Summary
Förster transferencia de energía de resonancia (FRET) microscopía es una poderosa técnica para monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas utilizando biosensores diversos como los periodistas. Aquí describimos cómo construir un epifluorescencia personalizado FRET sistema de imágenes a partir de componentes disponibles en el mercado y cómo usarlo para FRET experimentos.
Abstract
Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) microscopía continúa ganando creciente interés como una técnica para la monitorización en tiempo real de eventos bioquímicos y de señalización en las células vivas y tejidos. En comparación con los métodos bioquímicos, esta nueva tecnología se caracteriza por una alta resolución temporal y espacial. FRET experimentos utilizar diversos genéticamente codificados con biosensores que pueden ser expresados y la imagen con el tiempo in situ o in vivo 1-2. Biosensores típicos pueden reportar interacciones proteína-proteína mediante la medición de FRET entre un par fluoróforo de etiquetado de proteínas o cambios conformacionales en una única proteína que alberga fluoróforos donante y aceptor interconectados con un resto de unión para una molécula de interés 3-4. Biosensores bimoleculares para las interacciones proteína-proteína incluyen, por ejemplo, construye diseñado para controlar la activación de la proteína G en las células 5, mientras que los sensores unimoleculares meamedida digital cambios conformacionales son ampliamente utilizados para mensajeros segunda imagen tales como calcio 6, cAMP 7-8, fosfatos de inositol 9 y cGMP 10-11. Aquí describimos cómo construir un epifluorescencia personalizado FRET sistema de imágenes individuales de los componentes disponibles en el mercado y cómo controlar la configuración de todo el software gratuito con Micro-Manager. Este instrumento simple pero potente está diseñado para mediciones de rutina o más sofisticado FRET en células vivas. Imágenes obtenidas son procesadas usando auto-escrito plug-ins para visualizar los cambios en la relación de FRET en tiempo real durante todo experimento antes de ser almacenada en un formato de gráficos compatible con la construcción, en ImageJ software gratuito utilizado para el análisis posterior de los datos. Este sistema de bajo costo se caracteriza por una alta flexibilidad y puede ser utilizado con éxito para controlar varios eventos bioquímicos y moléculas de señalización por una plétora de biosensores disponibles FRET en células vivas y tejidos. Como un ejemplo, se demuestra hómo utilizar este sistema de imagen para realizar monitoreo en tiempo real de cAMP en células vivas de 293A a la estimulación con un agonista de los receptores β-adrenérgicos y bloqueantes.
Protocol
1. La creación de un microscopio de imagen FRET
En principio, cualquier microscopio de fluorescencia invertido que está disponible en el laboratorio y tiene un puerto de la cámara puede adaptarse para FRET formación de imágenes. La configuración final debe incluir los siguientes componentes fundamentales: un microscopio, una fuente de luz con o sin obturador adicional, un divisor de haz de emisión de luz y una cámara CCD (ver Figura 1). Los dispositivos de hardware, especialmente la fuente de luz, el obturador y la cámara están integrados en y controlados por el software de formación de imágenes que permite la adquisición y análisis de imágenes. A continuación se describe un procedimiento para montar un sencillo sistema de FRET a partir de componentes disponibles comercialmente.
- Conecte la fuente de luz al microscopio. Por ejemplo, utilice un diodo de una sola longitud de onda de emisión (p coolled E-100, 440 nm) que selectivamente estimula una mayor proteína cian fluorescente (PPC), utilizado como donante de FRET más biosensores. Puede ser directoLy y fácilmente conectado al puerto de iluminación epifluorescente del microscopio. Existen también múltiples longitudes de onda LEDs disponibles que pueden ser conectados de una manera similar. En lugar de las fuentes de luz LED, otros estándares tales como XBO75 lámpara de xenón de arco (a menudo utilizados para microscopios Zeiss y Olympus) o lámpara de mercurio HBO (normalmente instalado en microscopios Nikon) se puede utilizar. En el caso de una lámpara fluorescente, también deberías colocar una obturación entre la lámpara y el puerto de iluminación para permitir el control asistido por software de la luz de excitación que viene en su muestra. Coolled no requiere ninguna obturación adicional ya que puede ser directamente enciende y se apaga por el software. La desventaja de los sistemas de un solo color del LED es un número limitado de longitudes de onda de excitación, mientras que una lámpara fluorescente con diferentes conjuntos de filtro es una opción más flexible, especialmente cuando se trabaja con biosensores múltiples y bimolecular. Alternativamente, las fuentes de luz (por ejemplo monocromador Polychrome V, TILLPhotonics) puede serutilizado, por lo general tienen un obturador integrado que puede ser controlado por software a través de una señal de disparo.
- Coloque un cubo de filtro adecuado en el microscopio. Por rutina FRET mediciones con PPC y mejorar la proteína amarilla fluorescente (YFP) o cualquiera de sus variantes como un par de FRET, se utiliza un simple cubo de filtro que contiene un filtro de excitación ET436/30M (que puede ser omitido cuando el LED se utiliza, pero es indispensable cuando se utiliza una lámpara de xenón o de mercurio en lugar de LED) y un espejo dicroico DCLP455. El microscopio también debe estar equipado con un objetivo adecuado para una microscopía de fluorescencia de buena resolución, por ejemplo con un plan-fluor, plan Neofluar-o plan-Apochromat 40x, 60x o 100x de inmersión en aceite objetivo.
- Encienda la luz fluorescente y comprobar si el haz de luz se distribuye uniformemente en todo el campo de visión. Si este no es el caso, la alineación adicional de la LED o de la lámpara se requiere para lograr la iluminación óptima de la muestra. Esto puede ser realizadosmed utilizando los tornillos que la posición del diodo o la lámpara en el espacio.
- Conecte el divisor de haz a través de un C-mount a uno de los puertos de emisión del microscopio. Por ejemplo, utilice la DualView DV2 (Fotometría) que divide la emisión de luz en dos (donante y receptor) canales que pueden ser monitoreados simultáneamente en un chip sola cámara CCD. Alternativamente, existen otros productos comparables tales como Optosplit (Cairn Research) o un divisor de haz integrado en la Hamamatsu ORCA-D2 de doble longitud de onda cámara. Para el CFP / YFP FRET par, se utiliza el 05-EM Juego de filtros que contiene el espejo dicroico 505dcxr más ET480/30M y filtros ET535/40M emisión de CFP y YFP, respectivamente, que se suministra con la DV2. En lugar de un divisor de haz, dos cubos de filtros para el donante (que contiene el filtro de excitación ET436/30M para PPC, el espejo dicroico DCLP455 y el filtro de emisión PPC) y aceptor (que contiene la PPC de filtros de excitación, DCLP455 y el filtro de emisión YFP) canales se utilizan enmuchos sistemas de FRET. Alternativamente, un cubo de filtro sin ningún filtro de emisión y una posición de emisión automática rueda de filtros antes de que la cámara se puede instalar. En este caso, un microscopio motorizado o los suplentes de la rueda de filtro entre las dos posiciones filtro de emisión dentro de ~ 200-300 mseg para llevar a cabo la formación de imágenes radiométrica. Esta pequeña demora es aceptable cuando la imagen más bien lentos procesos intracelulares, tales como señales de campo, en donde la adquisición verdaderamente simultánea de ambos canales no es crítica.
- Conectar la cámara CCD (por ejemplo uso ORCA-03G o ORCA-R2 de Hamamatsu Photonics) para el divisor de haz. Utilice un cable FireWire para conectar la cámara a la interfaz IEEE1394 equipo, como se describe en el manual suministrado con la cámara. Instalar controladores de la cámara sin necesidad de encender la cámara.
- Por último, para establecer la comunicación entre el ordenador y la fuente de luz, conecte el Arduino E / S (utilice por ejemplo Arduino Duemilanove Arduino Uno o) para el LED o to el obturador mediante un cable BNC que debe contener un enchufe BNC normal en el lado del LED y dos cables individuales en el otro extremo conectado al GND pins (0) y 8 de la junta como se muestra en la Figura 2. La junta ensamblada se puede conectar directamente a un puerto USB de su ordenador.
2. Instalación del software de imágenes
Para controlar y sincronizar la fuente de luz con captura de imagen por la cámara, el software de formación de imágenes debe ser instalado en el equipo. Hay varios paquetes de software disponibles comercialmente, incluidos MetaFluor (Molecular Devices), Slidebook (Intelligent imágenes Innovaciones), VisiView (Sistemas Visitron). Aquí se demuestra el uso de la abrir-fuente Micro-Manager freeware que ofrece un alto grado de flexibilidad a bajo costo de obtención de imágenes.
- Descargue este software en http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Micro-Manager_Version_Archive. Se recomienda instalar la versión 1.4.5 que se puede configurar fácilmente en nuestras manos.
- Conecte la placa Arduino a un puerto USB de su ordenador. Descargue el software para el control de la placa Arduino desde http://www.arduino.cc/en/Main/software . Siga las instrucciones que se encuentran en este sitio web y ejecutar este software una sola vez antes de comenzar Micro-Manager. Sube un código de uso de la tabla con Micro-Manager software. El código puede ser descargado en http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Arduino .
- Encender el LED y la cámara. Inicie el software y configurar Micro-Manager comunicación con la cámara y el LED (fuente de luz y el obturador), seleccione Herramientas> Configuración de Hardware Wizard (ver Figura 3). Añada los componentes requeridos, incluyendo la cámara(Es decir, Hamamatsu_ DCAM) y Arduino Board (añadir Arduino-Switch, Hub-Arduino Arduino y los dispositivos de obturación). Durante los próximos pasos, utilice los valores por defecto sugeridos por el asistente. Guarde la nueva configuración del sistema cuando se le indique el asistente.
- Utilice el menú principal para abrir dispositivo de herramientas> Explorador de propiedades. Desplácese hasta la opción "Cambiar Estado Arduino" y seleccione "1". Cierre el cuadro de diálogo. Asegúrese de que el "auto-shutter" casilla está marcada en el cuadro de diálogo principal del software. Pulse Archivo> Guardar estado del sistema para guardar la configuración de software que debe abrirse en cualquier momento después de iniciar el software. Esto establecerá la comunicación entre la tarjeta y el software necesario para llevar a cabo la adquisición de imágenes.
- Pulse el botón "vivo" para controlar la señal procedente de la cámara. Asegúrese de que la luz fluorescente se enciende en cualquier momento "en vivo" o "Snap" función seleccionada. Antes de iniciar las primeras mediciones, siga las instrucciones suministradas con el divisor de haz para cadaformar la alineación óptica de los dos canales.
3. Cultivo celular y transfecciones
- Preparar placas de 6-y con autoclave redondas 24 mm cubreobjetos de vidrio (1 coverslide por pocillo). Alternativamente, el vidrio de fondo platos de cultivo celular se puede utilizar.
- Placa 293A células en las placas o platos en D-MEM (medio suplementado con 10% de FCS, 1% de L-glutamina y 1% de solución de penicilina / estreptomicina) a fin de que las células alcanzan 50-70% de confluencia después de un día.
- 24 h después de la siembra, transfectar las células en una cabina de flujo laminar con un sensor FRET plásmido utilizando el método de transfección con fosfato de calcio (ver 3,5). plásmidos de AMPc biosensor puede ser obtenido a partir de nuestro grupo a solicitud. El lector también se refirió a los exámenes exhaustivos 7,8 describiendo otros biosensores AMPc disponibles.
- Antes de la transfección de células por primera vez, preparar los reactivos de transfección. Maquillaje de 2,5 M CaCl 2 y las soluciones 2xBBS (este último contiene1,5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM de BES, 280 mM NaCl, ajustar el pH a 6,95 con NaOH) en agua desionizada. Filtrado estéril las soluciones utilizando un filtro normal 0,2 micras.
- Para transfectar un 6-así placa o placas de 6 con fondo de vidrio, mezclar 10 g de FRET sensor plásmido, 50 l de 2,5 M CaCl 2 y solución de agua estéril hasta 500 l. Mezclar bien.
- Añadir 500 l de BBS 2x. Mezclar bien e incubar la mezcla durante 10 min a temperatura ambiente.
- Pipetear 165 l de la mezcla de transfección gota a gota en cada pocillo o plato. Revuelva suavemente la placa y vuelva a colocarlo en la incubadora. Las células generalmente están listos para FRET mediciones de 24 h después de la transfección. Asegúrese de que las células no han alcanzado la confluencia en este punto, ya que esto puede influir en la actividad de varios receptores de superficie celular.
4. Las mediciones de FRET en células vivas
- Antes de medir por primera vez, preparar el tampón de FRET que contiene 144 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, HEPES 10 mM en agua desionizada y ajustar el pH a 7,3 con NaOH. Diluir los compuestos para ser utilizados en los experimentos de sus imágenes con el tampón de FRET.
- Inicie el software de imágenes. Cargar configuración del sistema previamente definido. Seleccione Archivo> Estado del sistema de carga para seleccionar el estado del sistema previamente configurado.
- Montar una coverslide con adherentes células transfectadas 293A en la cámara de imágenes (por ejemplo, cámara de celular Attofluor). Lavar las células una vez con tampón de FRET y añadir 400 l de tampón de FRET. Cuando se utiliza vidrio de fondo de cultivo celular platos se lavan las células adherentes y añadir 2 ml de tampón por placa. Llevamos a cabo todas las mediciones a temperatura ambiente en el tampón que contenía HEPES FRET, de modo que no CO 2 de control es necesario.
- Ponga un poco de aceite de inmersión sobre el objetivo de la cámara y transferir imágenes en el microscopio. Centrarse en la capa de células con luz transiluminación.
- Encienda el lig fluorescenteht pulsando el botón "Live" botón, y seleccionar una celda para el experimento. Seleccione una celda con una expresión óptima del sensor, lo que significa que no debe ser demasiado brillante y no demasiado tenue. Después de encontrar una célula apropiada, apague la luz fluorescente de inmediato para evitar photobleaching del sensor FRET.
- Ajuste el tiempo de exposición en el epígrafe "Ajustes de la cámara" (generalmente 10-50 mseg) en un camino que conduce a una buena relación señal-ruido de la imagen adquirida después de pulsar el botón "Snap". Tiempos de excitación demasiado largos puede resultar en photobleaching, mientras ocasiones resulta demasiado corto en baja calidad de imagen.
- Pulse el botón "Multi-D Adq". botón y establecer el número de puntos de tiempo y el intervalo de tiempo para la adquisición de imágenes. Para nuestro cAMP-FRET sensor, adquirimos una imagen cada 5 s.
- Inicie la medición pulsando el botón "Adquirir".
- Durante una medición, se puede utilizar el "FRET línea" plug-in (disponible en el suplemento en línea, todos los plug-ins deben ser policíaied en la carpeta "plugins" de su Micro-Manager software antes de iniciarlo) para vigilar FRET cambios de relación en línea. Ejecutar este plug-in y seleccione una región de interés en la imagen FRET relación con el "selecciones a mano alzada" de la herramienta. Añadir a la región en el gestor de ROI y pulse el botón "Get media" en la serie "Tiempo analizador" de la ventana. El FRET rastro proporción será mostrado. Para actualizar la traza durante la medición, ejecute el "FRETratioOnline2" plug-in y pulse la tecla "GetAverage" botón.
- Tan pronto como la relación de FRET ha alcanzado una línea de base estable aplicar el compuesto deseado con precisión que en el vaso plato / cámara. Para el tratamiento de las células con compuestos farmacológicos, un sistema de perfusión en lugar de pipeteado simple se puede utilizar en esta etapa.
- Después de terminar el experimento, guarde la pila time-lapse de imágenes. Retire la cámara de medición del microscopio y limpie el objetivo con un tejido objetivo.
- Vuelva al paso 4.3 para repetir la medición con unnueva muestra.
5. Análisis de datos fuera de línea
FRET datos de las imágenes se puede analizar fuera de línea en cualquier momento después de que el experimento utilizando el software ImageJ. Como complemento a este protocolo, le ofrecemos el "FREToffline" plug-in utilizado en nuestro laboratorio para dividir las imágenes adquiridas en los canales de donantes y aceptor y medir intensidades fluorescentes en múltiples regiones de interés. Estas intensidades pueden además ser copia-pega en una hoja de cálculo de Excel o de origen para calcular la corrección FRET ratio. Para visualizar la FRET cambios de biosensores unimoleculares, ratiometry sencilla se utiliza a menudo. En este caso, sólo el fluoróforo donante (PPC) se excita y se toman dos imágenes en los picos de emisión de la PPC y YFP. El calculado YFP / CFP relación (a veces también referido como FRET / CFP ratio) representa el grado de FRET entre los dos fluoróforos. En biosensores unimoleculares, los números de PPC y YFP restos son iguales, de modo que la ratiometry simple es suficiente para representar la eficiencia FRET 12.
- Utilice el software ImageJ para abrir el archivo experimente seleccionando Plugins> Micro-Manager> Abrir Micro-Administrador de archivos.
- Ejecute el "FREToffline" plug-in que se divide la pila de lapso de tiempo en PPC individual y canales de YFP.
- Si la corrección de fondo se requiere, esto puede llevarse a cabo utilizando el software ImageJ.
- Haga clic en la pila YFP de imágenes y seleccionar una o varias regiones de interés utilizando la "selecciones a mano alzada" de la herramienta y añadirlos a la "MultiMeasure" plug-in ventana pulsando el botón "Añadir".
- Seleccione las regiones de interés en la "MultiMeasure" de la ventana y pulse el botón "Multi" para obtener una tabla con los valores medios de grises para cada cuadro y cada región. Copie los datos en el portapapeles seleccionando todo con Ctrl + A y pulsando Ctrl + C. Abra una hoja de cálculo de Excel o Origen y pegar los datos presionando Ctrl + V.
Las mediciones realizadas por el programa se puede configurar en Analizar> Set M easurements donde se pueden definir los parámetros a medir. Por lo general, sólo selecciona "Valor medio gris" en este diálogo. - Haga clic en la pila PPC de imágenes. Realizar el mismo que el descrito en 5,5. Pegue los datos de intensidad de la PPC en la misma hoja de cálculo Excel o Origen.
- Uso de Excel o software de origen, se calcula la relación de FRET corregido. Cuando sencillas de una sola cadena unimoleculares biosensores son imágenes, corregimos sólo para el bleedthrough de la fluorescencia del donante en el canal aceptor. En este caso, la corrección aceptor / donante relación es:
Ratio = (YFP - B x PPC) / PPC
Donde b es el factor de corrección que se puede determinar mediante la transfección de las células con el plásmido PPC y la medición de un porcentaje de la fluorescencia del donante en el canal YFP (B = YFP / CFP). La omisión de esta corrección para los biosensores unimoleculares es posible, ya que sólo afectaría a la amplitud global de la respuesta de FRET sin ningún efecto cualitativo sobre la forma de la curva.
La figura 1 muestra un ejemplo de una. Totalmente montado FRET configuración de imagen que consiste en un microscopio invertido Nikon, coolled, DV2 DualView y el Hamamatsu ORCA-03G cámara CCD Para establecer la comunicación entre los componentes de hardware y el ordenador, la E / S de la placa Arduino está conectado al ordenador y al coolled como se muestra en la Figura 2. Para controlar la fuente de luz y de captura de imagen por la cámara de manera sincronizada, Micro-Manager software tiene que ser instalado y configurado adecuadamente (ver Figura 3). Este freeware se puede adaptar fácilmente a las necesidades individuales experimentales mediante la adición de complementos necesarios. Figura 4A muestra un representante prima FRET traza relación de una medición en el sensor de cAMP Epac1-campos 13 se expresa en células 293A para supervisar los efectos de la β-adrenérgico isoproterenol aplican durante el punto 150 segundos y el apostar yA;-bloqueador propranolol añadida en el momento punto 300 seg (realizado como se describe en 4.3 a 4.10). Estos datos se pueden analizar fuera de línea y corregida por la bleedthrough de PPC en el canal YFP como se describe en 5.1-5.7 para obtener el. Corregida FRET traza relación mostrada en la Figura 4B Este experimento representativo muestra una lenta disminución en la proporción de FRET tras el tratamiento supervisado isoproterenol que indica un aumento del AMPc intracelular. Propranolol como un β-bloqueante invierte la señal de isoproterenol, conduciendo a una disminución de los niveles basales de AMPc. Estos cambios en la señal de FRET puede supervisarse en línea durante los experimentos (tal como se describe en 4,9). Estos experimentos se pueden realizar con una variedad de biosensores usados comúnmente diseñados para supervisar diferentes segundos mensajeros o procesos bioquímicos.
Diseño de la Figura 1. De la FRET configuración de imagen compuesta por un coolled, enverted microscopio Nikon, DV2 DualView, y ORCA-03G cámara CCD.
Figura 2. Arduino E / S y sus conexiones. El tablero se coloca en una caja de plástico auto-montado. Un estándar de cable BNC conecta el LED a los 8 pernos y GND (0) de la Junta.
Imágenes de la figura 3. Demuestren la integración de los componentes del sistema mediante el Asistente de configuración de hardware. A) Inicie el Asistente para la configuración de hardware. B) Agregue los dispositivos necesarios como se menciona en el punto 2.3. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 4. Un representante FRET experimentalt que mide los niveles de cAMP en las células transfectadas con Epac1 293A-campos. En primer lugar, las células se estimularon con el isoproterenol agonista β-adrenérgico (100 nM, en el fotograma 30 o a 150 segundos) para aumentar cAMP (observado como una disminución en YFP / CFP FRET ratio). Las células fueron tratadas posteriormente con la β-bloqueador propranolol (10 um, en el marco 60 o en 300 segundos) que conduce a un aumento de la relación de FRET, lo que refleja una disminución del cAMP. Una línea) Raw FRET traza relación de una región de interés correspondiente a una sola celda de seguimiento durante el experimento. B) rectif traza ratio después de análisis de datos fuera de línea realiza como se describe en 5.1-5.7.
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Discussion
en este protocolo, se demuestra cómo crear un simple y de bajo costo pero de gran alcance FRET sistema de imágenes para aplicaciones de rutina con una variedad de biosensores disponibles. El sistema que aquí se presenta está diseñado para PPC y YFP, o tipos similares de proteínas fluorescentes, como la pareja donante-aceptor. Mientras tanto, otros biosensores individuales estén disponibles que utilizan por ejemplo las proteínas fluorescentes verdes y rojas 14. Para adaptar el sistema descrito para otros colores, fuentes adecuadas de luz y / o conjuntos de filtro deben ser seleccionados. En el caso de los LED, otra línea solo LED, por ejemplo 490 nm para excitar la proteína fluorescente verde se puede utilizar. Single-longitud de onda de los LED puede ser fácilmente (en segundos) desmontó y se intercambian. Alternativamente, existen matrices de LED disponibles que contienen varias líneas para excitar varias proteínas fluorescentes (por ejemplo, PE-2 coolled). Para permitir que las mediciones con pares FRET alternativa, otros cubos de filtros fluorescentes se pueden colocar en la microsc opa, y, finalmente, las emisiones divisor de haz filtros deben ser cambiados. Fotometría ofrece deslizadores de emisiones adicionales de filtros para DV2 DualView. Algunas aplicaciones recientemente desarrollados utilizan dos o más biosensores para controlar simultáneamente varios procesos al mismo tiempo, por ejemplo cAMP y cGMP juntos en una célula 15. En este caso, un QuadView (Photometrics) que contiene cuatro canales de emisión puede ser utilizado, el ImageJ plug-in para la separación y análisis de imágenes se puede entonces adaptado para ser utilizado con cuatro canales y calcular a dos ratios de FRET. ImageJ software es muy flexible en términos de análisis de imágenes y la representación en línea de los resultados. Simple texto editado por plug-ins permiten una adaptación del algoritmo de software a las necesidades de cualquier sistema de imagen individual y experimento. Esto es a veces muy útil y ofrece soluciones rápidas a los problemas técnicos, que pueden requerir largos tiempos cuando tienen que ser implementado en cualquier paquete de software comercial.
contenido "> Al hacer FRET experimentos, es crucial para evitar fotoblanqueo que aparece cuando los tiempos de excitación son demasiado largas o cuando se toman las imágenes con demasiada frecuencia. En este caso, un daño químico inducido por fotón o modificaciones covalentes de fluoróforos pueden ocurrir y disminuir la eficiencia de FRET. Para evitar fotoblanqueo, se puede reducir el tiempo de exposición y la frecuencia de adquisición de la imagen. También hay protocolos establecidos 12,16 para corregir este fenómeno. Durante el análisis de datos, es posible corregir la diafonía entre canales de donante y aceptor (bleedthrough). Cuando se utiliza unimolecular FRET biosensores (en el cual el donante caso y fluoróforos aceptores se expresan siempre en el mismo nivel) para las mediciones ratiometric simples, puede ser suficiente para corregir sólo para la bleedthrough del donante en el aceptor canal o incluso omitir esta corrección completo, ya que no es cualitativamente afectar la forma de la curva de relación de FRET. El bleedthrough de thaceptor electrónico en el canal donante suele ser insignificante. Cuando biosensores bimoleculares compuestas de dos proteínas diferentes se utilizan, estos pueden ser expresadas en niveles diferentes. En este caso, la corrección bleedthrough y una corrección adicional para la excitación YFP particular a la luz 440 nm son también recomendables. Por favor, consultar el protocolo publicado 12 donde todos los procedimientos de corrección se describen en más detalle. Información adicional completa sobre el desarrollo de biosensores, FRET microscopía, las posibles dificultades de la técnica y sobre el análisis de datos están disponibles en los protocolos previamente publicados 17-18. En conclusión, el sistema de imágenes simple y potente aquí descrito proporciona una plataforma flexible para controlar varios eventos bioquímicos y moléculas de señalización con alta resolución temporal y espacial en las células vivas.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Anke Rüttgeroth Zimmermann y Karina de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvención NI 1301/1-1 a VON) y la Universidad de Göttingen Medical Center ("pro futura" otorgamiento de VON).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
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