Summary
هذا البروتوكول يسمح احد لتحديد العوامل التي تعدل وظيفي كتلة خلايا بيتا للعثور على الأهداف العلاجية المحتملة لعلاج مرض السكري. بروتوكول يتكون من طريقة مبسطة لتقييم تكرار جزيرة وظيفة خلايا بيتا في جزر معزولة في اعقاب الفئران التلاعب في الجينات مع الفيروسات الغدية.
Abstract
ويتم التحكم في المقام الأول توازن الجلوكوز من قبل الغدد الصماء هرمونات الانسولين والجلوكاجون، يفرز من خلايا بيتا في البنكرياس، وألفا، على التوالي. يتم تحديد وظيفي كتلة خلايا بيتا بيتا من كتلة الخلية التشريحية، فضلا عن قدرة خلايا بيتا للرد على حمل المغذيات. وفقدان وظيفي بيتا كتلة الخلية المركزية على كل من الأشكال الرئيسية لداء السكري 1-3. في حين تراجع وظيفي النتائج بيتا كتلة الخلية من هجوم المناعة الذاتية في مرض السكري نوع 1، في مرض السكري من النوع 2، وهذا النقصان يطور من عدم القدرة على حد سواء من خلايا بيتا لإفراز الإنسولين بشكل مناسب، وتدمير خلايا بيتا من كادر من الآليات. وبالتالي، الجهود المبذولة لاستعادة وظيفي كتلة خلايا بيتا لها أهمية قصوى لتحسين معاملة وعلاج محتمل لمرض السكري.
هناك جهود جارية لتحديد المسارات الجزيئية التي يمكن استغلالها لتحفيز تكرار وتعزيز وظيفة خلايا بيتا.من الناحية المثالية، فإن الأهداف العلاجية تحسين كل من نمو خلايا بيتا ووظيفتها. ربما أكثر أهمية على الرغم من ذلك هو تحديد ما إذا كانت الاستراتيجية التي تحفز نمو خلايا بيتا يأتي على حساب إضعاف وظيفة خلايا بيتا (مثل مع بعض الجينات المسرطنة)، والعكس بالعكس.
بواسطة التعبير قمع منهجي أو overexpressing من الجينات المستهدفة في الجزر الفئران المعزولة، يمكن للمرء تحديد الأهداف العلاجية المحتملة لزيادة وظيفية بيتا كتلة الخلية 4-6. ويمكن استخدام ناقلات الفيروسة الغدانية للبروتينات overexpress بكفاءة أو ضربة قاضية في الجزر الفئران المعزولة 4،7-15. هنا، نقدم طريقة للتلاعب الجيني باستخدام تنبيغ الفيروسة الغدانية وتقييم تكرار جزيرة وظيفة خلايا بيتا في جزر الفئران المعزولة (الشكل 1). وقد استخدمت هذه الطريقة سابقا لتحديد أهداف جديدة أن تعدل بيتا تكرار خلية أو وظيفة 5،6،8،9،16،17.
Protocol
1. الفيروسة الغدانية تنبيغ والتثقيف من الجزر الجرذ
- إعداد 6-جيدا لوحة ثقافة غير الأنسجة المغلفة بإضافة 2 مل من وسائل الاعلام (RPMI 1640 وسائل الإعلام التي تحتوي على نسبة الجلوكوز في 8 مم، 10٪ مصل بقري جنيني، والوحدات 50 / البنسلين مل، و 50 ميكروغرام / الستربتومايسين مل) على العدد المطلوب من الآبار. على سبيل المثال، قد يكون تجربة نموذجية تتطلب ثلاثة آبار - واحد في كل لسيطرة أي من الفيروسات، ومكافحة فيروس (على سبيل المثال، في التعبير عن GFP اتش)، والمجموعة التجريبية.
- تدفئة لوحة إلى 37 درجة مئوية عن طريق وضعها في منديل حاضنة ثقافة ما لا يقل عن 30 دقيقة.
- مباشرة بعد جرذ العزلة جزيرة 18،19، مكان 100-200 الجزر في الآبار الفردية من لوحة 6 جيدا ثقافة غير الأنسجة المغلفة. يطلب من الجزر الصغيرة والستين لافراز الانسولين والمقايسات دمج ثيميدين. ويمكن استخدام الجزر المتبقية لعزل الحمض النووي الريبي للدراسات التعبير الجيني أو عزل بروتين لimmunoblotting.
[ملاحظة: من هذه النقطة، يرجى اتباع بروتوكولات مؤسسية لمعالجة واستخدام والتخلص من المواد biohazardous.]
- دوامة بلطف لوحة لجعل الجزر إلى مركز جيد.
- ماصة واتش مباشرة على الجزر في وسط الطبق. استخدم 100-500 مولتيبليكيتييس من العدوى (وزارة الداخلية، ونسبة الخلايا المستهدفة للوحدات المكونة للفيروس).
- السماح لبقية الجزر لمدة 5 دقائق.
- وضع لوحة في نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2).
- بعد 24 ساعة، دوامة بلطف لوحة لجعل الجزر إلى مراكز للآبار ونقل الجزر باستخدام micropipette P200 إلى جديد يحتوي على وسائل الاعلام بشكل جيد الطازجة. إذا الجزر أصبحت تعلق على لوحة، يمكن أن طردت بلطف مع طرف ماصة.
[ملاحظة: للتحقق من ملائمة كفاءه تنبيغقبرصي، واستخدام عنصر تحكم GFP فيروس التعبير هو مفيد، ويمكن بعد ذلك الجزر يمكن تصوير عبر متحد البؤر المجهري للتحقق من اختراق اتش في صلب جزيرة.]
- ثقافة الجزر لح 24-72 إضافية، تبعا لتوقيت المرجوة من هذه التجربة من الدراسات الرائدة التحسين. على سبيل المثال، قد تحريض استجابة التكاثري تتطلب مرات تتراوح بين 24-72 ساعة أو ضربة قاضية لهذا الجين من الفائدة قد تحتاج إلى 48 أو 72 ساعة. تحويل الجزر إلى وسائل الإعلام الطازجة كل يوم.
- ل24 ساعة الأخيرة من التجربة، وثقافة الجزر في وسائل الإعلام التي تحتوي على 1 μCi [الميثيل-3 H] -thymidine/ml وسائل الإعلام (1 ميكروليتر عموما ثيميدين / مل وسائل الاعلام).
[ملاحظة: من هذه النقطة، يرجى اتباع بروتوكولات مؤسسية لمعالجة واستخدام والتخلص من المواد المشعة.]
2. الأنسولين إفراز الفحص
- إعدادإفراز العازلة فحص (SAB) 10X حل سهم (1.14 م كلوريد الصوديوم، و 47 ملي بوكل، 12 مم KH 2 PO 4، 11.6 ملم MgSO 4) وCaCl 2 حل 100X الأوراق المالية (0.25 م CaCl 2). ويمكن إعداد هذه الحلول الأوراق المالية قبل الموعد المحدد وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- تعد طازجة 50 مل من SAB العمل (5 مل من SAB 10X، 1 مل من HEPES 1 م، و 0.5 مل من CaCl 100X 2، 0.28 مل من جيش صرب البوسنة 35٪، 0،11 ز NaHCO 3، والماء المعقم إلى 50 مل) في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، والحار الى 37 درجة مئوية عن طريق وضع في بالحمام المائي 37 درجة مئوية.
- ماصة 10 مل من الديوان العمل في أنبوب 15 مل مخروطي الشكل وإضافة 66.8 ميكرولتر من 2.5 متر مد الجلوكوز لإعداد ارتفاع نسبة الجلوكوز (16.7 ملم) SAB.
- إضافة 44.8 ميكرولتر من 2.5 متر مد الجلوكوز إلى 40 مل المتبقية من SAB عمل للاعداد للانخفاض الجلوكوز (2.8 مم) SAB.
- تسمية ثلاثة أنابيب microcentrifuge 1.7 مل لكل بئر من لوحة 6 جيدا ويضاف 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). [ملاحظة: بما أن الجزر هي المشعة، يرجى اتباع بروتوكولات مؤسسية لمعالجة واستخدام والتخلص من المواد المشعة.]
- 20 وضع الجزر في كل أنبوب microcentrifuge. جعل كل محاولة لإضافة الجزر الصغيرة الحجم نسبيا إلى كل أنبوب microcentrifuge. على سبيل المثال، قد تحتوي على 5 في كل أنبوب صغير، و 10 متوسطة، و 5 من الحجم الكبير الجزر (انظر الشكل 1).
- بعد الجزر واستقر على الجزء السفلي من الأنبوب بواسطة الجاذبية (~ 2 دقيقة)، نضح في برنامج تلفزيوني مع micropipette وتجاهل.
- لمرحلة ما قبل الحضانة، إضافة 400 ميكرولتر من حمض الغلوتاميك منخفضCOSE SAB، ووضع أنابيب (مع قبعاتهم المفتوحة) في الأنسجة حاضنة الثقافة (37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2)، ومرحلة ما قبل الحضانة لمدة 60 دقيقة. نضح ما قبل الحضانة منخفض SAB الجلوكوز وتجاهل.
- لافراز الانسولين القاعدي، إضافة 400 ميكرولتر من SAB انخفاض الجلوكوز، ووضع أنابيب (مع قبعاتهم المفتوحة) في الأنسجة حاضنة الثقافة (37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2)، واحتضان لمدة 60 دقيقة. جمع منخفض SAB الجلوكوز وحفظ لالمقايسة المناعية الشعاعية الانسولين.
- لحفز افراز الانسولين، إضافة 400 ميكرولتر من ارتفاع السكر في الديوان، ووضع أنابيب (مع قبعاتهم المفتوحة) في الأنسجة حاضنة الثقافة (37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2)، واحتضان لمدة 60 دقيقة. جمع ارتفاع SAB الجلوكوز وحفظ لالمقايسة المناعية الشعاعية الانسولين.
- إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني، وبعد الجزر واستقر على الجزء السفلي من الأنبوب بواسطة الجاذبية، ونضح في برنامج تلفزيوني مع micropipette، تجاهل، وتكرار هذاالخطوة مرة واحدة.
- إضافة 500 ميكروليتر حامض الخليك ثلاثي الكلور الجليد الباردة (TCA، و 10٪ W / V) واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- منبذة الأنابيب في 16 000 XG لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
- نضح في TCA، إضافة 80 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم N 0.3، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. خلال هذا الوقت، دوامة بقوة عينات لق 5-10 كل 10 دقيقة.
- إضافة 4 مل من الكوكتيل العد فندق Econo الآمن إلى 7 مل أنابيب التلألؤ سائل الفرز.
- إضافة 50 ميكروليتر من العينة إلى أنبوب التلألؤ عد، وكأب الأنبوب، هز لفترة وجيزة، والاعتماد في عداد التلألؤ السائل.
- قياس تركيز البروتين باستخدام حمض bicinchoninic (BCA) فحص و 10 ميكروليتر من عينة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- تنفيذ المقايسة المناعية الشعاعية الانسولين بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
- تطبيع افراز الانسولين وبيانات دمج ثيميدين مع اضرب بروتينentration.
[ملاحظة: يمكن تصور الفشوت سواء باستخدام المجسام تشريح أو المجهر القياسية.]
[ملاحظة: كبديل لتسوية عن طريق الجاذبية، ويمكن طرد الأنابيب في 300 XG ل 1 دقيقة.]
3. ثيميدين التأسيس الفحص
4. تحليل البيانات
5. ممثل النتائج
ويرد مثال على هذه التجربة لتقييم تكرار جزيرة وظيفة خلايا بيتا في جزر الفئران في الشكل 2. هذا المثال يوضح أن overexpression الفيروسة الغدانية من "جين # 6" افتراضية يحفز بقوة تكرار جزيرة دون تغيير وظيفة خلايا بيتا. في لوحة أعلى، ونتائج الفحص من دمج ثيميدين تثبت أن زيادة التعبير عن "جين # 6" يزيد تركيب الحامض النووي، إذا ما قيست على إدماج ثيميدين. لأن معظم الخلايا في جزيرة الفئران وخلايا بيتا، فمن المرجح أن هذه الزيادة في دمج ثيميدين يشير إلى زيادة في تكرار خلايا بيتا. ومع ذلك، يجب إجراء تجارب تأكيدية لترسيخ هذا. في لوحة أسفل، والنتائج من الانسولين فحص إفراز تثبت أن overexpression من "جين # 6" لم يغير واحدة من المهام بيتا الخلية الأولية، أي أناnsulin في إفراز الجلوكوز المنخفضة والعالية. ويدل على جودة عزلة الجزيرة والصحة من الجزر بعد العلاج مع الفيروسات الغدية من الزيادة أضعاف في افراز الانسولين في تركيزات الجلوكوز المنخفضة والعالية. إذا زيادة التعبير عن "جين # 6" ضعف وظيفة خلايا بيتا و، من المرجح أن ينعكس هذا على أنه نقص في الأنسولين يفرز في ارتفاع، وتركيزات الجلوكوز تنشيطية (16.7 ملم). ويمكن أيضا منحنى الجرعة والاستجابة لمختلف تركيزات الجلوكوز يتعين القيام بها.
الشكل 1. نظرة عامة على بروتوكول لتقييم تكرار جزيرة وظيفة خلايا بيتا في جزر معزولة في اعقاب الفيروسة الغدانية فأر بوساطة تغيرات في التعبير الجيني. ويتعرض الجزر الفئران المعزولة حديثا إلى الفيروسات الغدية لمدة 24 ساعة وبعد ذلك زرعها تصل إلى 96 ساعة. ويتم تقييم دمج ثيميدين في 24 ساعة الأخيرة، تليها قياس افراز الانسولين فيانخفاض وارتفاع السكر.
الشكل 2. النتائج من تجربة تستخدم اتش التحكم وoverexpressing اتش جين افتراضية وصفت بانها "جين # 6". لوحة الأعلى يظهر دمج ثيميدين واللوحة السفلية في افراز الانسولين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تأسيس مسارات التي يمكن أن تكون منظم لحفز تكرار وتعزيز وظيفة خلايا بيتا ذات الصلة على حد سواء الأشكال الرئيسية لداء السكري. لأن كتلة خلايا بيتا وظيفي يعتمد على وجود وظيفة الانسولين إفراز الخلايا، وتقييم هذه المحددات لديها في وقت واحد مزاياه. هذا البروتوكول يصف بروتوكول مبسطة لتحديد ما إذا overexpression أو قمع من البروتين يؤدي إلى تغييرات وظيفية في بيتا كتلة الخلايا في المختبر، ومن ثم يمكن اختبار فعالية في الجسم الحي.
واحد الحد من هذا البروتوكول هو أن هذه الجزيرة هي جهاز الصغيرة التي تتكون من العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على ألفا وبيتا ودلتا، إبسيلون، وخلايا PP. ويجوز للتغيير في النسخ المتماثل جزيرة لم تترجم تماما إلى تغيير في تكرار لخلايا بيتا 80-90٪ من الخلايا في جزيرة الفئران وخلايا بيتا. احتمال أن التغير الملحوظ في جزيرةومن المقرر أن تكرار تكرار خلية غير موجود بيتا. وبالتالي، قد يكون الخطوة المنطقية التالية، وتأكيدي على هذا البروتوكول يمكن النظر بيتا تكرار خلية مع استخدام النظير ثيميدين بالإضافة إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية المناعي أو تحليل 5،6. ويمكن هذا التحليل التأكيدي يخفف أيضا من قلق محتمل التأسيس ثيميدين غير محددة في الجزر المستقلة من انتشار الأسلحة النووية.
عيب آخر محتمل يكمن في كفاءة تنبيغ من الفيروسات الغدية. وكفاءة تنبيغ من 60-70٪ من المعقول لتحقيق، ولكن من العوامل الرئيسية لفعالية هو توقيت تنبيغ الفيروسة الغدانية. لا بد من ثقافة الجزر المعزولة في الفيروسات الغدية في أسرع وقت ممكن لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة تنبيغ. في غضون ساعات قليلة بعد عزلة الجزيرة والجزيرة تبدأ في العقد، مما يحد من قدرة الفيروس الغدي إلى التوغل عميقا في جوهر جزيرة. استخدام تأنشا المراسل، مثليجوز للGFP اتش التعبير، إلى جانب متحد البؤر المجهري تكون مفيدة لتقييم كفاءة تنبيغ.
المزايا الأساسية لهذا البروتوكول هي: 1) كفاءة اختبار محددات وظيفية بيتا كتلة الخلية على نفس المجموعة من الجزر و 2) من أعداد صغيرة من الجزر الصغيرة المطلوبة لتنفيذ البروتوكول (جزيرة صغيرة الفئران نموذجي العزلة ينتج 400 الجزر) . هذه المزايا تسمح باستخدام هذا البروتوكول كأداة الكشف عن جينات متعددة بوتيرة معتدلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل منحة DK078732 من المعاهد الوطنية للصحة (لPTF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR | |
References
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).
- Keenan, H. A. Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study. Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).
- Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans. Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).
- Fueger, P. T. Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function. Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).
- Schisler, J. C. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).
- Chan, C. B. Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets. Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53, 149-159 (2004).
- Icyuz, M. Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1. Transplantation. 87, 821-824 (2009).
- Kaneto, H. Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).
- Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O'Doherty, R. M., Newgard, C. B. Metabolic engineering with recombinant adenoviruses. Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).
- Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O'Doherty, R. M. Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells. Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).
- Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels. J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).
- Csete, M. E. Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function. Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).
- Csete, M. E. Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors. Transplantation. 59, 263-268 (1995).
- Meng, Z. X. Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest. Diabetologia. 52, 125-135 (2009).
- Ronnebaum, S. M. A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion. J. Biol. Chem. , (2006).
- Milburn, J. L. Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids. J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).
- Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. Murine Pancreatic Islet Isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
