Summary
Bu protokol bir diyabet tedavisi için terapötik hedefleri bulmak için işlevsel beta hücre kitlesi modüle faktörleri belirlemek sağlar. Protokolü adenovirüsler ile gen ekspresyon manipülasyonu takiben izole sıçan adacıklarında adacık çoğaltma ve beta hücre fonksiyonu değerlendirmek için modern bir yöntem oluşur.
Abstract
Glikoz homeostazı, öncelikle, sırasıyla, pankreas beta ve alfa hücrelerden salgılanan, endokrin hormonlar insülin ve glukagon tarafından kontrol edilir. Fonksiyonel beta hücre kütlesi anatomik beta hücre kütlesi gibi bir besin yük yanıt beta hücrelerinin yeteneği ile belirlenir. Işlevsel beta hücre kitlesi kaybı diyabet 1-3 iki büyük formlar merkezidir. Tip 1 diyabetin otoimmün bir saldırı azalan işlevsel beta hücre kitlesi sonuçları ise, tip 2 diyabet, bu eksiltme uygun insülin salgılamaya beta hücrelerinin bir yetersizlik ve mekanizmalar bir kadro beta hücrelerinin yok hem de gelişir. Böylece, işlevsel beta hücre kitlesi geri çabaları daha iyi tedavi ve diyabet için potansiyel tedavileri için her şeyden vardır.
Çabaları çoğaltma teşvik ve beta hücrelerinin işlevini geliştirmek için kullanılabilir moleküler yolları belirlemek için çalışmalar devam etmektedir.İdeal olarak, tedavi hedefleri beta hücre büyümesi ve fonksiyonu hem de artıracak. Ancak belki de daha önemli beta hücre büyümesini uyarır bir strateji zedeleyen beta hücre fonksiyonu (bazı onkogenler olduğu gibi) ve tam tersi pahasına geliyor olmadığını belirlemektir.
Izole sıçan adacıklar hedef genlerin sistematik baskılayarak veya aşırı ifadesi olarak, bir artan işlevsel beta hücre kitlesi 4-6 için potansiyel tedavi hedefleri belirleyebilir. Adenoviral vektörler izole sıçan adacıklar 4,7-15 verimli olarak artmış veya demonte proteinlerine istihdam edilebilir. Burada, adenoviral transdüksiyon kullanarak gen ekspresyon işlemek ve izole sıçan adacıklar (Şekil 1) adacık çoğaltma ve beta hücre fonksiyonu değerlendirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, beta hücre çoğaltma veya fonksiyon 5,6,8,9,16,17 modüle yeni hedefler belirlemek için daha önce kullanılmıştır.
Protocol
1. Sıçan Adacıklar ve adenoviral İletimi ve Kültürleme
- Gerekli sayıda ortam, 2 ml (8 mM glikoz,% 10 fetal bovin serumu, 50 ünite / ml penisilin ve 50 ug / ml streptomisin içeren RPMI 1640 ortamı) ilave edilerek bir 6-sıra non-doku kültürü plakası kaplamalı hazırlamak kuyu. No-virüsü kontrolü için tek her biri, bir virüs kontrolü (örn., GFP-eksprese adenovirüs) ve deney grubu - Örneğin, tipik bir deneyde, üç kuyu gerektirebilir.
- En azından 30 dakika için bir doku kültürü inkübatöründe yerleştirilerek 37 ° C ye ısınmasına plakası.
- Hemen 6-sıra dışı doku kültürü kaplı plaka bireysel kuyulara sıçan adacık izolasyonu 18,19, yerde 100-200 adacıklar takip. Altmış adacıklar insülin salgılanması ve timidin dahil testleri için gereklidir. Kalan adacıklar gen ekspresyonu ya immunoblotting çalışmaları için protein izolasyon için RNA izolasyon için kullanılabilir.
[Not: Bu noktadan itibaren, biyolojik tehlikeli malzeme taşıma, kullanma, ve bertaraf için kurumsal protokolleri takip edin.]
- Yavaşça girdap de merkezine adacıklar getirmek için plaka.
- Doğrudan çanağı merkezinde adacıklar üzerine adenovirüs Pipeti. Enfeksiyon 100-500 çokluklar (İçişleri Bakanlığı, viral plak oluşturan birim için hedef hücrelerin oranı) kullanın.
- 5 dk için adacıklar dinlenmeye bırakılır.
- Doku kültürü inkübatöründe (37 ° C'de,% 5 CO2) in plaka yerleştirin.
- 24 saat sonra yavaşça girdap kuyuların merkezlerine adacıklar getirmek ve iyi taze medya içeren yeni bir P200 mikropipet kullanarak adacıklar aktarmak için plaka. Adacıklar plakasına bağlı olursanız, onlar yavaşça pipet ucu ile yerinden edilebilir.
[Not: Yeterli transdüksiyon Verim doğrulamak içinadacıklar sonra adacık çekirdek içine adenovirüs penetrasyon doğrulamak için konfokal mikroskopi yansıması gibi cy, bir kontrol virüs ifade GFP kullanılması yararlı olur.]
- Optimizasyon pilot çalışma gelen deney istenen zamanlama bağlı olarak ek 24-72 saat boyunca kültürün adacıklar,. Örneğin, bir çoğalma tepkisi indüksiyonu 24-72 arası bir şekilde H veya ilgi genindeki demonte 48 ya da 72 saat arasında değişen gerektirebilir kez gerektirebilir. Taze medya her gün adacıklar aktarın.
- Deney, 1 içeren ortam içinde kültüre adacıklar nihai 24 saat süreyle μCi [metil-3 H] -thymidine/ml ortam (genellikle 1 ul timidin / ml ortamı).
[Not: Bu noktadan itibaren, radyoaktif maddelerin taşınması, kullanımı ve bertaraf edilmesi için kurumsal protokolleri takip edin.]
2. İnsülin salgılanması Assay
- Hazırlayınsalgılanması deney tamponu (SAB) 10X stok çözeltisi (1.14 M NaCl, 47 mM KCI, 12 mM KH 2 PO 4, 11.6 mM MgSO 4) ve CaCI2 100X stok çözeltisi (0.25 M CaCI2). Bu stok çözümler önceden hazırlanan ve oda sıcaklığında saklanabilir.
- Taze olarak çalışan SAB (10X SAB, 1 M HEPES, 100X CaCI2 ve 0.5 ml,% 35 BSA, 0.11 g NaHCO 3 0.28 ml 1 ml, ve steril su ile 50 ml 5 mL) içinde 50 ml hazırlanması 50 ml tüp konik ve ılık 37 ° C 37 ° C su banyosunda koyarak.
- Pipet 10 15 ml konik tüp içine çalışma SAB ml ve yüksek glukoz (16.7 mM) SAB hazırlamak için 2.5 M D-glikoz 66.8 ul ekleyin.
- Düşük glukoz (2.8 mM) SAB hazırlamak için çalışma SAB kalan 40 ml 2.5 M D-glikoz 44.8 ul ekleyin.
- Etiket üç 1.7 ml mikrosantrifüj 6-kuyulu plakanın her bir kuyucuk için tüpler ve fosfat-tamponlu salin (PBS) 1 ml ilave edilir. [Not: adacıklar radyoaktif olduğundan, radyoaktif maddelerin taşınması, kullanımı ve bertaraf edilmesi için kurumsal protokolleri takip edin.]
- Her mikrosantrifüj tüpüne 20 adacıktan yerleştirin. Her mikrosantrifüj tüpüne karşılaştırılabilir büyüklükte adacıklar eklemek için her türlü girişimi olun. Örneğin, her bir tüp 5 küçük, 10 orta ve 5 büyük ölçekli adacıklar (bakınız Şekil 1) ihtiva edebilir.
- Adacıklar ağırlık (~ 2 dk) göre tüp alt yapıldıktan sonra, mikropipet ile PBS aspire ve atılır.
- Ön kuluçka için, düşük Glu 400 ul ilavecose SAB, doku kültüründe inkübatöründe (37 ° C'de,% 5 CO2), ve 60 dakika boyunca ön-kuluçkaya yatmaktadır içine boru (bunların kapaklar açık olan) yerleştirin. Ön inkübasyon düşük glikoz SAB ve atın aspire.
- Temel insülin salgılanmasını için, düşük glikoz SAB 400 ul ilave, doku kültüründe inkübatöründe (37 ° C'de,% 5 CO2) içine boru (bunların kapaklar açık olan) yerleştirmek, ve 60 dakika süreyle inkübe edilir. Düşük glukoz SAB toplayın ve insülin radioimmunoassay için kaydetmek.
- Uyarılmış insülin salgılanmasını için, yüksek glikoz SAB 400 ul ilave, doku kültüründe inkübatöründe (37 ° C'de,% 5 CO2) içine boru (bunların kapaklar açık olan) yerleştirmek, ve 60 dakika süreyle inkübe edilir. Yüksek glukoz SAB toplayın ve insülin radioimmunoassay için kaydetmek.
- 1 ml PBS Add; adacıklar yerçekimi tarafından borusunun alt yapıldıktan sonra, mikropipet ile PBS aspire atmak ve bu, tekrarbir kez adım.
- 500 ul buz gibi soğuk trikloroasetik asit (TCA,% 10 w / v) eklenir ve 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edilir.
- 4 3 dakika ° C için 16 000 xg'de tüpler santrifüje
- TCA aspire, 0.3 N NaOH ile 80 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. Bu süre esnasında, 5-10 s boyunca kuvvetli bir şekilde vorteks numuneleri, her 10 dak.
- 7 ml sıvı sintilasyon sayım tüplerine Econo-güvenli sayma kokteyli 4 ml ekleyin.
- Sintilasyon sayacı tüpüne numunenin 50 ul ekleme, tüp kap kısa bir süre için çalkalanır, ve bir sıvı sintilasyon sayacı içinde sayılır.
- Üreticinin protokolüne göre bicinchoninic asit (BCA) test, örnek 10 ul kullanılarak protein konsantrasyonu ölçülür.
- Üreticinin protokolü takip insülin radioimmunoassay gerçekleştirin.
- Protein kons ile insülin salgılanması ve timidin dahil veri Normaleentration.
[Not: Islets bir diseksiyon stereoskop veya standart bir mikroskop kullanılarak görüntülenebilir.]
[Not: yerçekimi ile çökeltme alternatif olarak, boru 1 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje tabi olabilir.]
3. Timidin Ortaklığın Assay
4. Veri Analizi
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Sıçan adacıklarında adacık replikasyonu ve beta hücresi fonksiyonunu değerlendirmek için deney için bir örnek, Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu örnek, sağlam beta hücre fonksiyonu değiştirmeden adacık çoğaltma uyarır varsayımsal "# 6 Gen" bu adenoviral aşırı gösterir. Üst panosunda, timidin dahil testte sonuçlar "Gen # 6" ifadesini arttırarak timidin eklenmesi ile ölçülen DNA sentezi, artırdığını göstermektedir. Sıçan adacık hücrelerin en beta hücrelerinin olduğundan, timidin dahil bu artış beta hücre replikasyon bir artış gösterir olasıdır. Bununla birlikte, doğrulayıcı deneyler sıkıca Bu kurmak için gerçekleştirilmesi gerekir. Alt panelinde, insülin salgılanması testte sonuçlar "Gen # 6" i, yani birincil beta hücre fonksiyonlarının bir değişiklik olmadı bu aşırı göstermekdüşük ve yüksek glukoz de nsulin salgısı. Adenovirüsler ile tedaviyi takiben adacık adacık izolasyonu ve sağlık kalitesi düşük ve yüksek glukoz konsantrasyonlarında insülin salınımını kat artış ile gösterilir. "Gen # 6" bozulmuş beta hücre fonksiyon ifadesini arttırarak, bu olasılığı yüksek, uyarıcı glukoz konsantrasyonları (16.7 mM) olarak salgılanan insülin bir azalma olarak yansıtılacaktır. Glukoz biyokatalist için bir doz-yanıt eğrisi de yapılabilir.
Şekil 1. Gen ekspresyonu adenoviral aracılı değişiklikler sonrasında izole sıçan adacıklarında adacık çoğaltma ve beta hücre fonksiyonu değerlendirmek için protokol bakış. Taze izole sıçan adacıklar 24 saat adenovirüsler maruz kalan ve daha sonra 96 saat kadar kültürlenmiştir. Timidin dahil olarak insülin salgılanmasını ölçülmesi ile takip, nihai 24 saat içinde değerlendirilirdüşük ve yüksek glukoz.
Şekil 2. Bir kontrol adenovirüs ve adenovirüs aşırı "Gen # 6" olarak adlandırılan varsayımsal bir gen üzerinde yapılan bir deneyde elde edilen sonuçlar. Üst panel timidin dahil olması ve alt panelini insülin salgılanmasını gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çoğaltma teşvik ve beta hücrelerinin işlevini geliştirmek için modüle olabilir kurulması yollarının her iki diyabet büyük formlar alakalı. Işlevsel beta hücre kitlesi bu belirleyicileri değerlendirmek, insülin salgılayan hücrelerin varlığı ve fonksiyonu bağlı olduğundan aynı anda avantajları vardır. Bu protokolün bir proteini aşırı ekspresyonu ya da bastırma sonra in vivo etki için test edilebilir in vitro olarak fonksiyonel beta hücre kütlesi değişikliklere yol açar olmadığını belirlemek için düzenlenmiş bir protokol açıklanmaktadır.
Bu protokolün bir kısıtlaması adacık dahil birçok hücre tipleri, oluşan mikro-organdır ancak alfa, beta, delta, epsilon, ve PP hücreleri ile sınırlı değildir olmasıdır. Sıçan adacık hücrelerin% 80-90 beta hücreleri çünkü adacık çoğaltma bir değişiklik tamamen beta hücre çoğaltma bir değişiklik tercüme olmayabilir. Olasılığı adacık gözlemlenen bir değişimreplikasyon beta olmayan hücreli replikasyon mevcut kaynaklanmaktadır. Dolayısıyla, bu protokol için bir mantıksal ve doğrulayıcı bir sonraki adım immünofloresan veya FACS analizi 5,6 birleştiğinde timidin analoğu kullanımı ile beta hücre çoğaltma incelenmesi olabilir. Bu doğrulayıcı analizi de yayılması bağımsız adacıklar haline non-spesifik timidin dahil potansiyel endişe hafifletmek olabilir.
Bir başka sakınca adenovirüsler arasında transdüksiyon etkinliğini yatmaktadır. % 60-70 bir transdüksiyon verim elde etmek için makul seviyede, ancak etkinliğini belirleyen en önemli faktördür adenoviral iletimi zamanlamadır. Bu kültürün en kısa sürede transdüksiyon etkinliğini maksimize etmek adenovirüsler içinde izole adacıklar esastır. Adacık izolasyonu sonra birkaç saat içinde adacık böylece adacık çekirdek derinliklerine nüfuz adenovirüs yeteneğini sınırlayan, kasılmaya başlar. Gibi bir raportör yapının kullanılması,konfokal mikroskopi ile birleştiğinde bir adenovirüs ifade GFP, transdüksiyon etkinliğini değerlendirmek için yararlı olabilir.
Bu protokolün başlıca avantajları şunlardır: 1) adacıklar aynı havuzda işlevsel beta hücre kitlesi çok belirleyici test verimliliği ve 2) protokolü (tipik bir sıçan adacık izolasyonu 400 adacık verir) gerçekleştirmek için gerekli adacık küçük numaralar . Bu avantajlar bu protokol bir orta hızda çoklu genler için bir tarama aracı olarak kullanılmak üzere izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH (PTF kadar) hibe DK078732 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR | |
References
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).
- Keenan, H. A. Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study. Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).
- Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans. Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).
- Fueger, P. T. Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function. Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).
- Schisler, J. C. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).
- Chan, C. B. Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets. Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53, 149-159 (2004).
- Icyuz, M. Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1. Transplantation. 87, 821-824 (2009).
- Kaneto, H. Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).
- Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O'Doherty, R. M., Newgard, C. B. Metabolic engineering with recombinant adenoviruses. Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).
- Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O'Doherty, R. M. Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells. Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).
- Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels. J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).
- Csete, M. E. Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function. Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).
- Csete, M. E. Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors. Transplantation. 59, 263-268 (1995).
- Meng, Z. X. Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest. Diabetologia. 52, 125-135 (2009).
- Ronnebaum, S. M. A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion. J. Biol. Chem. , (2006).
- Milburn, J. L. Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids. J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).
- Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. Murine Pancreatic Islet Isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
