Summary
Detta protokoll gör att man kan identifiera faktorer som modulerar funktionella betacellernas massa för att hitta potentiella terapeutiska mål för behandling av diabetes. Protokollet består av en strömlinjeformad metod för att bedöma holmen replikering och betacellsfunktionen i isolerade råttöar efter manipulation av genuttryck med adenovirus.
Abstract
Glukoshomeostas styrs främst av det endokrina hormoner insulin och glukagon, utsöndras från bukspottkörteln och celler alfa, respektive. Funktionell beta cellmassan bestäms genom den anatomiska beta cellmassan liksom förmågan hos beta-celler att svara på en näringsämnen. En förlust av funktionell beta-cell-massa är central för båda av de större formerna av diabetes 1-3. De sjunkande funktionella massa beta cell resultat från en autoimmun attack i typ 1-diabetes, typ 2-diabetes, utvecklar detta dekrement både en oförmåga betaceller att utsöndra insulin på lämpligt sätt och förstörelsen av beta celler från en kader av mekanismer. Således ansträngningar för att återupprätta fungerande beta-cellmassan är av största vikt för bättre behandling av och potentiella botemedel för diabetes.
Ansträngningar görs för att identifiera molekylära vägar som kan utnyttjas för att stimulera replikering och förbättra funktionen av beta-celler.Idealt skulle terapeutiska mål att förbättra både beta-cell tillväxt och funktion. Kanske viktigare är dock att identifiera om en strategi som stimulerar beta celltillväxt sker på bekostnad försämrad betacellsfunktionen (såsom med vissa onkogener) och vice versa.
Genom att systematiskt undertrycka eller överuttryckande uttrycket av målgener i isolerade råttöar, kan man identifiera potentiella terapeutiska mål för att öka funktionell beta cellmassa 4-6. Adenovirala vektorer kan användas för att effektivt överuttrycker eller knockdown proteiner i isolerade råttöar 4,7-15. Här presenterar vi en metod att manipulera genuttryck använda adenovirala transduktion och bedöma holme replikering och betacellsfunktionen i isolerade råttöar (figur 1). Denna metod har tidigare använts för att identifiera nya mål som modulerar beta cellreplikation eller funktion 5,6,8,9,16,17.
Protocol
1. Adenovirala transduktion och Odling av råttöar
- Framställa en 6-brunnars icke-vävnadskultur belagda plattan genom att tillsätta 2 ml medium (RPMI 1640-medium innehållande 8 mM glukos, 10% fetalt bovint serum, 50 enheter / ml penicillin och 50 ng / ml streptomycin) till det erforderliga antalet brunnar. Till exempel kan ett typiskt experiment kräver tre brunnar - en för vardera en icke-viruskontroll, en viruskontroll (t.ex. GFP-uttryckande adenovirus) och försöksgruppen.
- Värma plåten till 37 ° C genom att placera den i en vävnadsodlingsinkubator minst 30 minuter.
- Omedelbart efter isolering från råtta ö 18,19, plats 100-200 cellöar i individuella brunnar i 6-brunnars icke-vävnadskultur belagda plattan. Sextio holmar krävs för insulinutsöndring och tymidin analyser inkorporering. De återstående cellöar kan användas för isolering av RNA för studier av genuttryck eller proteinisolering för immunoblotting.
[Notera: Från denna punkt framåt, följ institutionella protokoll för hantering, användning och bortskaffande av biologiskt riskfyllda material.]
- Försiktigt virvla plattan för att bringa cellöarna till centrum av brunnen.
- Pipettera adenovirus direkt på öarna i mitten av skålen. Använda 100-500 infektionskvot (MOI, varvid förhållandet mellan målceller till virala plackbildande enheter).
- Låt holmar vila 5 min.
- Placera plattan i vävnadskultur inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Efter 24 h försiktigt virvla plattan för att bringa cellöarna till mitten av de brunnar och överföra cellöarna med användning av en mikropipett P200 till en ny brunn innehållande färskt medium. Om cellöarna blir fäst vid plattan, kan de lätt lossnar med pipettspetsen.
[OBS: För att kontrollera tillräcklig transduktion verkningsgradency, användning av en kontroll-virus som uttrycker GFP är fördelaktigt, eftersom cellöar kan sedan avbildas via konfokal mikroskopi för att bekräfta penetrering av adenovirus i ö kärnan.]
- Kultur cellöarna för en ytterligare 24-72 h, beroende på den önskade tidpunkten för experimentet från studier optimering pilot. Till exempel kan induktion av ett proliferativt svar kräver tider som sträcker sig från 24 till 72 h eller knockdown av genen av intresse kan kräva 48 eller 72 timmar. Överför öarna med färska media varje dag.
- För den slutliga 24 h av experimentet kulturen cellöarna i media innehållande 1 | iCi [metyl-3H] -thymidine/ml medium (allmänt 1 il tymidin / ml medium).
[Notera: Från denna punkt framåt, följ institutionella protokoll för hantering, användning och bortskaffande av radioaktivt material.]
2. Insulinsekretionen analys
- Förberedsekretion analysbuffert (SAB) 10X stamlösning (1,14 M NaCl, 47 mM KCl, 12 mM KH PO 2 4, 11,6 mM MgSO 4) och CaCl2-100X stamlösning (0,25 M CaCl2). Dessa stamlösningar kan framställas i förväg och lagras vid rumstemperatur.
- Färskt framställa 50 ml av den arbetande SAB (5 ml 10X SAB, 1 ml 1 M HEPES, 0,5 ml av 100X CaCl2, 0,28 ml 35% BSA, 0,11 g NaHCOs 3, och sterilt vatten till 50 ml) i en 50 ml koniskt rör och värmdes till 37 ° C genom att placera i ett 37 ° C vattenbad.
- Pipettera 10 ml av den arbetande SAB i en 15-ml koniska rör och tillsätt 66,8 | il 2,5 M D-glukos för att framställa hög glukos (16,7 mM) SAB.
- Tillsätt 44,8 | il 2,5 M D-glukos till den återstående 40 ml av den arbetande SAB för att framställa låg glukos (2,8 mM) SAB.
- Label tre 1,7-ml mikrocentrifugrör för varje brunn i 6-brunnars platta och tillsätt 1 ml av fosfatbuffrad saltlösning (PBS). [Notera: Eftersom öarna är radioaktiva, följ institutionella protokoll för hantering, användning och bortskaffande av radioaktivt material.]
- Placera 20 öar i varje mikrocentrifugrör. Gör varje försök att lägga jämförbar storlek öar till varje mikrocentrifugrör. Till exempel kan varje rör innehåller 5 mindre, 10-medium-och 5 med stor storlek cellöar (se figur 1).
- Efter holmar har fast på botten av röret genom tyngdkraften (~ 2 min), aspirera PBS med en mikropipett och kasta.
- För förinkubering, tillsätt 400 pl av den låga glucose SAB, placera rören (med deras lock är öppet) i vävnadsodling inkubator (37 ° C, 5% CO2), och pre-inkuberas under 60 min. Aspirera förinkubationen lågt glukos SAB och kasta.
- För basal insulinutsöndring, tillsätt 400 | il av den låga glukos SAB, placera rören (med deras lock är öppet) i vävnadsodling inkubator (37 ° C, 5% CO2) och inkubera under 60 min. Samla låga glukos SAB och spara för insulin radioimmunanalys.
- För stimulerad insulinsekretion, tillsätt 400 | il av den höga glukos SAB, placera rören (med deras lock är öppet) i vävnadsodling inkubator (37 ° C, 5% CO2) och inkubera under 60 min. Samla höga glukos SAB och spara för insulin radioimmunanalys.
- Tillsätt 1 ml PBS, efter holmarna har fast på botten av röret genom tyngdkraften, aspirera PBS med en mikropipett, kasta, och upprepasteg en gång.
- Tillsätt 500 pl iskall triklorättiksyra (TCA, 10% vikt / volym) och inkubera på is under 30 minuter.
- Centrifugera rören vid 16 000 xg under 3 min vid 4 ° C.
- Aspirera TCA, tillsätt 80 pl av 0,3 N NaOH, och inkubera under 30 min vid rumstemperatur. Under denna tid kraftigt virvel prover för 5-10 s var 10 min.
- Tillsätt 4 ml av Econo-safe räknar cocktail 7 scintillation ml vätska räknar rör.
- Tillsätt 50 pl av provet till scintillationsräkning röret, cap röret, skaka en kort stund och räkna i en vätskescintillationsräknare.
- Mäta proteinkoncentration med användning av bicinkoninsyra (BCA-assay) och 10 pl av prov i enlighet med tillverkarens protokoll.
- Utföra insulin radioimmunoanalys att följa tillverkarens protokoll.
- Normalisera insulinutsöndring och tymidin uppgifter införlivandet med proteinet concentration.
[Notera: Islets kan visualiseras med hjälp av antingen en dissekering stereoskop eller en vanlig mikroskop.]
[Notera: Ett alternativ till sedimentering av tyngdkraften, kan rören centrifugerades vid 300 xg under 1 min.]
3. Tymidin-inkorporationsanalys
4. Dataanalys
5. Representativa resultat
Ett exempel på experimentet för att bedöma ö replikation och beta-cellfunktion i råttöar visas i figur 2. Detta exempel visar att adenoviral överuttryck av hypotetiska "Gene # 6" kraftigt stimulerar holmen replikation utan att ändra betacellsfunktionen. I ovanpanelen, resultaten från tymidin-inkorporationsanalys visar att ökning av uttrycket av "Gene # 6" ökar DNA-syntes, enligt mätning genom införlivande av tymidin. Eftersom de flesta av cellerna i råtta ö är beta-celler, är det troligt att denna ökning i tymidininförlivande indikerar en ökning av beta-cell-replikation. Emellertid måste bekräftande experiment utföras för att förankra detta. I botten panelen resultaten från insulinutsöndringen analysen visar att överuttryck av "Gene # 6" inte förändrar ett av de primära funktioner beta cell, dvs jagnsulin sekretion vid lågt och högt glukos. Kvaliteten på den ö isolering och hälsan för cellöar efter behandling med adenovirus indikeras av faldig ökning i insulinutsöndring vid låga och höga glukoskoncentrationer. Om öka uttrycket av "Gene # 6" försämrad betacellsfunktionen, skulle detta sannolikt återspeglas som en minskning av insulin utsöndras vid höga, koncentrationer stimulerande glukos (16,7 mM). En dos-responskurva för varierande glukoskoncentrationer kan också utföras.
Figur 1. Översikt av protokoll för att bedöma holmen replikering och betacellsfunktionen i isolerade råttöar efter adenovirus-medierade förändringar i genuttryck. Färskt isolerade råttöar utsätts för adenovirus under 24 timmar och odlades sedan upp till 96 timmar. Tymidininkorporering bedöms i den slutliga 24 h, följt av mätning av insulinutsöndring vidlåg och hög glukoshalt.
Figur 2. Resultat från ett experiment med användning av en kontroll adenovirus och ett adenovirus som överuttrycker en hypotetisk gen betecknades som "Gene # 6". Den övre panelen visar tymidininkorporering och botten panelen insulinsekretionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Upprättande vägar som kan moduleras för att stimulera replikation och förbättra funktionen av beta-celler är relevant för båda huvudformer av diabetes. Eftersom funktionell beta-cell massan är beroende av förekomsten och funktionen av insulin-utsöndrande celler, bedöma dessa faktorer samtidigt har sina fördelar. Detta protokoll beskriver en strömlinjeformad protokoll för att identifiera huruvida överuttryck eller undertryckande av ett protein leder till förändringar i funktionell beta-cell-massa in vitro, som sedan kan testas för effektivitet in vivo.
En begränsning av detta protokoll är att ö är en mikroorganismer som består av många celltyper, inklusive men inte begränsat till alfa-, beta-, delta-, epsilon-och PP-celler. En förändring i ö-replikation kan inte fullständigt omvandla till en förändring i beta-cell-replikation, eftersom 80-90% av cellerna i råttans ö är beta-celler. Möjligheten att en observerad förändring i öreplikation beror på icke-beta-cell-replikation existerar. Således kan ett logiskt och bekräftande nästa steg i detta protokoll att undersöka betacellernas replikering med användning av tymidinanaloger kopplade till immunofluorescens eller FACS-analys 5,6. Detta bekräftande analys kan också lindra upphov till oro av icke-specifik tymidininkorporation i holmar oberoende av spridning.
En annan potentiell nackdel ligger i det transduktionseffektiviteten av adenovirus. En transduktion verkningsgrad på 60-70% är rimligt att uppnå, men en viktig faktor för effektiviteten är tidpunkten för adenovirala transduktion. Det är viktigt att kulturen de isolerade öarna i adenovirus så snart som möjligt för att maximera transduktion effektivitet. Inom några timmar efter holmen isoleringen holmen börjar att dra ihop sig, vilket begränsar möjligheterna för adenovirus att tränga djupt in i kärnan av den lilla ön. Användningen av en reporterkonstruktion, såsomett adenovirus som uttrycker GFP i kombination med konfokal mikroskopi kan vara fördelaktigt för att utvärdera transduktionseffektiviteten.
De främsta fördelarna med detta protokoll är: 1) effektivitet testa flera bestämningsfaktorer för funktionell beta cellmassa på samma pool av öar och 2) de små antal öar som krävs för att utföra protokollet (en typisk råtta holme isolering ger 400 öar) . Dessa fördelar kan detta protokoll för att användas som en screeningmetod för flera gener i måttlig takt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag DK078732 från NIH (till PTF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR | |
References
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).
- Keenan, H. A. Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study. Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).
- Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans. Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).
- Fueger, P. T. Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function. Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).
- Schisler, J. C. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).
- Chan, C. B. Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets. Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53, 149-159 (2004).
- Icyuz, M. Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1. Transplantation. 87, 821-824 (2009).
- Kaneto, H. Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).
- Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O'Doherty, R. M., Newgard, C. B. Metabolic engineering with recombinant adenoviruses. Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).
- Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O'Doherty, R. M. Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells. Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).
- Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels. J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).
- Csete, M. E. Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function. Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).
- Csete, M. E. Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors. Transplantation. 59, 263-268 (1995).
- Meng, Z. X. Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest. Diabetologia. 52, 125-135 (2009).
- Ronnebaum, S. M. A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion. J. Biol. Chem. , (2006).
- Milburn, J. L. Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids. J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).
- Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. Murine Pancreatic Islet Isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
