Summary
Dit protocol maakt het mogelijk factoren te identificeren die de functionele beta cel massa moduleren om potentiële therapeutische doelen voor de behandeling van diabetes te vinden. Het protocol bestaat uit een gestroomlijnde methode om eilandje replicatie-en bèta-cel functie te beoordelen in geïsoleerde eilandjes rat na manipulatie van genexpressie met adenovirussen.
Abstract
Glucose-homeostase wordt voornamelijk bepaald door de endocriene hormonen insuline en glucagon, afgescheiden van de pancreatische beta-en alfa-cellen, respectievelijk. Functionele betacelmassa wordt bepaald door de anatomische betacelmassa alsmede het vermogen van de beta cellen reageren op een nutriënten. Een verlies van functionele beta cel massa staat centraal in zowel grote vormen van diabetes 1-3. Overwegende dat de dalende functionele beta cel massa het gevolg is van een auto-immuunziekte bij type 1 diabetes, bij type 2 diabetes, deze verlagen ontwikkelt zowel vanuit een onvermogen van bèta-cellen op de juiste insuline afscheiden en de vernietiging van de bètacellen van een kader van mechanismen. Zo, de inspanningen om functionele beta cel massa te herstellen zijn van cruciaal belang voor de betere behandeling van en de mogelijke behandelingen voor diabetes.
Er wordt gewerkt aan moleculaire pathways die kan worden benut om de replicatie te stimuleren en verbeteren van de functie van beta-cellen te identificeren.Idealiter zou therapeutische doelen verbeteren, zowel beta cel groei en functie. Misschien nog belangrijker echter is vast te stellen of een strategie die beta celgroei stimuleert ten koste gaat van de verslechterende beta cel functie (zoals bij sommige oncogenen) en vice versa.
Door systematisch te onderdrukken of overexpressie van de expressie van genen in geïsoleerde eilandjes rat kan men potentiële therapeutische doelen voor het verhogen van functionele bèta-celmassa 4-6. Adenovirale vectoren kan worden gebruikt om efficiënt overexpressie of knockdown eiwitten in geïsoleerde eilandjes rat 4,7-15. Hier presenteren we een methode om genexpressie gebruik te maken van adenovirale transductie te manipuleren en te beoordelen eilandje replicatie-en bèta-cel functie in geïsoleerde eilandjes rat (figuur 1). Deze methode is eerder gebruikt om nieuwe targets beta cel-replicatie of functie 5,6,8,9,16,17 moduleren te identificeren.
Protocol
1. Adenovirale transductie en kweken van Rat eilandjes
- Bereid een 6-wells weefselkweekplaten niet beklede plaat door toevoeging van 2 ml medium (RPMI 1640 medium met 8 mM glucose, 10% foetaal runderserum, 50 eenheden / ml penicilline en 50 ng / ml streptomycine) de gewenste aantal putten. Bijvoorbeeld kan een typisch experiment nodig drie bronnen - een voor elke no-viruscontrole een viruscontrole (bijvoorbeeld GFP-expressie adenovirus) en de experimentele groep.
- Verwarm de plaat 37 ° C door het in een weefselkweek incubator gedurende ten minste 30 minuten.
- Onmiddellijk na rat eilandje isolement 18,19, plaats 100-200 eilandjes in afzonderlijke putjes van de 6-well niet-weefselkweek gecoate plaat. Zestig eilandjes zijn nodig voor de insuline secretie en thymidine assays. De resterende eilandjes kan worden gebruikt voor RNA-isolatie voor genexpressie studies of eiwit isolatie voor immunoblotting.
[Opmerking: Vanaf dit punt volgt u de institutionele protocollen voor de behandeling, het gebruik en de verwijdering van biologisch materiaal.]
- Zwenk de plaat de eilandjes naar het centrum van de put.
- Pipetteer de adenovirus direct op de eilandjes in het midden van de schotel. Gebruik 100-500 veelvouden van infectie (MOI de verhouding doelcellen van virale plaque-vormende eenheden).
- Laat de eilandjes rusten gedurende 5 minuten.
- Plaats de plaat in de weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Na 24 uur voorzichtig draai de plaat om de eilandjes te brengen naar de centra van de putten en over te dragen van de eilandjes met een P200 micropipet om een nieuwe put met vers media. Als de eilandjes zich te binden aan de plaat, kunnen ze voorzichtig worden verdreven met de pipetpunt.
[Opmerking: Voor een goede transductie efficiency te controlerency het gebruik van een controle virus dat GFP is gunstig als eilandjes kan dan worden afgebeeld via confocale microscopie de penetratie van de adenovirus controleren in de eilandjes kern.]
- Cultuur de eilandjes tegen 24-72 uur, afhankelijk van de gewenste tijdstip van het experiment van optimalisatie pilotstudies. Bijvoorbeeld kan inductie van een proliferatieve reactie vereist keer variërend van 24-72 uur of knockdown van het gen van belang kan 48 of 72 uur vereist. Breng de eilandjes vers medium per dag.
- Voor de laatste 24 uur van het experiment cultuur de eilandjes in media die een pCi [methyl-3H] -thymidine/ml media (meestal 1 pi thymidine / ml medium).
[Opmerking: Vanaf dit punt volgt u de institutionele protocollen voor de behandeling, het gebruik en de verwijdering van radioactieve stoffen.]
2. Insulinesecretie Assay
- Bereid desecretie assay buffer (SAB) 10X stockoplossing (1,14 M NaCl, 47 mM KCl, 12 mM KH 2 PO 4, 11,6 mM MgSO 4) en CaCl 2 100X voorraad-oplossing (0,25 M CaCl 2). Deze voorraad oplossingen kunnen van tevoren worden bereid en bewaard bij kamertemperatuur.
- Vers bereiden 50 ml van de werking SAB (5 ml 10X SAB 1 ml 1 M HEPES, 0,5 ml 100X CaCl2, 0,28 ml 35% BSA, 0,11 g NaHCO 3 en steriel water 50 ml) in een 50 ml conische buis warm tot 37 ° C door in een 37 ° C waterbad.
- Pipetteer 10 ml van de SAB in een 15 ml conische buis en voeg 66,8 pi 2,5 M D-glucose tot de hoog glucose (16,7 mM) SAB bereiden.
- Voeg 44,8 pi 2,5 M D-glucose tot de resterende 40 ml van de SAB het lage glucose (2,8 mM) SAB bereiden.
- Label drie 1,7-ml microcentrifugebuizen voor elk putje van de 6-well plaat en voeg 1 ml van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). [Opmerking: Omdat de eilandjes zijn radioactief, volg dan de institutionele protocollen voor de behandeling, het gebruik en de verwijdering van radioactieve stoffen.]
- Plaats 20 eilandjes in elk microcentrifugebuis. Maak elke poging om vergelijkbare grootte eilandjes toe te voegen aan elke microcentrifugebuis. Bijvoorbeeld kan elke buis bevat 5 kleine, 10 medium-en 5 groot formaat eilandjes (zie figuur 1).
- Nadat de eilandjes hebben zich op de bodem van de buis door de zwaartekracht (~ 2 min), de zuig PBS met een micropipet en verwijderen.
- Voor pre-incubatie, voeg 400 ul van de lage glucose SAB, plaats de buizen (met hun doppen open) in de weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO 2), en pre-incubeer gedurende 60 minuten. Zuig de pre-incubatie lage glucose SAB en gooi het weg.
- Voor basale insuline secretie, voeg 400 ul van de lage glucose SAB, plaats de buizen (met hun doppen open) in de weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO 2), en incubeer gedurende 60 minuten. Verzamel de lage glucose SAB en sparen voor de insuline radioimmunoassay.
- Voor gestimuleerde insuline toevoegen 400 ul van de hoge glucose SAB plaatst de buizen (met doppen open) in weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO2), en incuberen gedurende 60 minuten. Verzamel de hoge glucose SAB en sparen voor de insuline radioimmunoassay.
- Voeg 1 ml PBS, na de eilandjes hebben zich op de bodem van de buis door de zwaartekracht, de PBS zuigen met een micropipet verwijderen, en herhalenstap een keer.
- Voeg 500 ul ijskoud trichloorazijnzuur (TCA, 10% w / v) en incuberen op ijs gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer de buizen 16 000 g gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Zuig het TCA toevoegen van 80 pi 0,3 N NaOH en geïncubeerd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Gedurende deze tijd krachtig vortex de monsters gedurende 5-10 s elke 10 minuten.
- Voeg 4 ml van Econo-safe tellen cocktail tot en met 7 ml vloeistofscintillatietelling buizen.
- Voeg 50 ul van het monster aan de scintillatietelling buis, klap op de vuurpijl de buis, schud even, en tel in een vloeistof scintillatieteller.
- Meet de eiwitconcentratie met de bicinchoninic zuur (BCA-assay) en 10 ul van het monster volgens protocol van de fabrikant.
- Voer de insuline radioimmunoassay volgende protocol van de fabrikant.
- Normaliseren de insuline secretie en thymidine gegevens met het eiwit concentration.
[Opmerking: Eilandjes kan worden gevisualiseerd met behulp van een dissectie stereoscoop of een standaard microscoop.]
[Opmerking: Als alternatief regelen door de zwaartekracht, de buisjes worden gecentrifugeerd bij 300 g gedurende 1 min.]
3. Thymidine Assay
4. Data-analyse
5. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van het experiment eiland replicatie en bètacelfunctie in rat eilandjes beoordelen is weergegeven in figuur 2. Dit voorbeeld toont aan dat adenovirale overexpressie van hypothetische "Gene # 6" robuust eilandje replicatie stimuleert zonder dat bèta-cel functie. In het bovenpaneel van de resultaten van de test thymidine tonen dat het verhogen van de expressie van "Gene # 6" DNA-synthese, zoals gemeten door de opname van thymidine vergroot. Omdat de meeste van de cellen in de rat eilandjes zijn beta cellen, is het waarschijnlijk dat de verhoging in thymidine een toename in beta celdeling aangeeft. Er moet echter bevestigende experimenten worden uitgevoerd om vast te stellen dit. In het onderste paneel, de resultaten van de insuline secretie test aan te tonen dat overexpressie van "Gene # 6" bracht geen verandering in een van de primaire beta cel functie, dat wil zeggen, insulin afscheiding bij lage en hoge glucose. De kwaliteit van de isolatie eiland en de gezondheid van de eilandjes na behandeling met adenovirussen is aangegeven door de voudige toename insuline bij lage en hoge glucose concentraties. Bij het verhogen van de expressie van "Gene # 6" verminderde bètacelfunctie, zou waarschijnlijk weergegeven als een verlaging van de insuline afgescheiden hoog, stimulerende glucose concentraties (16,7 mM). Een dosis-response curve voor het variëren glucose concentraties kan worden uitgevoerd.
Figuur 1. Overzicht van protocol bij eilandje replicatie-en bèta-cel functie te beoordelen in geïsoleerde eilandjes rat na adenovirale-gemedieerde veranderingen in genexpressie. Vers geïsoleerde ratten eilandjes worden blootgesteld aan adenovirussen gedurende 24 uur en vervolgens gekweekt tot 96 uur. Thymidine wordt beoordeeld in de laatste 24 uur, gevolgd door het meten van insuline oplage en hoge glucose.
Figuur 2. Resultaten van een experiment met een controle adenovirus en een adenovirus overexpressie een hypothetische gen label "Gene # 6". Het bovenste paneel toont de thymidine en het onderste paneel van de insuline secretie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vaststelling van trajecten waarmee die kunnen worden gegoten om de replicatie te stimuleren en de functie van beta-cellen te verbeteren van belang zijn voor zowel grote vormen van diabetes. Omdat de functionele beta cel massa is afhankelijk van het bestaan en de functie van insuline-afscheidende cellen, de beoordeling van deze determinanten tegelijkertijd heeft zo zijn voordelen. Dit protocol beschrijft een gestroomlijnde protocol om te bepalen of overexpressie of onderdrukking van een eiwit leidt tot veranderingen in de functionele beta cel massa in vitro, die vervolgens kunnen de werkzaamheid worden getest in vivo.
Een beperking van dit protocol is dat het eilandje is een micro-orgaan dat bestaat uit vele soorten cellen, met inbegrip van maar niet beperkt tot alfa-, bèta-, delta, epsilon, en PP cellen. Een verandering in eilandjes replicatie niet volledig te vertalen naar een verandering in beta celdeling door 80-90% van de cellen bij de rat eilandjes zijn beta cellen. De mogelijkheid dat een waargenomen verandering in eilandjesreplicatie is te wijten aan niet-beta cel replicatie bestaat. Zo zou een logische en bevestigende volgende stap om dit protocol te onderzoeken beta cel replicatie met het gebruik van thymidine-analogen gekoppeld aan immunofluorescentie of FACS-analyse 5,6. Deze bevestigende analyse kan ook verlichting van de potentiële zorg van niet-specifieke thymidine incorporatie in eilandjes onafhankelijk van proliferatie.
Een mogelijk nadeel schuilt in de transductie van adenovirussen. Een transductie efficiëntie van 60-70% is redelijk te bereiken, maar een belangrijke bepalende factor voor de effectiviteit is de timing van de adenovirale transductie. Het is essentieel om de cultuur van de geïsoleerde eilandjes in de adenovirussen zo snel mogelijk te transductie efficiëntie te maximaliseren. Binnen een paar uur na het eilandje isolatie het eilandje begint te contracteren, waardoor die de mogelijkheden van het adenovirus tot diep in de kern van het eilandje. Het gebruik van een reporter-construct, zoalseen adenovirus in GFP, in combinatie met confocale microscopie kan gunstig zijn voor het evalueren van transductie efficiëntie.
De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn: 1) de efficiency van het testen van meerdere determinanten van functionele beta cel massa op dezelfde pool van eilandjes en 2) de kleine aantallen eilandjes nodig is om het protocol (een typische rat eilandje isolatie levert 400 eilandjes uit te voeren) . Deze voordelen maken dit protocol te worden gebruikt als screening tool voor meerdere genen in een gematigd tempo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidie DK078732 van de NIH (naar PTF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR | |
References
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).
- Keenan, H. A. Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study. Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).
- Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans. Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).
- Fueger, P. T. Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function. Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).
- Schisler, J. C. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).
- Chan, C. B. Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets. Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53, 149-159 (2004).
- Icyuz, M. Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1. Transplantation. 87, 821-824 (2009).
- Kaneto, H. Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).
- Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O'Doherty, R. M., Newgard, C. B. Metabolic engineering with recombinant adenoviruses. Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).
- Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O'Doherty, R. M. Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells. Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).
- Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels. J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).
- Csete, M. E. Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function. Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).
- Csete, M. E. Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors. Transplantation. 59, 263-268 (1995).
- Meng, Z. X. Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest. Diabetologia. 52, 125-135 (2009).
- Ronnebaum, S. M. A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion. J. Biol. Chem. , (2006).
- Milburn, J. L. Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids. J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).
- Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. Murine Pancreatic Islet Isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
