Summary
Denne protokol tillader en at identificere faktorer, der modulerer funktionelle beta-cellemasse til at finde potentielle terapeutiske mål for behandling af diabetes. Den protokol består af en strømlinet metode til at vurdere islet replikation og beta celle funktion i isolerede rotte-øvævsceller efter manipulering af genekspression med adenovirus.
Abstract
Glucosehomeostase styres primært af endokrine hormoner insulin og glucagon, secerneres fra pancreas-beta-og alfa-celler. Funktionel beta cellemasse bestemmes ved den anatomiske beta cellemassen såvel som evnen af beta-cellerne til at reagere på en næringsstof. Et tab af funktionel beta-cellemasse er centralt for både store former for diabetes 1-3. De faldende funktionelle beta-cellemasse resultater fra en autoimmun angreb i type 1 diabetes, i type 2-diabetes denne decrement udvikler sig fra både en manglende evne til beta-celler til at udskille insulin hensigtsmæssigt og ødelæggelse af beta-celler fra en gruppe af mekanismer. Således bestræbelser på at genoprette funktionelle beta-cellemasse er altafgørende for den bedre behandling af og mulige behandlinger for diabetes.
Bestræbelser i gang for at identificere molekylære reaktionsveje, der kan udnyttes til at stimulere replikation og forbedre funktionen af beta-celler.Ideelt ville terapeutiske mål at forbedre både beta-celle vækst og funktion. Måske mere vigtigt er dog at identificere, om en strategi, der stimulerer beta cellevækst kommer på bekostning af svække beta-celle funktion (såsom med nogle onkogener) og vice versa.
Ved systematisk at undertrykke eller overudtrykker ekspression af målgener i isolerede rotte-øvævsceller, kan man identificere potentielle terapeutiske mål for forøgelse funktionel beta cellemasse 4-6. Adenovirale vektorer kan anvendes til effektivt at overudtrykke eller knockdown proteiner i isolerede rotte-øvævsceller 4,7-15. Her præsenteres en fremgangsmåde til at manipulere genekspression anvender adenovirale transduktion og vurdere islet replikation og beta celle funktion i isolerede rotte-øvævsceller (figur 1). Denne fremgangsmåde er blevet anvendt tidligere til at identificere nye mål, som modulerer beta cellereplikation eller funktion 5,6,8,9,16,17.
Protocol
1. Adenovirale Transduktion og dyrkning af rotteøer
- Fremstilling af en 6-brønds ikke-vævskulturplade overtrukne plade ved tilsætning af 2 ml medium (RPMI 1640-medier indeholdende 8 mM glucose, 10% føtalt bovint serum, 50 enheder / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin) til det krævede antal brønde. For eksempel kan et typisk eksperiment kræver tre brønde, én hver i en ikke-virus-kontrol, en viruskontrol (f.eks GFP-udtrykkende adenovirus) og den eksperimentelle gruppe.
- Opvarme pladen til 37 ° C ved at anbringe den i en vævskultur-inkubator i mindst 30 min.
- Umiddelbart efter rotteø isolation 18,19, sted 100-200 øvævsceller i individuelle brønde i 6-brønds ikke-vævskulturplade overtrukne plade. Tres øvævsceller er påkrævet for insulinsekretion og thymidin-assays. De resterende øer kan anvendes til RNA-isolering af genekspressionsstudier eller proteinisolering til immunoblotting.
[Note: Fra dette punkt frem, følg institutionelle protokoller for håndtering, brug og bortskaffelse af biologisk skadelige materialer venligst.]
- Forsigtigt hvirvel pladen for at bringe øerne til midten af borehullet.
- Pipettere adenovirus direkte på øerne i midten af skålen. Anvender 100-500 multipliciteter af infektion (MOI, forholdet mellem målceller til virale plakdannende enheder).
- Lad øvævsceller resten i 5 min.
- Pladen anbringes i vævskultur-inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Efter 24 timer bland forsigtigt pladen for at bringe øerne til centrene af brøndene og overføre øer med en P200 mikropipette til en ny brønd indeholdende frisk medium. Hvis øerne bliver fastgjort til pladen, kan de forsigtigt frigjort med pipettespidsen.
[Bemærk: Du kan kontrollere tilstrækkelig transduktion effekticy, anvendelsen af et kontrol-virus, som udtrykker GFP, er fordelagtig, da øer kan derefter afbildes via konfokal mikroskopi til at kontrollere indtrængen af adenovirus i ø kernen.]
- Kultur øerne for et yderligere 24-72 timer, afhængigt af den ønskede timing af eksperimentet fra optimering pilotundersøgelser. For eksempel kan induktionen af et proliferativt respons kræver gange spænder fra 24 til 72 h eller knockdown af genet af interesse kan kræve 48 eller 72 timer. Overfør øer til friske medier hver dag.
- Til den endelige 24 h af eksperimentet kulturen øerne i medier indeholdende 1 uCi [methyl-3H] -thymidine/ml medier (sædvanligvis 1 ul thymidin / ml medium).
[Note: Fra dette punkt frem, følg institutionelle protokoller for håndtering, brug og bortskaffelse af radioaktive materialer venligst.]
2. Insulinsekretion Assay
- Forberedsekretion assaybuffer (SAB) 10X stamopløsning (1,14 M NaCl, 47 mM KCI, 12 mM KH 2PO 4, 11,6 mM MgSO4) og CaCl2 100X stamopløsning (0,25 M CaCl2). Disse stamopløsninger kan fremstilles i forvejen og opbevares ved stuetemperatur.
- Frisk fremstilling af 50 ml af arbejds SAB (5 ml 10X SAB, 1 ml 1 M HEPES, 0,5 ml 100X CaCl2, 0,28 ml 35% BSA, 0,11 g NaHCO3, og sterilt vand til 50 ml) i en 50 ml konisk rør og opvarmes til 37 ° C ved anbringelse i et 37 ° C vandbad.
- Pipetten 10 ml arbejds SAB i en 15 ml konisk rør, og der tilsættes 66,8 gl 2,5 M D-glucose til fremstilling af høj glucose (16,7 mM) SAB.
- Tilsættes 44,8 gl 2,5 M D-glucose til de resterende 40 ml af den arbejdende SAB til fremstilling af lav glucose (2,8 mM) SAB.
- Etiket tre 1,7 ml-mikrocentrifugerør for hver brønd i 6-brønds plade og der tilsættes 1 ml phosphatbufret saltvand (PBS). [Bemærk: Da holme er radioaktive, skal du følge de institutionelle protokoller for håndtering, brug og bortskaffelse af radioaktive materialer.]
- Anbring 20 øvævsceller i hvert mikrocentrifugerør. Gør ethvert forsøg på at tilføje sammenligneligt mellemstore øer til hvert mikrocentrifugerør. For eksempel kan hvert rør indeholder 5 lille, 10 medium-og 5 stor størrelse øer (se figur 1).
- Efter øerne har fast på bunden af røret ved hjælp af tyngdekraften (~ 2 min), aspireres i PBS med en mikropipette og kasseres.
- Til præ-inkubering tilsættes 400 pi af lav gluCose SAB at placere rørene (med deres låg åben) i vævskultur-inkubator (37 ° C, 5% CO 2), og præ-inkuberes i 60 min. Aspirer præinkuberingen lav glukose SAB og kassér.
- For basal insulinsekretion, 400 ul af lav glucose SAB tilføje anbringe rørene (med deres låg åben) i vævskultur-inkubator (37 ° C, 5% CO 2), og inkuberes i 60 min. Saml lav glukose SAB og spare op til insulin radioimmunoassay.
- For stimuleret insulinsekretion, 400 ul af høj glucose SAB tilføje anbringe rørene (med deres låg åben) i vævskultur-inkubator (37 ° C, 5% CO 2), og inkuberes i 60 min. Saml den høje glukose SAB og spare op til insulin radioimmunoassay.
- Tilsæt 1 ml PBS, som efter de holme har slået sig ned på bunden af røret ved hjælp af tyngdekraften, opsug PBS med en mikropipette, kasseres, og gentag dettetrin gang.
- Tilsæt 500 pi iskold trichloreddikesyre (TCA, 10% w / v) og inkuberes på is i 30 minutter.
- Centrifuger rørene ved 16 000 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
- Aspirer TCA tilsættes 80 pi 0,3 N NaOH, og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. I dette tidsrum. Kraftigt vortex prøverne 5-10 s hver 10 min
- Tilsæt 4 ml af Econo-sikker tælling cocktail til 7 ml væskescintillationstælling rør.
- Tilsættes 50 ul af prøven til scintillationstælling røret, cap røret rystes kort, og tælle i en væskescintillationstæller.
- Måle proteinkoncentrationen ved hjælp af bicinchoninsyre (BCA)-assayet og 10 ul prøve ifølge fabrikantens protokol.
- Udføre insulin radioimmunoassay følge producentens protokol.
- Normalisere insulinsekretion og thymidininkorporering data med proteinet koncentration.
[Bemærk: øer kan visualiseres ved anvendelse af enten et dissektionsmikroskop stereoskop eller et standardmikroskopobjektglas.]
[Bemærk: Som et alternativ til bundfældning ved tyngdekraft, kan rørene centrifugeres ved 300 x g i 1 min.]
3. Thymidin-inkorporeringsassay
4. Dataanalyse
5. Repræsentative resultater
Et eksempel på eksperimentets at vurdere islet replikation og beta celle funktion i rotteøer er vist i figur 2. Dette eksempel viser, at adenoviral overekspression af hypotetiske "Gene # 6" robust stimulerer holm replikation uden at ændre beta-celle funktion. I toppanelet, viser resultaterne fra thymidin-inkorporeringsassay at forøge ekspressionen af "Gene # 6" forøger DNA syntese som målt ved inkorporering af thymidin. Fordi de fleste af cellerne i rotteø er beta-celler, er det sandsynligt, at denne stigning i thymidininkorporering indikerer en stigning i beta cellereplikation. Dog skal genfremsatte eksperimenter udføres for at forankre dette. I bundpanelet, viser resultaterne fra insulinsekretion assay, at overekspression af "Gene # 6" ikke ændre en af de primære beta celle funktion, dvs, insulin sekretion ved lav og høj glucose. Kvaliteten af ø isolation og sundhed af øerne efter behandling med adenovira er angivet ved fold stigning i insulinsekretion ved lave og høje glucosekoncentrationer. Hvis forøgelse af ekspressionen af "Gene # 6" nedsat beta celle funktion, ville sandsynligvis blive afspejlet som et fald i insulin udskilles ved høje stimulatoriske glucosekoncentrationer (16,7 mM). En dosis-respons-kurven for forskellige glucosekoncentrationer kan også udføres.
Figur 1. Oversigt over protokol til at vurdere islet replikation og beta celle funktion i isolerede rotte-øvævsceller efter adenoviral-medierede ændringer i genekspression. Frisk isolerede rotteøer udsættes for adenovira i 24 timer og derefter dyrket op til 96 timer. Thymidininkorporering vurderes i den endelige 24 h, efterfulgt af måling af insulinsekretion vedlav og høj glucose.
Figur 2. Resultater fra et eksperiment ved anvendelse af en kontrol-adenovirus og en adenovirus overudtrykker en hypotetisk gen betegnet som "Gene # 6". Den øverste panel viser thymidin-inkorporering og bundpanelet i insulinsekretion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oprettelse veje, der kan moduleres til at stimulere replikation og forbedre funktionen af beta-cellerne er relevante for begge større former for diabetes. Fordi funktionelle beta-cellemasse er afhængig af eksistensen og funktionen af insulinproducerende celler, vurdere disse faktorer samtidig har sine fordele. Denne protokol beskrives en strømlinet protokol for at identificere, hvorvidt overekspression eller undertrykkelse af et protein fører til ændringer i funktionel beta cellemasse in vitro, som derefter kan testes for virkningsfuldhed in vivo.
En begrænsning ved denne protokol er at ø er en mikro-organ, der består af mange celletyper, herunder, men ikke begrænset til alfa, beta, delta, epsilon, og PP-celler. En ændring i ø-replikation kan ikke fuldstændigt kunne overføres til en ændring i beta-celle-replikation, fordi 80-90% af cellerne i rotteø er beta-celler. Den mulighed, at en observeret ændring i ø-replikation er på grund af non-beta cellereplikation eksisterer. Således kan en logisk og bekræftende næste trin i denne protokol skal undersøge beta-celle-replikation under anvendelse af thymidinanaloger koblet til immunofluorescens eller FACS-analyse 5,6. Dette bekræftende analyse kan også lette potentielt problematiske af ikke-specifik thymidin-inkorporering i øvævsceller uafhængigt af proliferation.
En anden potentiel ulempe ligger i transduktionen effektivitet adenovira. En transduktion effektivitet 60-70% er rimeligt at opnå, men en afgørende faktor for effektiviteten, er timingen af adenoviral transduktion. Det er vigtigt at dyrke isolerede øer i adenovira så hurtigt som muligt for at maksimere transduktionseffektivitet. Inden for få timer efter holmen isolation holmen begynder at aftale, hvilket begrænser evne til adenovirus til at trænge dybt ind i kernen af holmen. Anvendelsen af en reporter konstrukt, såsomen adenovirus, der udtrykker GFP, koblet med konfokal mikroskopi kan være fordelagtig for at vurdere transduktionseffektivitet.
De primære fordele ved denne protokol er: 1) effektiviteten af test af flere faktorer i funktionel beta cellemasse på samme pulje af øer og 2) de små antal øer, der kræves for at udføre den protokol (en typisk rotteø isolation giver 400 øer) . Disse fordele giver denne protokol skal anvendes som et screeningsværktøj for flere gener på et moderat tempo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud DK078732 fra NIH (til PTF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR | |
References
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).
- Keenan, H. A. Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study. Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).
- Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans. Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).
- Fueger, P. T. Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function. Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).
- Schisler, J. C. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).
- Chan, C. B. Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets. Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53, 149-159 (2004).
- Icyuz, M. Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1. Transplantation. 87, 821-824 (2009).
- Kaneto, H. Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).
- Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O'Doherty, R. M., Newgard, C. B. Metabolic engineering with recombinant adenoviruses. Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).
- Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O'Doherty, R. M. Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells. Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).
- Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels. J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).
- Csete, M. E. Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function. Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).
- Csete, M. E. Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors. Transplantation. 59, 263-268 (1995).
- Meng, Z. X. Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest. Diabetologia. 52, 125-135 (2009).
- Ronnebaum, S. M. A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion. J. Biol. Chem. , (2006).
- Milburn, J. L. Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids. J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).
- Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. Murine Pancreatic Islet Isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
