Summary
Этот протокол позволяет выявить факторы, которые модулируют функциональную бета клеточной массы, чтобы найти потенциальных терапевтических мишеней для лечения сахарного диабета. Протокол состоит из обтекаемой метод оценки репликации островок и функции бета-клеток островков в изолированных крыс после манипуляций экспрессии генов с аденовирусов.
Abstract
Гомеостаза глюкозы в первую очередь контролируется инсулином эндокринных гормонов и глюкагон, который вырабатывается в поджелудочной бета-и альфа-клетки, соответственно. Функциональные клеточной массы бета определяется анатомическими клеточной массы бета, а также способность бета-клеток в ответ на биогенной нагрузки. Потеря функциональной клеточной массы бета занимает центральное место как основные формы сахарного диабета 1-3. В то время как снижение функциональной бета клеточной массы результате аутоиммунной атаки на сахарный диабет 1 типа, при диабете 2 типа, это уменьшение развивается как с неспособностью бета-клетки секретируют инсулин должным образом и разрушения бета-клеток из кадровых механизмов. Таким образом, усилия по восстановлению функциональной бета клеточной массы имеют огромное значение для лучшего лечения и потенциальных методов лечения диабета.
Ведется работа по выявлению молекулярных путей, которые могут быть использованы, чтобы стимулировать репликации и повышению функции бета-клеток.В идеале, терапевтических целей позволит улучшить как бета-клеточный рост и функцию. Возможно, более важно, хотя это определить, является ли стратегия, которая стимулирует рост клеток бета происходит за счет нарушая функцию бета-клетки (например, с некоторых онкогенов), и наоборот.
Путем систематического подавления или гиперэкспрессией выражение целевых генов в изолированных островков крысы, можно выявить потенциальных терапевтических мишеней для повышения функциональной клеточной массы бета 4-6. Аденовирусных векторов могут быть использованы для эффективного гиперэкспрессией или нокдаун белка в изолированных островков крысы 4,7-15. Здесь мы представляем способ манипулировать экспрессии генов использования аденовирусной трансдукции и оценить островок репликации и функции бета-клеток островков в изолированных крыс (рис. 1). Этот метод был использован ранее для определения новых целей, которые модулируют бета репликации клетки или функции 5,6,8,9,16,17.
Protocol
1. Аденовирусные трансдукция и культивирования Крысы островков
- Подготовка 6-и не-культуры тканей покрытием пластины, добавив 2 мл среды (RPMI 1640 средах, содержащих 8 мМ глюкозы, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина) для необходимого количества скважин. Например, типичный эксперимент может потребовать трех скважин - по одной для не-Virus Control, вирус управления (например, GFP-экспрессирующих аденовирус), а в экспериментальной группе.
- Теплые пластины до 37 ° C, поместив его в культуре ткани инкубатор, по крайней мере 30 мин.
- Сразу же после крысы островок изоляции 18,19, место 100-200 островков в отдельных скважинах 6-и не-культуры тканей покрытием пластины. Шестьдесят островки необходимы для секреции инсулина и анализы тимидина. Остальные островки могут быть использованы для изоляции РНК для исследования экспрессии генов или белков изоляции иммуноблоттинга.
[Примечание: Начиная с этого момента, пожалуйста, следуйте институциональных протоколов для обработки, использования и утилизации биологически опасных материалов.]
- Осторожно вращать пластину довести островков в центре колодца.
- Пипетировать аденовирус непосредственно на островки в центре блюда. Используйте 100-500 кратности инфекции (МВД, соотношение клеток-мишеней к вирусным бляшкообразующих единиц).
- Пусть остальные островки в течение 5 мин.
- Поместите пластину в культуре ткани инкубатор (37 ° C, 5% CO 2).
- Через 24 часа, осторожно вращать пластину довести островков в центрах колодцы и передать островки помощью P200 микропипетки на новый и свежий содержащие средства массовой информации. Если островки привязываться к плите, они могут быть слегка выбили с кончика пипетки.
[Примечание: Чтобы убедиться в адекватной эффек трансдукциису, использование контроль вируса выражения GFP выгодно, так как островки могут быть отображены с помощью конфокальной микроскопии для проверки проникновения аденовирус в островок ядра.]
- Культура островки для дополнительных 24-72 ч, в зависимости от желаемых сроков эксперимента в исследованиях оптимизации пилота. Например, индукция пролиферативной реакции могут потребовать раз от 24-72 ч или нокдаун гена может потребоваться 48 или 72 часов. Передача островков на свежий СМИ каждый день.
- Для окончательного 24 часов эксперимента, культуры островков в среде, содержащей 1 мкКи [метил-3 H] -thymidine/ml средства массовой информации (как правило, 1 мкл тимидина / мл среды).
[Примечание: Начиная с этого момента, пожалуйста, следуйте институциональных протоколов для обработки, использования и захоронения радиоактивных материалов.]
2. Анализ секреции инсулина
- Подготовьтесекреции буфером (НКС) 10X маточного раствора (1,14 М NaCl, 47 мМ KCl, 12 мМ KH 2 PO 4, 11,6 мМ MgSO 4) и CaCl 2 100X маточного раствора (0,25 М CaCl 2). Эти растворы можно приготовить заранее и хранить при комнатной температуре.
- Недавно подготовить 50 мл рабочего SAB (5 мл 10X SAB, 1 мл 1 HEPES М, 0,5 мл 100X CaCl 2, 0,28 мл 35% BSA, 0,11 г NaHCO 3, и стерильной водой до 50 мл) 50 мл коническую трубку и теплой до 37 ° С, поставив в 37 ° С водяной бане.
- Внесите 10 мл рабочего SAB в 15 мл коническую трубку и добавьте 66,8 мкл 2,5 М D-глюкозы подготовить высокий уровень глюкозы (16,7 ммоль) SAB.
- Добавить 44,8 мкл 2,5 М D-глюкозы в оставшиеся 40 мл рабочего SAB подготовить низкий уровень глюкозы (2,8 ммоль) SAB.
- Обозначения трех 1,7 мл микроцентрифужных труб для каждой скважины 6-луночного планшета и добавить 1 мл фосфатно-солевом буфере (PBS). [Примечание: Как островки являются радиоактивными, пожалуйста, следуйте институциональных протоколов для обработки, использования и захоронения радиоактивных материалов.]
- Место 20 островков в каждом микроцентрифужных трубку. Сделайте все попытки добавить сравнительно размера островков каждого микроцентрифужных трубку. Например, каждая трубка может содержать 5 малых, 10 средних и 5 больших размеров островков (см. Рисунок 1).
- После того, как островки поселились в нижней части трубки под действием силы тяжести (~ 2 мин), аспирацию PBS с микропипетки и выбросить.
- Для предварительной инкубации, добавить 400 мкл низкой Gluудобно расположиться SAB, поместите трубки (с крышками открытые) в культуре ткани инкубатор (37 ° C, 5% СО 2) и предварительно инкубировать 60 мин. Аспирируйте предварительной инкубации низкий уровень глюкозы SAB и брака.
- Для базальной секреции инсулина, добавьте 400 мкл низкий уровень глюкозы в SAB, поместите трубки (с крышками открытые) в культуре ткани инкубатор (37 ° C, 5% CO 2), и выдержать в течение 60 мин. Соберите низкий уровень глюкозы SAB и за исключением инсулина радиоиммунологического.
- Для стимулировать секрецию инсулина, добавить 400 мкл высокий уровень глюкозы в SAB, поместите трубки (с крышками открытые) в культуре ткани инкубатор (37 ° C, 5% CO 2), и выдержать в течение 60 мин. Соберите высокий уровень глюкозы в SAB и за исключением инсулина радиоиммунологического.
- Добавить 1 мл PBS, после того, как островки поселились в нижней части трубки под действием силы тяжести, аспирации PBS с пипетки, отбросить, и повторить этоодин раз.
- Добавить 500 мкл ледяной кислоты трихлоруксусной (ТСА, 10% вес / объем) и инкубировать на льду в течение 30 мин.
- Центрифуга труб на 16 000 мкг в течение 3 мин при 4 ° C.
- Аспирируйте ГТС, добавить 80 мкл 0,3 N NaOH, и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. В течение этого времени энергично вихрь образцов в течение 5-10 с каждые 10 мин.
- Добавить 4 мл Econo безопасного подсчета коктейль 7 мл жидкого сцинтилляционного счет трубы.
- Добавить 50 мкл образца сцинтилляционного счет трубы, крышки трубки, встряхните кратко, и рассчитывать на сцинтилляционного счетчика.
- Измерение концентрации белка использованием bicinchoninic кислоты (BCA) Анализ и 10 мкл образца в соответствии с протоколом производителя.
- Выполните следующие инсулина радиоиммунологического протокол производителя.
- Нормализация секреции инсулина и данные тимидина с белком концentration.
[Примечание: Островки могут быть визуализированы с помощью либо рассечение стереоскоп или стандартного микроскопа.]
[Примечание: в качестве альтернативы решения под действием силы тяжести, трубы могут быть центрифугировали при 300 мкг в течение 1 мин.]
3. Анализ тимидина
4. Анализ данных
5. Представитель Результаты
Пример эксперимента по оценке островок репликации и функции бета-клеток островков у крыс показано на рисунке 2. Этот пример показывает, что аденовирусная гиперэкспрессия гипотетический "ген № 6" надежно стимулирует островок репликации без изменения функцию бета-клеток. В верхней панели, результаты анализа включения тимидина показали, что увеличение выражения "Gene № 6" увеличивает синтез ДНК, если судить по включению тимидина. Потому что большинство клеток у крыс островок являются бета-клеток, вполне вероятно, что это увеличение тимидина указывает на увеличение бета репликацию клеток. Тем не менее, подтверждающих эксперименты должны быть выполнены, чтобы твердо установить это. В нижней части панели, результаты анализа секреции инсулина показали, что гиперэкспрессия "Gene № 6" не изменили одной из основных функций клетки бета, то есть яnsulin секрецию при низких и высоких глюкозы. Качество изоляции островок и здоровье островков после лечения аденовирусы указывается кратное увеличение секреции инсулина при низких и высоких концентраций глюкозы. Если увеличение выражение "Gene № 6" нарушением функции бета-клетки, это, скорее всего, отражается как уменьшение инсулин выделяется при высоких, стимулирующие концентрации глюкозы (16,7 мм). Кривой доза-реакция для различных концентраций глюкозы также может быть выполнена.
Рисунок 1. Обзор протокола оценки репликации островок и бета-функции клеток в изолированных островков крысы после аденовирусной опосредованных изменений в экспрессии генов. Свежевыделенных островков крысы подвергаются аденовирусов в течение 24 ч, а затем культивировали до 96 час. Тимидина оценивается в финале 24 ч, после чего измерения секреции инсулина внизким и высоким содержанием глюкозы.
Рисунок 2. Результаты эксперимента с использованием аденовируса контроля и аденовирус гиперэкспрессией гипотетический ген назвали «Гена № 6". На верхней панели отображается тимидина и нижней панели секреции инсулина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Создание путей, которые можно модулировать по стимулированию репликации и повышению функции бета-клеток имеют отношение к обоим основные формы сахарного диабета. Поскольку функциональные клеточной массы бета зависит от существования и функционирования инсулин клетки, оценки этих детерминант одновременно имеет свои преимущества. Этот протокол описывает обтекаемый протокол для выявления ли гиперэкспрессия или подавление белка приводит к изменению функциональной клеточной массы бета-версии в пробирке, которые затем могут быть проверены на эффективность в естественных условиях.
Один из недостатков этого протокола является то, что островок представляет собой микро-орган, состоящий из многих типов клеток, включая, но не ограничиваясь альфа, бета, дельта, эпсилон, и ПП клетки. Изменение островок репликация не может полностью перевести на изменения в бета репликации клетки, так как 80-90% клеток у крыс островок являются бета-клеток. Возможность того, что наблюдаемые изменения в островкеРепликация в связи с не-бета-клеток репликации существует. Таким образом, логический и подтверждающие следующий шаг в этом протоколе может быть изучение бета-клетки репликации с использованием аналогов тимидина связан с иммунофлюоресценции или FACS анализ 5,6. Этот подтверждающий анализ может также облегчить потенциальную опасность неспецифических тимидина в островки независимой распространения.
Другой потенциальный недостаток заключается в трансдукции эффективность аденовирусы. Трансдукция эффективность 60-70% является разумным достичь, но ключевым фактором, определяющим эффективность сроки аденовирусной трансдукции. Важно, чтобы культура изолированных островков в аденовирусы как можно скорее, чтобы максимизировать эффективность трансдукции. Через несколько часов после того, как островок изоляции островок начинает сокращаться, тем самым ограничивая способность аденовируса проникать глубоко в ядре островок. Использование репортер конструкции, такие какаденовирус выражения GFP, в сочетании с конфокальной микроскопии могут быть полезны для оценки эффективности трансдукции.
Основными преимуществами этого протокола являются: 1) эффективность тестирования нескольких детерминант функциональной клеточной массы бета-версии на одном пуле островков и 2) небольшое количество островков, необходимые для выполнения протокола (типичный изоляции островок крысы дает 400 островков) . Эти преимущества позволяют это протокол, который будет использоваться в качестве скринингового инструмента для нескольких генов в умеренном темпе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом DK078732 из NIH (в ПТФ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR | |
References
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).
- Keenan, H. A. Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study. Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).
- Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans. Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).
- Fueger, P. T. Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function. Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).
- Schisler, J. C. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).
- Chan, C. B. Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets. Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53, 149-159 (2004).
- Icyuz, M. Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1. Transplantation. 87, 821-824 (2009).
- Kaneto, H. Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).
- Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O'Doherty, R. M., Newgard, C. B. Metabolic engineering with recombinant adenoviruses. Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).
- Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O'Doherty, R. M. Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells. Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).
- Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels. J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).
- Csete, M. E. Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function. Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).
- Csete, M. E. Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors. Transplantation. 59, 263-268 (1995).
- Meng, Z. X. Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest. Diabetologia. 52, 125-135 (2009).
- Ronnebaum, S. M. A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion. J. Biol. Chem. , (2006).
- Milburn, J. L. Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids. J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).
- Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. Murine Pancreatic Islet Isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
