים גלוקוז נמוך וגבוה. אם מגדילים את ביטוי "# 6 ין" תפקוד לקוי תא הבטא, זה עלול לבוא לידי ביטוי כמו ירידה האינסולין מופרש על ריכוזי גלוקוז גבוהות, גירוי (16.7 mM). עקומת מנה תגובה עבור ריכוזים שונים הגלוקוז יכולה גם להתבצע.
באיור 1. סקירה כללית של פרוטוקול להעריך שכפול איון ותפקוד התא בטא עכברוש איים מבודדים בעקבות adenoviral בתיווך שינויים בביטוי הגנים. איים מבודדים עכברים שזה עתה נחשפים adenoviruses במשך 24 שעות ולאחר מכן בתרבית עד 96 שעות. שילוב תימידין מוערך ב 24 שעות הסופי, ואחריו המדידה של הפרשת אינסוליןנמוך וגבוה גלוקוז.
איור 2. תוצאות הניסוי באמצעות adenovirus מלאה adenovirus overexpressing גן היפותטי שכותרתו "גן # 6". הפאנל העליון מציג שילוב תימידין ואת הפאנל התחתון הפרשת אינסולין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מסלולים הקובע כי יכול להיות מאופנן כדי לעורר את השכפול ולשפר את תפקוד תאים בטא רלוונטיים בשתי צורות עיקריות של סוכרת. בגלל המסה התפקודית תא בטא תלויה בקיומו והתפקוד של האינסולין בתאים, להערכת הגורמים הללו בעת ובעונה אחת יש יתרונות משלה. פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול יעיל לזיהוי אם ביטוי יתר או דיכוי של חלבון גורמת לשינויים המוני ביתא תפקודי התא במבחנה, אז מה שיכול להיבדק על יעילות in vivo.
מגבלה אחת של פרוטוקול זה הוא איון הוא איבר מיקרו המורכב של סוגי תאים רבים, כולל אך לא רק אלפא, בטא, דלתא, אפסילון, ותאי PP. שינוי שכפול איון לא יכול לתרגם לחלוטין לשינוי שכפול התא בטא, כי 80-90% מכלל התאים איון עכברוש הם תאים בטא. האפשרות לשינוי שנצפה איוןשכפול נובע שכפול ללא בטא תא קיים. לכן, הצעד הבא ההגיוני מאשרות לפרוטוקול זה יכול להיות בחינת שכפול התא בטא לשימוש אנלוגים תימידין מצמידים את immunofluorescence או ניתוח FACS 5,6. ניתוח זה יכול גם להקל על מאשרות את החשש הפוטנציאל של שילוב שאינו ספציפי תימידין אל איים עצמאיים של התפשטות.
חיסרון נוסף טמון פוטנציאל יעילות התמרה של adenoviruses. יעילות התמרה של 60-70% היא סבירה להשיג, אבל הקובע העיקרי של יעילות הוא העיתוי של התמרה adenoviral. זה חיוני לתרבות איים מבודדים את adenoviruses בהקדם האפשרי על מנת למקסם את יעילות התמרה. תוך שעות ספורות לאחר בידוד איון איון מתחיל להתכווץ, ובכך להגביל את יכולתם של adenovirus לחדור עמוק לתוך הליבה של איון. השימוש מבנה הכתב, כגוןGFP adenovirus להביע, יחד עם מיקרוסקופיה confocal עשוי להיות מועיל להערכת יעילות התמרה.
היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם: 1) את היעילות של בדיקת הגורמים רבות של המוני ביתא תפקודית התא על הבריכה זהה של איים ו 2) את מספר קטן של איים הנדרשים כדי לבצע את הפרוטוקול (בידוד טיפוסי איון עכברוש מניב כ -400 איים) . יתרונות אלה מאפשרים בפרוטוקול זה כדי לשמש ככלי מיון עבור גנים רבים בקצב מתון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק DK078732 מ-NIH (עד פורומים בעברית).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR | |
References
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).
- Keenan, H. A. Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study. Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).
- Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans. Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).
- Fueger, P. T. Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function. Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).
- Schisler, J. C. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).
- Chan, C. B. Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets. Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53, 149-159 (2004).
- Icyuz, M. Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1. Transplantation. 87, 821-824 (2009).
- Kaneto, H. Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).
- Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O'Doherty, R. M., Newgard, C. B. Metabolic engineering with recombinant adenoviruses. Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).
- Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O'Doherty, R. M. Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells. Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).
- Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels. J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).
- Csete, M. E. Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function. Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).
- Csete, M. E. Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors. Transplantation. 59, 263-268 (1995).
- Meng, Z. X. Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest. Diabetologia. 52, 125-135 (2009).
- Ronnebaum, S. M. A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion. J. Biol. Chem. , (2006).
- Milburn, J. L. Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids. J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).
- Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. Murine Pancreatic Islet Isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
