Summary
Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Technik für die Echtzeit-Überwachung der Signalwege in lebenden Zellen mit verschiedenen Biosensoren als Reporter. Hier beschreiben wir, wie eine benutzerdefinierte Epifluoreszenz bauen FRET Imaging-System aus handelsüblichen Komponenten und wie es zu benutzen für Experimente FRET.
Abstract
Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Mikroskopie weiterhin zunehmendes Interesse als Technik zur Echtzeit-Überwachung von biochemischen und Signaltransduktion in lebende Zellen und Gewebe zu gewinnen. Im Vergleich zu klassischen biochemischen Methoden wird diese neuartige Technologie durch hohe zeitliche und räumliche Auflösung aus. FRET-Experimente verwenden verschiedene genetisch-codierten Biosensoren, die berechnet und abgebildet werden im Laufe der Zeit in situ oder in vivo 1-2 können. Typische Biosensoren können entweder berichten Protein-Protein-Wechselwirkungen, die durch Messen von FRET zwischen einem Fluorophor-markierten Paar von Proteinen oder Konformationsänderungen in einem einzelnen Protein, das Donor-und Akzeptor-Fluorophoren mit einem Bindungsanteil für ein Molekül von Interesse verbunden 3-4 birgt. Bimolekularen Biosensoren für Protein-Protein-Interaktionen umfassen beispielsweise, konstruiert zur G-Protein-Aktivierung in den Zellen 5 überwachen, während die unimolekularen Sensoren meaSuring Konformationsänderungen werden weit an image Botenstoffe wie Calcium 6, cAMP 7-8, Inositolphosphate 9 und cGMP 10-11 verwendet. Hier beschreiben wir, wie eine benutzerdefinierte Epifluoreszenz bauen FRET Imaging-System aus einzelnen kommerziell verfügbaren Komponenten und wie man das ganze Setup mit dem Micro-Manager freeware steuern. Diese einfache, aber leistungsfähige Gerät ist für den Routine oder mehr anspruchsvolle FRET-Messungen in lebenden Zellen konzipiert. Aufgenommenen Bilder werden unter Verwendung selbst geschriebenen Plug-Ins, um Änderungen in FRET-Verhältnis in Echtzeit während allen Experimenten zu visualisieren, bevor sie in einem Grafik-Format gespeichert werden mit der Build-in ImageJ freeware für spätere Datenanalyse verwendet. Diese Low-Cost-System zeichnet sich durch hohe Flexibilität aus und kann erfolgreich eingesetzt werden, um verschiedene biochemische Vorgänge und Signalmolekülen durch eine Vielzahl von zur Verfügung zu überwachen FRET Biosensoren in lebenden Zellen und Geweben. Als ein Beispiel zeigen wir how diese Bildgebungssystem zu verwenden, um die Echtzeit-Überwachung von cAMP in lebenden 293A-Zellen nach Stimulation mit einem β-adrenergen Rezeptor-Agonisten und-Blocker durchzuführen.
Protocol
Ein. Einrichten eines FRET Imaging Microscope
Im Prinzip kann jedes invertierten Fluoreszenzmikroskop erhältlichen im Labor ist und eine Kamera-Anschluss angepasst für FRET Bildgebung werden. Die endgültige Einstellung sollte folgende wesentliche Bestandteile: ein Mikroskop, eine Lichtquelle mit oder ohne zusätzliche Auslöser, ein Strahlteiler zur Emission Licht und einer CCD-Kamera (siehe Abbildung 1). Die Hardware-Geräte, insbesondere die Lichtquelle, der Verschluss und die Kamera integriert und gesteuert durch die Bildverarbeitungssoftware die Bildaufnahme und Analyse ermöglicht. Nachfolgend beschreiben wir ein Verfahren, um eine einfache FRET-System aus handelsüblichen Komponenten montieren.
- Schließen Sie Ihre Lichtquelle des Mikroskops. Zum Beispiel mit einer einzigen Wellenlänge Licht emittierende Diode (CoolLED p E-100, 440 nm), die selektiv erregt verbesserte cyan fluoreszierende Protein (GFP) als Spender in den meisten FRET Biosensoren. Es kann direktely und einfach an der Epifluoreszenz Beleuchtung Port des Mikroskop angeschlossen. Es gibt auch Multi-Wellenlängen-LEDs erhältlich, die in ähnlicher Weise geschaltet werden können. Anstelle von LED weiteren üblichen Lichtquellen wie XBO75 Xenonbogenlampe (oft für Olympus und Zeiss Mikroskope verwendet) oder HBO Quecksilberlampe (normalerweise auf Nikon Mikroskope installiert) verwendet werden. Im Falle einer Leuchtstofflampe, sollte Sie auch eine Blende zwischen der Lampe und Ausleuchtung Port software-gestützte Steuerung des Anregungslichts auf Ihren kommenden Probe zu ermöglichen. CoolLED erfordert keine zusätzlichen Verschluß da es direkt geschaltet werden können und Ausschalten durch die Software. Der Nachteil der einfarbige LED-Systeme ist eine begrenzte Anzahl von Anregungswellenlängen, während eine Leuchtstofflampe mit verschiedenen Filter-Sets ist eine flexiblere Option, vor allem beim Arbeiten mit mehreren und bimolekularen Biosensoren. Alternativ kann Monochromator Lichtquellen (zB Polychrome V, TILLPhotonics) seinverwendet, sie haben in der Regel einen integrierten Verschluß, der über eine Software-Triggersignal gesteuert sein kann.
- Zeigen eines geeigneten Filters Würfel in das Mikroskop. Für Routine-Messungen mit CFP und verbesserte gelb fluoreszierendes Protein (YFP) oder einer ihrer Varianten wie ein Paar FRET FRET, verwenden wir einen einfachen Filter cube mit einer ET436/30M Anregungsfilter (die weggelassen werden, wenn LED verwendet werden kann, ist aber unverzichtbar bei Verwendung einer Xenon-oder Quecksilber-Lampe anstatt LED) und einen dichroitischen Spiegel DCLP455. Das Mikroskop sollte auch mit dem Ziel für eine gute Auflösung der Fluoreszenzmikroskopie ausgerüstet werden, zum Beispiel mit einem Plan-Fluor, Plan-Neofluar oder Plan-Apochromat 40x, 60x oder 100x Ölimmersionsobjektiv.
- Einschalten des Fluoreszenzlichtes und prüfen, ob der Lichtpunkt gleichmäßig über das Sichtfeld verteilt sind. Ist dies nicht der Fall, wird eine zusätzliche Ausrichtung der LED oder die Lampe erforderlich, um die optimale Beleuchtung der Probe zu erreichen. Dies kann Leistung seinmed. unter Verwendung der Schrauben, die die Diode oder die Lampe im Raum zu positionieren.
- Verbinden Sie den Strahlteiler über einen C-Mount zu einem der Mikroskop-Emissions-Ports. Zum Beispiel verwenden die DV2 DualView (Photometrics), die die Emission Licht spaltet in zwei (Donor und Akzeptor) Kanäle, die gleichzeitig auf einem einzigen CCD-Kamera-Chip überwacht werden können. Alternativ gibt es auch andere vergleichbare Produkte wie Optosplit (Cairn Research) oder einen Strahlteiler in der Hamamatsu ORCA-D2 zwei Wellenlängen Kamera integriert. Für die CFP / YFP FRET-Paar, verwenden wir die 05-EM-Filter-Set mit dem 505dcxr dichroitischen Spiegel sowie ET480/30M und ET535/40M Emissionsfilter für CFP und YFP verbunden, die mit dem DV2 geliefert wird. Anstelle eines Strahlteilers, zwei Filterwürfel für den Spender (enthaltend die ET436/30M Anregungsfilter für GFP, das DCLP455 dichroitischen Spiegel und die GFP Emissionsfilter) und Akzeptor (enthaltend das GFP Anregungsfilter, DCLP455 und das Emissionsfilter YFP) Kanäle werden verwendetvielen FRET-Systeme. Alternativ kann man Filterwürfel ohne Emissionsfilter und einem automatischen Emissionsfilter Radposition vor der Kamera installiert werden. In diesem Fall, um ein motorisiertes Mikroskop oder die Filterrad alterniert zwischen den beiden Positionen innerhalb Emissionsfilter ~ 200-300 ms durchzuführen ratiometrische Bildgebung. Diese geringfügige Verzögerung ist akzeptabel, wenn Bildgebung eher verlangsamt intrazellulären Prozessen, wie cAMP-Signale, wo tatsächlich die gleichzeitige Erfassung beider Kanäle ist nicht kritisch.
- Verbinden Sie den CCD-Kamera (Verwendung zB ORCA-03G oder ORCA-R2 von Hamamatsu Photonics) auf den Strahlteiler. Verwenden Sie ein FireWire-Kabel an die Kamera an den IEEE1394-Computer-Schnittstelle, wie in der Bedienungsanleitung der Kamera beiliegt. Installieren Kamera-Treiber ohne Einschalten der Kamera.
- Schließlich, um die Kommunikation zwischen dem Computer und der Lichtquelle herzustellen, verbinden Sie den Arduino I / O-Platine (verwenden Sie zB Arduino Duemilanove oder Arduino Uno) an den LED-oder to den Auslöser durch die Verwendung eines HF-Kabel, das normal BNC-Stecker auf der Seite und zwei LED Einzelleitungen am anderen Ende in die Stifte GND (0) und 8 der Platine verbunden, wie in 2 gezeigt, enthalten sollte. Die bestückte Platine kann direkt an einen USB-Port des Computers angeschlossen werden.
2. Einrichten der Imaging Software
Zur Steuerung und Synchronisation der Lichtquelle mit Bilderfassung mit der Kamera sollte Imaging-Software auf dem Computer installiert werden. Es gibt verschiedene kommerziell verfügbare Software-Pakete einschließlich MetaFluor (Molecular Devices), SlideBook (Intelligent Imaging Innovations), VisiView (Visitron Systems). Hier zeigen wir die Verwendung der Open-Source-Micro-Manager Freeware, die ein hohes Maß an Flexibilität für die Low-Cost-Bildgebung bietet.
- Laden Sie diese Software bei http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Micro-Manager_Version_Archive. Wir empfehlen die Installation der 1.4.5 Version, die leicht in unseren Händen ist konfigurierbar.
- Schließen Sie das Arduino-Board mit einem USB-Port Ihres Computers. Laden Sie die Software, um die Arduino-Board von Kontrolle http://www.arduino.cc/en/Main/software . Befolgen Sie die Anweisungen auf dieser Website und führen Sie diese Software nur ein einziges Mal vor Beginn der Micro-Manager. Hochladen eines Codes für die Nutzung des Board mit Micro-Manager-Software. Der Code kann hier heruntergeladen werden http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Arduino .
- Schalten Sie die LED und der Kamera. Starten Sie die Software und konfigurieren Micro-Manager die Kommunikation mit der Kamera und LED (andere Lichtquelle und Verschlusszeit), indem Sie Tools> Hardware Configuration Wizard (siehe Abbildung 3). Fügen Sie die erforderlichen Komponenten einschließlich Ihrer Kamera(Dh Hamamatsu_ DCAM) und Arduino Board (fügen Arduino-Switch, Arduino-Hub und Arduino-Shutter-Geräte). In den nächsten Schritten verwenden Sie die Standardeinstellungen des Assistenten vorgeschlagen. Speichern Sie die neue System-Konfiguration, wenn vom Assistenten dazu aufgefordert.
- Verwenden Sie das Hauptmenü zu öffnen Extras> Device Property Browser. Blättern Sie nach unten auf "Arduino Schalter State" und wählen Sie "1". Schließen Sie den Dialog. Stellen Sie sicher, dass die "Auto-Shutter"-Box in der Haupt-Dialog Software angekreuzt ist. Drücken Sie Datei> Speichern System State, um die Software-Konfiguration, die jederzeit sollten nach dem Start der Software geöffnet werden zu speichern. Dies wird zu etablieren, die Kommunikation zwischen der Platte und der Software benötigt, um Bildaufnahme durchzuführen.
- Drücken Sie die "Live"-Taste, um das Signal aus der Kamera zu überwachen. Stellen Sie sicher, dass fluoreszierende Licht auf jeder Zeit "Live" oder "Snap"-Funktion ausgewählt geht. Vor Beginn der ersten Messungen, befolgen Sie die Anweisungen, die mit Ihrem Strahlteiler geliefert probilden die optische Ausrichtung der beiden Kanäle.
3. Zellkultur und Transfektionen
- Bereiten Sie 6-well Platten mit autoklaviertem rund 24 mm Glas coverslides (1 coverslide pro Well). Alternativ können Glasboden-Zellkultur-Gerichten verwendet werden.
- Platte 293A Zellen auf den Platten oder Schalen in D-MEM-Medium (ergänzt mit 10% FCS, 1% L-Glutamin und 1% Penicillin / Streptomycin-Lösung), so dass die Zellen 50-70% Konfluenz nach einem Tag erreicht.
- 24 Stunden nach dem Ausstreichen, transfizieren die Zellen in einer laminaren Strömung Bank mit einem FRET-Sensor Plasmid unter Verwendung der Calciumphosphat-Transfektion Methode (siehe 3.5). cAMP Biosensor Plasmide können aus unserer Gruppe auf Anfrage erhältlich. Der Leser wird auch auf die umfassende Bewertungen 7,8 beschreiben andere verfügbare cAMP Biosensoren bezeichnet.
- Transfizieren von Zellen, bevor zum ersten Mal, bereiten Transfektionsreagenzien. Make-up eine 2,5 M CaCl 2 und 2xBBS Lösungen (letztere mit1,5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM BES, 280 mM NaCl, pH 6,95 mit NaOH einstellen) in entionisiertem Wasser. Sterilfiltrat die Lösungen mit einem normalen 0,2 um Filter.
- Um eine 6-Well-Platte oder 6 Glasboden-Gerichten transfizieren, mischen 10 ug FRET-Sensor Plasmid, 50 ul 2,5 M CaCl 2-Lösung und sterilem Wasser bis zu 500 ul. Gut mischen.
- Fügen Sie 500 ul 2x BBS. Gut mischen und inkubieren Sie die Mischung für 10 min bei Raumtemperatur.
- Pipette 165 ul der Transfektion Mischung auf jede Vertiefung oder Schale getropft. Vorsichtig umrühren Platte und setzen Sie ihn wieder in den Inkubator. Zellen sind gewöhnlich für FRET-Messungen 24 Stunden nach der Transfektion. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht Konfluenz erreichten an diesem Punkt, da dies die Aktivität von mehreren Zelloberflächenrezeptoren beeinflussen könnten.
4. FRET-Messungen in lebenden Zellen
- Vor der Messung erstmals, bereiten die FRET-Puffer, enthaltend 144 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES in entionisiertem Wasser und den pH-Wert auf 7,3 mit NaOH. Verdünnen Sie die Verbindungen in Ihrem Imaging-Experimente mit dem FRET-Puffer verwendet werden.
- Starten Sie den Imaging-Software. Legen Sie vorher definierten System-Konfiguration. Wählen Sie File> Load System State, um die zuvor konfigurierten System Staates wählen.
- Montieren Sie einen coverslide mit adhärenten transfizierten 293A-Zellen in der Bildgebung Kammer (zB Attofluor Zellkammer). Waschen Sie die Zellen einmal mit Puffer FRET und 400 ul von FRET-Puffer. Bei der Verwendung von Glas-Boden Zellkultur-Geschirr zu waschen die anhaftenden Zellen und 2 ml des Puffers pro Gericht. Wir führen alle Messungen bei Raumtemperatur in der FRET-Puffer HEPES, so dass kein CO 2-Regelung notwendig ist.
- Legen Sie einige Immersionsöl auf das Objektiv und übertragen Sie die Imaging-Kammer auf dem Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf die Zellschicht mit Durchlicht.
- Schalten Sie das fluoreszierende light durch Drücken der "Live"-Taste, und wählen Sie eine Zelle für das Experiment. Wählen Sie eine Zelle mit einem optimalen Sensor Ausdruck, was bedeutet, dass es sein sollte nicht zu hell und nicht zu dunkel. Nach dem Auffinden einer geeigneten Zelle, schalten Sie das fluoreszierende Licht sofort zu vermeiden Ausbleichen des FRET-Sensor.
- Stellen Sie die Belichtungszeit unter den "Kamera-Einstellungen" (in der Regel 10-50 ms) in einer Weise, die zu einem guten Signal-zu-Rausch-Verhältnis des aufgenommenen Bildes nach dem Drücken der "Snap"-Taste führt. Zu lange Anregungszeiten könnte in Ausbleichen führen, während zu kurze Zeiten führen zu geringen Bildqualität.
- Drücken Sie die "Multi-D Acq." Taste und wählen Sie die Anzahl der Zeitpunkte und das Zeitintervall für die Bildaufnahme. Für unsere cAMP-FRET-Sensor, erwerben wir ein Bild alle 5 s.
- Starten Sie die Messung durch Drücken der Schaltfläche "Erfassen".
- Während jeder Messung kann man die "FRET online"-Plug-in (verfügbar in der Online-Supplement, alle Plug-Ins muss copied in das "plugins"-Ordner Ihres Micro-Manager-Software, bevor Sie es) zu überwachen FRET Verhältnis ändert sich online. Führen Sie dieses Plug-in, und wählen Sie eine Region von Interesse in der FRET-Ratio Bild mit dem "Freehand Auswahl"-Werkzeug. Fügen Sie die Region in die ROI-Manager und drücken Sie die "Get average"-Button in der "Time Series Analyzer"-Fenster. Die FRET-Verhältnis Spur wird angezeigt. Um die Spur während der Messung zu aktualisieren, führen Sie die "FRETratioOnline2" plug-in und drücken Sie die "GetAverage"-Taste.
- Sobald der FRET-Verhältnis erreicht ist eine stabile Grundlinie gelten die gewünschte Verbindung durch genaues Pipettieren in die Näpfe / Kammer. Zellen mit pharmakologischen Verbindungen zu behandeln, kann ein Perfusionssystem statt einfacher Pipettieren in dieser Phase verwendet werden.
- Nach Beendigung des Experiments, speichern Sie die Zeitraffer-Stapel von Bildern. Entfernen Sie die Messkammer aus dem Mikroskop und reinigen das Ziel mit Hilfe einer objektiven Gewebe.
- Zurück auf 4,3 Schritt, um die Messung mit einer Wiederholungneue Probe.
5. Offline-Analyse
FRET-Daten können offline analysiert werden jederzeit nach dem Experiment mit ImageJ Software. Als Ergänzung zu diesem Protokoll, bieten wir die "FREToffline" plug-in in unserem Labor verwendet, um die aufgenommenen Bilder in Donor und Akzeptor Kanäle aufgeteilt und Fluoreszenzintensitäten in mehreren Regionen von Interesse zu messen. Diese Intensitäten können weiter copy-Paste in eine Excel-oder Origin Tabellenkalkulation, um die korrigierte FRET zu berechnen. Zur Visualisierung der FRET-Änderungen der unimolekularen Biosensoren, ist einfach ratiometry oft verwendet. In diesem Fall wird nur das Donorfluorophor (GFP) angeregt wird, und zwei Bildern werden mit GFP YFP und Emissionspeaks entnommen. Die berechnete YFP / GFP-Verhältnis (manchmal auch als FRET / GFP-Verhältnis bezeichnet) stellt den Grad der FRET zwischen den beiden Fluorophoren. In unimolekularen Biosensoren sind die Zahlen von CFP und YFP Reste gleich, so dass die einfache ratiometry ausreichend istzient zu repräsentieren die FRET-Effizienz 12.
- Verwenden ImageJ-Software, um das Experiment Datei, indem Sie Plugins> Micro-Manager> Open Micro-Manager File zu öffnen.
- Führen Sie das "FREToffline" plug-in denen die Zeitraffer-Stack teilt sich in einzelnen CFP und YFP-Kanäle.
- Wenn Hintergrund Korrektur erforderlich ist, kann diese unter Verwendung von ImageJ Software.
- Klicken Sie auf die YFP Stapel von Bildern und wählen Sie eine oder mehrere Regionen von Interesse mit dem "Freehand Auswahl"-Werkzeug und fügen Sie sie der "MultiMeasure" Plug-In-Fenster, indem Sie die Schaltfläche "Hinzufügen".
- Wählen Sie die Regionen von Interesse in der "MultiMeasure"-Fenster und klicken Sie auf "Multi", um eine Tabelle mit mittleren Grauwerte für jeden Frame und jeder Region zu erhalten. Kopieren Sie die Daten in die Zwischenablage, indem Sie alle mit Strg + A und durch Drücken von Strg + C. Öffnen Sie eine Excel oder Origin Tabellenkalkulation und fügen Sie die Daten durch Drücken von Strg + V.
Die Messungen vom Programm ausgeführt werden kann unter Analysieren> Set M konfiguriert werden BMESSUNGEN Hier definieren Sie die Parameter gemessen werden können. Wir wählen normalerweise nur "mittleren Grauwert" in diesem Dialog. - Klicken Sie auf den CFP Stapel von Bildern. Führen die gleiche wie in 5.5 beschrieben. Fügen Sie die GFP Intensität Daten in der gleichen Excel oder Origin Tabellenkalkulation.
- Mit Excel oder Origin Software berechnet die korrigierte FRET-Verhältnis. Wenn einfache single-chain unimolekularen Biosensoren abgebildet werden, korrigieren wir nur für die Übersprechen der Donor-Fluoreszenz in den Akzeptor-Kanal. In diesem Fall ist die korrigierte Akzeptor / Donor-Verhältnis:
Ratio = (YFP - B x CFP) / CFP
Wobei B der Korrekturfaktor, der durch Transfektion von Zellen mit GFP-Plasmid und Messen eines Prozentsatzes der Donorfluoreszenz YFP im Kanal (B = YFP / GFP) bestimmt werden kann. Weglassen dieser Korrektur für unimolekulare Biosensoren ist möglich, da sie nur einen Einfluss auf die gesamte Amplitude des FRET Reaktion ohne qualitative Wirkung auf die Form der Kurve.
Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für eine vollständig zusammengebaut FRET-Setup, bestehend aus einem Nikon inverse Mikroskop CoolLED, DV2 DualView und die Hamamatsu ORCA-03G CCD-Kamera. Um die Kommunikation zwischen den Hardware-Komponenten und Computer herstellen, wird die I / O Arduino-Board mit dem Computer und dem CoolLED wie in Abbildung 2 verbunden. Um die Lichtquelle und Bilderfassung mit der Kamera in einer synchronisierten Weise zu steuern, hat Micro-Manager-Software installiert und richtig konfiguriert ist (siehe Abbildung 3). Diese Freeware kann leicht an die individuellen Bedürfnisse experimentellen werden durch Zugabe erforderliche Plugins angepasst. 4A zeigt eine repräsentative rohen FRET Verhältnis Spur von einer Messung mit dem cAMP-Sensor Epac1-Lagern 13 in 293A-Zellen exprimiert, um die Wirkungen von β-adrenergen Agonisten überwachen Isoproterenol angewendet zum Zeitpunkt 150 sec und die & wettea;-Blocker Propranolol zum Zeitpunkt 300 sec (durchgeführt wie in 4,3-4,10 beschrieben) zugegeben. Diese Daten analysiert werden können offline und korrigiert für das Übersprechen der GFP in die YFP-Kanal wie in 5,1-5,7 beschrieben erhalten die korrigierte FRET-Verhältnis Spur in 4B gezeigt. Diese repräsentative Experiment zeigt eine langsame Abnahme der überwachten FRET-Verhältnis bei Isoproterenol Behandlung, die eine Erhöhung der intrazellulären cAMP zeigt. Propranolol als β-Blocker kehrt die Isoproterenol-Signal, was zu einer Abnahme der cAMP zu Grundniveaus. Diese Veränderungen in der FRET-Signal online kann während aller Experimente (wie in 4.9 beschrieben) überwacht werden. Solche Experimente können mit einer Vielzahl von üblicherweise verwendeten Biosensoren entwickelt, um verschiedene Botenstoffe oder biochemische Prozesse überwachen durchgeführt werden.
Abbildung 1. Layout des FRET-Imaging Aufbau einer CoolLED besteht, inumgewandelt Nikon-Mikroskop, DV2 DualView und ORCA-03G CCD-Kamera.
Abbildung 2. Arduino I / O-Platine und ihre Verbindungen. Das Board ist in einem selbst montiert Kunststoff-Box positioniert. Ein Standard-BNC-Kabel verbindet die an den Pins 8 und GND (0) der Verwaltungsrat geleitet.
Abbildung 3. Screenshots demonstrieren die Integration der Systemkomponenten mit Hardware Configuration Wizard. A) Starten Sie den Hardware-Assistenten. B) Fügen Sie die gewünschten Geräte in 2,3 erwähnt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 4. Ein Vertreter FRET experiment, die cAMP-Spiegel misst in 293A Zellen mit Epac1-camps transfiziert. Zuerst wurden die Zellen mit dem β-adrenergen Agonisten Isoproterenol (100 nM, am Rahmen 30 bzw. bei 150 s) bis cAMP erhöhen (beobachtet als eine Abnahme der YFP / GFP FRET-Verhältnis) stimuliert. Die Zellen wurden anschließend mit dem β-Blocker Propranolol (10 uM, bei Bild 60 oder bei 300 sec), die zu einer Erhöhung der FRET-Verhältnis führt, was eine Abnahme der cAMP behandelt. A) Roh Online FRET Verhältnis Spur von einer Region von Interesse entsprechenden auf eine einzelne Zelle während des Experiments überwacht. B) Korrigierte Verhältnis Spur nach Offline-Datenanalyse durchgeführt, wie in 5,1-5,7 beschrieben.
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Discussion
in diesem Protokoll zeigen wir, wie man eine einfache Low-Cost, aber leistungsstarke FRET Imaging-System für Routine-Anwendungen mit einer Vielzahl von verfügbaren Biosensoren bauen. Das hier vorgestellte System ist für GFP und YFP oder ähnlichen Typen von fluoreszierenden Proteinen, wie die Donor-Akzeptor-Paar. Unterdessen werden andere individuelle Biosensoren zur Verfügung, verwenden zum Beispiel grün und rot fluoreszierenden Proteinen 14. Um das beschriebene System für andere Farben anzupassen, sind geeignete Lichtquellen und / oder Filter-Sets ausgewählt werden. Im Falle der LED, ein anderes einzelnes LED-Zeile, zum Beispiel 490 nm bis zu erregen grün fluoreszierendes Protein verwendet werden kann. Single-Wellenlängen-LEDs können problemlos (innerhalb von Sekunden) demontiert und ausgetauscht werden. Alternativ gibt es LED-Arrays zur Verfügung, das mehrere Zeilen enthalten, um verschiedene fluoreszierende Proteine (zB PE-2 CoolLED) erregen. Um Messungen mit alternativen ermöglichen FRET-Paare können auch andere fluoreszierende Filterwürfel in den Microsc platziert werden OPE, und schließlich die Emission Strahlteiler Filter sollten ausgetauscht werden. Photometrics bietet zusätzliche Emissions-Filter Regler für DV2 DualView. Einige Anwendungen verwenden kürzlich entwickelten zwei oder mehrere Biosensoren gleichzeitig an mehrere Prozesse gleichzeitig zu überwachen, zum Beispiel cAMP und cGMP zusammen in einer Zelle 15. In diesem Fall wird ein QuadView (Photometrics) mit vier Emissionskanal verwendet werden kann, die ImageJ Plug-in für Bildteilungseinheit und Analyse dann angepasst werden kann, um mit vier Kanälen verwendet werden und zur Berechnung zwei FRET-Verhältnissen. ImageJ Software ist sehr flexibel in der Bildanalyse und Online-Darstellung der Ergebnisse. Einfache Text-edited Plug-Ins ermöglichen eine Anpassung der Software-Algorithmus, um die Bedürfnisse jedes einzelnen bildgebenden Systems und Experiment. Das ist manchmal sehr hilfreich und bietet schnelle Lösungen für die technischen Probleme, die lange Zeiten erfordern können, wenn sie in einer kommerziellen Software-Paket umgesetzt werden müssen.
content "> Dabei FRET-Experimente ist es entscheidend zu vermeiden Photobleichen welches erscheint, wenn die Erregung zu lang bzw. die Bilder zu häufig getroffen sind. In diesem Fall kann ein photoneninduzierter chemische Schädigung oder kovalente Modifikationen von Fluorophoren auftreten und FRET verringern Effizienz. Zur Vermeidung Photobleichen, kann man die Belichtungszeit zu verringern und die Frequenz der Bildaufnahme. Es gibt auch Protokolle 12,16 eingerichtet, um für dieses Phänomen zu korrigieren. Während Datenanalyse, es möglich ist, für das Übersprechen zwischen korrigieren FRET-Donor und Akzeptor Kanäle (Übersprechen). Bei Verwendung unimolekularen Biosensoren (in diesem Fall Donor und Akzeptor-Fluorophoren werden immer auf dem gleichen Niveau exprimiert) zur einfachen ratiometrische Messungen kann es ausreichen, nur für das Übersprechen des Spenders in die Akzeptorflüssigkeit zu korrigieren Kanal oder sogar weglassen diese Korrektur überhaupt, weil es qualitativ nicht beeinflusst die Form des FRET-Verhältnisses Kurve. Das Übersprechen von the Akzeptor in den Spender-Kanal ist in der Regel vernachlässigbar. Wenn bimolekularen Biosensoren von zwei verschiedenen Proteinen besteht verwendet werden, können diese auf verschiedenen Ebenen ausgedrückt werden. In diesem Fall sind das Übersprechen Korrektur und eine zusätzliche Korrektur für die direkte YFP Anregung durch das 440 nm-Licht auch ratsam. Bitte, dem veröffentlichten Protokoll 12, wo alle Korrekturverfahren näher beschrieben werden, beziehen. Weitere umfassende Informationen über die Entwicklung von Biosensoren, FRET-Mikroskopie sind mögliche Fallstricke der Technik und über die Datenanalyse in zuvor veröffentlichten Protokollen 17-18 zur Verfügung. Zusammenfassend bietet die einfache und leistungsfähige Imaging hier beschriebene System eine flexible Plattform für verschiedene biochemische Vorgänge und Signalmolekülen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in lebenden Zellen zu überwachen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Anke Rüttgeroth und Karina Zimmermann für die technische Unterstützung bedanken. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Stipendium NI 1301/1-1 bis VON) und der University of Göttingen Medical Center ("pro futura" Zuschuss VON) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
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