Summary
Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) microscopia è una potente tecnica di monitoraggio in tempo reale degli eventi di segnalazione nelle cellule in diretta tramite biosensori vari giornalisti. Qui si descrive come costruire un epifluorescenza personalizzato FRET sistema di imaging da componenti disponibili in commercio e come usarlo per esperimenti FRET.
Abstract
Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) microscopia continua a guadagnare un crescente interesse come tecnica di monitoraggio in tempo reale di eventi biochimici e di segnalazione nelle cellule vive e tessuti. Rispetto ai classici metodi biochimici, questa nuova tecnologia è caratterizzata da elevata risoluzione temporale e spaziale. FRET esperimenti utilizzare vari geneticamente codificati biosensori che possono essere espresse e ripreso nel tempo in situ o in vivo 1-2. Biosensori tipici possono segnalare interazioni proteina-proteina misurando FRET tra una coppia fluoroforo-etichettato di proteine o cambiamenti conformazionali in una singola proteina che porti donatore e accettore fluorofori interconnessi con una parte che lega ad una molecola di interesse 3-4. Biosensori bimolecolari di interazioni proteina-proteina includono, per esempio, costruisce progettato per monitorare G-proteina di attivazione di cellule 5, mentre i sensori unimolecolari meaSuring cambiamenti conformazionali sono ampiamente utilizzati per messaggeri seconda immagine come calcio 6, cAMP 7-8, inositolo fosfati 9 e cGMP 10-11. Qui si descrive come costruire un epifluorescenza personalizzato FRET sistema di imaging da singoli componenti disponibili in commercio e come controllare l'intero setup utilizzando il micro-Manager freeware. Questo strumento semplice ma potente è stato progettato per misurazioni di routine o più sofisticati FRET in cellule vive. Le immagini acquisite vengono elaborate utilizzando auto-scritto plug-in per visualizzare le modifiche in FRET rapporto in tempo reale in un periodo di sperimentazione prima di essere memorizzati in un formato grafico compatibile con il build-in freeware ImageJ utilizzato per la successiva analisi dei dati. Questo sistema a basso costo è caratterizzato da un'elevata flessibilità e può essere utilizzato con successo per monitorare i vari eventi biochimici e molecole di segnalazione da una pletora di biosensori disponibile FRET in cellule vive e tessuti. Come esempio, dimostriamo how utilizzare questo sistema di imaging per eseguire il monitoraggio in tempo reale di cAMP in cellule vive 293A dopo stimolazione con un β-agonista del recettore adrenergico e bloccante.
Protocol
1. Impostazione di un FRET Microscopio Imaging
In linea di principio, qualsiasi microscopio a fluorescenza invertito che è disponibile in laboratorio e ha una porta fotocamera può essere adattato per FRET imaging. La configurazione finale dovrebbe includere i seguenti componenti fondamentali: un microscopio, una fonte di luce, con o senza scatto aggiuntivo, un fascio-splitter per emissione di luce e una CCD-camera (vedi figura 1). I dispositivi hardware, in particolare la sorgente di luce, l'otturatore e la fotocamera sono integrati e controllati dal software di imaging che permette l'acquisizione e l'analisi. Qui di seguito si descrive un procedimento per assemblare un semplice FRET sistema da componenti disponibili commercialmente.
- Collegare la sorgente di luce al microscopio. Ad esempio, utilizzare una singola lunghezza d'onda diodo ad emissione luminosa (coolled p E-100, 440 nm), che eccita selettivamente maggiore proteina fluorescente ciano (PCP) utilizzato come donatore in più FRET biosensori. Esso può essere direttoly e facilmente collegato alla porta illuminazione ad epifluorescenza del microscopio. Ci sono anche disponibili LED multi-lunghezza d'onda, che possono essere collegati in modo simile. Invece di LED, altre sorgenti luminose standard come XBO75 lampada allo xeno ad arco (spesso usato per microscopi Olympus e Zeiss) o HBO lampada al mercurio (solitamente installato su microscopi Nikon) può essere utilizzato. Nel caso di una lampada a fluorescenza, si dovrebbe anche inserire un otturatore tra la lampada e la porta di illuminazione per consentire il controllo del software assistita della luce di eccitazione che si presentano sul vostro campione. Coolled non richiede alcuna ulteriore otturatore poiché può essere direttamente attivato e disattivato dal software. Lo svantaggio dei sistemi a singolo colore LED è un numero limitato di lunghezze d'onda di eccitazione, mentre una lampada fluorescente con vari set di filtri è un'opzione più flessibile, soprattutto quando si lavora con biosensori multipli e bimolecolare. In alternativa, fonti di luce (ad esempio monocromatore Polychrome V, TILLPhotonics) può essereutilizzato, che di solito hanno un otturatore integrato che può essere controllato tramite software un segnale di trigger.
- Inserire un cubo adeguato filtro nel microscopio. Per le routine di FRET misure con PCP e una maggiore proteina gialla fluorescente (YFP) o delle loro varianti come FRET coppia, usiamo un semplice cubo filtro contenente un filtro ET436/30M di eccitazione (che può essere omesso quando il LED è usato, ma è indispensabile quando si utilizza una lampada allo xeno mercurio o piuttosto LED) ed un DCLP455 specchio dicroico. Il microscopio deve essere dotato anche di un obiettivo adatto per una buona risoluzione microscopia a fluorescenza, ad esempio con un piano-fluoro, Plan-Neofluar o piano-apocromatico 40x, 60x e 100x olio obiettivo a immersione.
- Accendere la luce fluorescente e controllare se il punto luce è distribuita in modo uniforme il campo visivo. Se questo non è il caso, ulteriore allineamento del LED o la lampada è necessario per ottenere l'illuminazione ottimale del campione. Questo può essere effetmed utilizzando le viti che posizionano il diodo o la lampada nello spazio.
- Collegare il fascio splitter tramite un C-mount a una delle porte di emissione del microscopio. Ad esempio, utilizzare il DualView DV2 (fotometrici) che divide la luce di emissione in due (donatore e accettore), canali che si possono monitorare su un singolo chip di camera CCD. In alternativa, ci sono altri prodotti analoghi quali Optosplit (Cairn Research) o un divisore di fascio integrato nel ORCA-D2 Hamamatsu doppia lunghezza d'onda fotocamera. Per il CFP / YFP FRET coppia, si usa il 05-EM filtrare set contenente il 505dcxr specchio dicroico più ET480/30M e filtri di emissione ET535/40M per CFP e YFP, rispettivamente, che viene fornito con il DV2. Invece di un divisore di raggio, due cubi di filtro per il donatore (contenente il filtro ET436/30M eccitazione per PCP, la DCLP455 specchio dicroico e la PCP filtro per le emissioni) e accettore (contenente la PCP filtro di eccitazione, DCLP455 e la YFP filtro per le emissioni) canali vengono utilizzatimolti sistemi FRET. In alternativa, un cubo filtro senza filtro per le emissioni e un sistema automatico di posizione della ruota filtro per le emissioni prima che la telecamera può essere installata. In questo caso, un microscopio motorizzato o le ruote alterna filtro tra le due posizioni di emissione filtro all'interno ~ 200-300 msec effettuare l'imaging raziometrico. Questo ritardo minore è accettabile quando l'imaging piuttosto lento processi intracellulari, come segnali di campo, dove veramente acquisizione simultanea di entrambi i canali non è critica.
- Collegare la fotocamera CCD (uso ad esempio ORCA-03G o ORCA-R2 da Hamamatsu Photonics) per il divisore di fascio. Utilizzare un cavo FireWire per collegare la fotocamera al computer di interfaccia IEEE1394, come descritto nel manuale in dotazione con la fotocamera. Installare i driver della fotocamera senza accendere la fotocamera.
- Infine, per stabilire la comunicazione tra il computer e la sorgente luminosa, collegare l'I / O scheda Arduino (per esempio utilizzare Arduino Duemilanove Arduino Uno o) al LED o to l'otturatore tramite un cavo BNC che dovrebbe contenere una spina normale BNC sul lato LED e due fili singoli su l'altra estremità collegata al pin GND (0) e 8 della scheda come mostrato in Figura 2. La scheda montata può essere collegato direttamente a una porta USB del computer.
2. Impostazione del software di imaging
Per controllare e sincronizzare la sorgente di luce con l'acquisizione di immagini dalla telecamera, software di imaging deve essere installato sul computer. Ci sono diversi pacchetti software disponibili in commercio tra cui MetaFluor (Molecular Devices), Slidebook (Intelligent Imaging Innovations), VisiView (Sistemi Visitron). Qui mostriamo l'uso di open-source Micro-Manager freeware che offre un alto grado di flessibilità a basso costo di imaging.
- Scarica il software a http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Micro-Manager_Version_Archive. Si consiglia di installare la versione 1.4.5 che è facilmente configurabile nelle nostre mani.
- Collegare la scheda Arduino ad una porta USB del computer. Scarica il software per il controllo della scheda Arduino da http://www.arduino.cc/en/Main/software . Seguire le istruzioni riportate su questo sito web ed eseguire questo programma solo una volta prima di iniziare la Micro-Manager. Carica un codice per l'utilizzo della scheda con Micro-Manager software. Il codice può essere scaricato http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Arduino .
- Accendere il LED e la fotocamera. Avviare il software e configurare Micro-Manager comunicazione con la telecamera e LED (sorgente luminosa e l'otturatore) selezionando Strumenti> Hardware Configurazione guidata (vedere Figura 3). Aggiungere i componenti necessari inclusa la fotocamera(Vale a dire Hamamatsu_ DCAM) e Arduino (aggiungere Arduino-Switch, Hub e Arduino-Arduino-Shutter dispositivi). Durante le fasi successive, utilizzare le impostazioni predefinite suggerite dalla procedura guidata. Salvare la nuova configurazione del sistema quando richiesto dalla procedura guidata.
- Utilizzare il menu principale per aprire Strumenti> Browser proprietà. Scorrere fino a "Stato commutazione Arduino" e selezionare "1". Chiudere la finestra di dialogo. Assicurarsi che la casella "auto-shutter" sia selezionata nella finestra di dialogo principale del software. Premere File> Salva stato del sistema per salvare la configurazione del software, che dovrebbe essere aperto in qualsiasi momento dopo l'avvio del software. Questo stabilirà la comunicazione tra la scheda e il software necessario per effettuare l'acquisizione delle immagini.
- Premere il tasto "Live" per monitorare il segnale proveniente dalla telecamera. Accertarsi che la luce fluorescente continua in qualsiasi momento "Live" o "Snap" è selezionata la funzione. Prima di iniziare le prime misurazioni, seguire le istruzioni fornite con il divisore di fascio a performare l'allineamento ottico di entrambi i canali.
3. Cella Cultura e trasfezioni
- Preparare le piastre da 6 pozzetti con autoclave coverslides mm tondi 24 di vetro (1 coverslide per pozzetto). In alternativa, il fondo di vetro piatti di coltura cellulare può essere utilizzato.
- Piastra 293A cellule sulle piastre o piatti D-MEM (mezzo supplementato con 10% FCS, 1% di L-glutammina e 1% soluzione di penicillina / streptomicina) in modo che le cellule raggiungono 50-70% di confluenza dopo un giorno.
- 24 ore dopo la placcatura, trasfettare le cellule in un banco di flusso laminare con un sensore FRET plasmide utilizzando il metodo del fosfato di calcio, trasfezione (vedere 3.5). plasmidi biosensore cAMP può essere ottenuto dal nostro gruppo su richiesta. Il lettore è indicato anche le recensioni complete 7,8 descrivono altri biosensori cAMP disponibili.
- Prima trasfezione delle cellule per la prima volta, preparare reagenti di trasfezione. Portare un M 2.5 CaCl 2 e soluzioni 2xBBS (quest'ultima contenente1,5 mM Na 2 HPO 4, BES 50 mM, NaCl 280 mM portato a pH 6,95 con NaOH) in acqua deionizzata. Sterile filtrato le soluzioni utilizzando un filtro normale 0,2 micron.
- Trasfettare una piastra da 6 pozzetti o 6 fondo di vetro piatti, miscelare 10 pg di plasmide sensore FRET, 50 pl di soluzione di CaCl 2 2,5 M e acqua sterile fino a 500 microlitri. Mescolare bene.
- Aggiungere 500 ml di BBS 2x. Mescolare bene e incubare la miscela per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Pipettare 165 ml di miscela di trasfezione goccia a goccia su ciascun pozzetto o un piatto. Mescolare delicatamente la piastra e rimetterlo in incubatrice. Le cellule sono di solito pronti per FRET misure 24 ore dopo la trasfezione. Assicurarsi che le cellule non hanno raggiunto la confluenza, a questo punto, poiché questo potrebbe influenzare l'attività di diversi recettori della superficie cellulare.
4. Misure FRET in cellule vive
- Prima di misurare per la prima volta, preparare il FRET tampone contenente 144 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, HEPES 10 mM in acqua deionizzata e portare il pH a 7,3 con NaOH. Diluire i composti da utilizzare nei vostri esperimenti di imaging con la FRET buffer.
- Avviare il software di imaging. Caricare configurazione del sistema precedentemente definito. Selezionare File> Stato del sistema di carico per scegliere lo stato del sistema configurato in precedenza.
- Montare un coverslide con aderenti cellule trasfettate 293A nella camera di imaging (ad esempio camera a cella Attofluor). Lavare le cellule una volta con FRET tampone e aggiungere 400 microlitri di buffer di FRET. Quando si utilizza il fondo di vetro di coltura cellulare piatti lavare le cellule aderenti e aggiungere 2 ml di tampone per ogni piatto. Abbiamo effettuare tutte le misurazioni a temperatura ambiente in tampone contenente HEPES FRET, in modo che nessun CO 2 controllo è necessario.
- Metti un po 'di olio di immersione sul l'obiettivo e trasferire la camera di imaging sul microscopio. Focus sul strato di cellule con la luce transilluminazione.
- Accendere il lig fluorescenteht premendo il tasto "Live", e selezionare una cella per l'esperimento. Scegli una cella con un'espressione sensore ottimale, nel senso che non dovrebbe essere troppo luminoso e non troppo scuro. Dopo aver trovato una cella del caso, spegnere la luce fluorescente immediatamente per evitare photobleaching del FRET sensore.
- Regolare il tempo di esposizione sotto la voce "Impostazioni della fotocamera" (di solito 10-50 msec) in un modo che porta ad un buon rapporto segnale-rumore dell'immagine acquisita dopo aver premuto il tasto "Snap". Troppo lunghi i tempi di eccitazione può provocare photobleaching, mentre troppo breve volte risultato in termini di qualità dell'immagine bassa.
- Premere il tasto "Multi-D Acq." pulsante e impostare il numero di punti di tempo e l'intervallo di tempo per l'acquisizione dell'immagine. Per il nostro cAMP-FRET sensore, acquisiamo una immagine ogni 5 s.
- Avviare le misurazioni premendo il pulsante "Ripresa".
- Durante ogni misura, si può usare il "FRET online" plug-in (disponibile nel supplemento online, tutti i plug-in deve essere poliziottoied nella cartella "plugins" del Micro-Manager il software prima di iniziarlo) per monitorare FRET rapporto cambia linea. Esegui questo plug-in e selezionare una regione di interesse per il FRET immagine rapporto con lo strumento "selezione a mano libera". Aggiungere la regione nel gestore di ROI e premere il tasto "Prendi media" nella "serie temporali analizzatore di" finestra. Il FRET traccia rapporto sarà visualizzato. Per aggiornare la traccia durante la misurazione, eseguire il "FRETratioOnline2" plug-in e premere il pulsante "GetAverage".
- Non appena il FRET rapporto ha raggiunto una linea di base stabile applicare il composto desiderato è accuratamente pipettando nella capsula / camera. Per trattare cellule con composti farmacologici, un sistema di perfusione anziché pipettaggio semplice può essere utilizzato in questa fase.
- Dopo aver terminato l'esperimento, salvare il time-lapse pila di immagini. Rimuovere la camera di misura dal microscopio e pulire l'obiettivo utilizzando un tessuto obiettivo.
- Tornare al passaggio da 4.3 a ripetere la misura con unnuovo campione.
5. Analisi dei dati in linea
FRET dati di imaging possono essere analizzati in linea in qualsiasi momento dopo l'esperimento utilizzando il software ImageJ. A complemento di questo protocollo, forniamo il plug-in "FREToffline" utilizzato nel nostro laboratorio per dividere le immagini acquisite in canali donatore e accettore e per misurare intensità di fluorescenza in più regioni di interesse. Tali intensità possono inoltre essere copiato e incollato in un foglio di calcolo Excel o origine per calcolare il corretto rapporto di FRET. Per visualizzare il FRET cambiamenti di biosensori unimolecolari, ratiometry semplice è spesso usato. In questo caso, solo il fluoroforo donatore (PCP) è eccitato, e due immagini sono prese a picchi di emissione CFP e YFP. La calcolato YFP / CFP rapporto (talvolta indicato anche come FRET / CFP ratio) rappresenta il grado di FRET tra i due fluorofori. In biosensori unimolecolari, il numero di CFP e YFP porzioni sono uguali, in modo che il ratiometry semplice è sufficiente a rappresentare l'efficienza FRET 12.
- Utilizzare il software ImageJ per aprire il file esperimento selezionando Plugins> Micro-Manager> Open Micro-File Manager.
- Eseguire il plug-in "FREToffline" che divide il time-lapse risma nel PCP individuale e canali YFP.
- Se la correzione del fondo è necessaria, questa può essere effettuata utilizzando il software ImageJ.
- Fare clic sulla pila YFP delle immagini e selezionare una o più regioni di interesse con lo strumento "selezione a mano libera" e aggiungerli al "MultiMeasure" plug-in finestra premendo il pulsante "Aggiungi".
- Selezionare le regioni di interesse nella finestra "MultiMeasure" e premere il tasto "Multi" per ottenere una tabella con valori medi di grigio per ogni fotogramma e ogni regione. Copiare i dati nella clipboard selezionando il tutto utilizzando Ctrl + A e premendo Ctrl + C. Aprire un foglio di calcolo Excel o origine e incollare i dati premendo Ctrl + V.
Le misurazioni eseguite dal programma può essere configurato in Analizza> Set M easurements in cui è possibile definire i parametri da misurare. Di solito selezionare solo "Valore medio grigia" in questa finestra di dialogo. - Fare clic sulla pila di immagini PCP. Eseguire la stessa descritta in 5.5. Incollare i dati di intensità della PCP nello stesso foglio di calcolo Excel o origine.
- Utilizzo di Excel o software di origine, calcolare il corretto rapporto di FRET. Quando semplici a catena singola biosensori unimolecolari vengono esposte, abbiamo correggere solo per la bleedthrough della fluorescenza del donatore nel canale accettore. In questo caso, il corretto accettore / donatore rapporto:
Rapporto = (YFP - B x CFP) / CFP
Dove B è il fattore di correzione che può essere determinata da trasfezione delle cellule con PCP plasmide e misurando una percentuale della fluorescenza del donatore nel canale YFP (B = YFP / CFP). Omettere la correzione per biosensori unimolecolari è possibile, poiché solo influenza l'ampiezza complessiva del FRET risposta senza alcun effetto qualitativo sulla forma della curva.
La figura 1 mostra un esempio di una configurazione completamente assemblato FRET immagini costituito da un microscopio invertito Nikon, coolled, DV2 DualView e ORCA-03G Hamamatsu camera CCD. Per stabilire la comunicazione tra i componenti hardware e il computer, l'I / O Arduino scheda è collegata al computer e alla coolled come mostrato in Figura 2. Per controllare la sorgente di luce e la cattura delle immagini dalla telecamera in modo sincronizzato, Micro-Manager software deve essere installato e configurato correttamente (vedere Figura 3). Questo freeware può essere facilmente adattato alle singole esigenze sperimentali aggiungendo plug-in necessari. Figura 4A mostra un grezzo rappresentante FRET traccia rapporto da una misura mediante il sensore cAMP Epac1 campi-13 espresso in cellule 293A per monitorare gli effetti della β-adrenergico isoproterenolo applicati al momento punto 150 sec e il & scommetterea;-bloccante propranololo aggiunto in fase punto 300 sec (eseguita come descritto in 4,3-4,10). Questi dati possono essere analizzati offline e corretta per la bleedthrough della PCP nel canale YFP come descritto nella 5,1-5,7 per ottenere la corretta traccia FRET rapporto mostrato nella Figura 4B. Questo esperimento rappresentativo mostra una lenta diminuzione del rapporto monitorato FRET previo trattamento di isoproterenolo che indica un aumento di cAMP intracellulare. Propranololo come β-bloccanti inverte il segnale isoproterenolo, portando ad una diminuzione di cAMP a livelli basali. Questi cambiamenti nella FRET segnale può essere monitorato in linea durante ogni esperimento (come descritto in 4.9). Tali esperimenti possono essere eseguite con una varietà di biosensori comunemente usati destinati per controllare diversi secondi messaggeri o processi biochimici.
Disposizione figura 1. Del FRET configurazione immagini costituito da una coolled, inconvertiti Nikon microscopio, DV2 DualView, e ORCA-03G camera CCD.
Figura 2. Arduino scheda I / O e le sue connessioni. La scheda è posizionato in una scatola di plastica auto-montato. Un cavo standard BNC collega il led ai pin 8 e GND (0) della scheda.
Screenshots Figura 3. Che dimostrano l'integrazione dei componenti di sistema tramite Configurazione guidata hardware. A) Avviare la procedura guidata di configurazione hardware. B) Aggiungere i dispositivi necessari, come indicato al punto 2.3. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Un rappresentante FRET sperimentazionet che misura i livelli di cAMP in cellule trasfettate con Epac1 293A-campi. Primo, le cellule sono state stimolate con il β-adrenergico isoproterenolo agonista (100 nM, al telaio 30 o 150 sec) per aumentare cAMP (osservato come diminuzione YFP / CFP FRET ratio). Le cellule sono state successivamente trattati con il β-bloccante propranololo (10 pM, al telaio 60 o 300 sec) che porta ad un aumento del rapporto di FRET, con una diminuzione in cAMP. A) online Raw FRET traccia rapporto da una regione di interesse corrispondenti ad una singola cellula monitorata durante l'esperimento. B) rettificato traccia rapporto dopo offline analisi dei dati eseguita come descritto 5,1-5,7.
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Discussion
in questo protocollo, abbiamo spiegato come creare un semplice basso costo ma potente FRET sistema di imaging per applicazioni di routine con una varietà di biosensori disponibili. Il sistema presentato è progettato per CFP e YFP, o altri tipi di proteine fluorescenti, come donatore-accettore coppia. Nel frattempo, altri biosensori individuali diventano disponibili che utilizzano per esempio le proteine fluorescenti verdi e rosse 14. Adattare il sistema descritto per altri colori, fonti di luce appropriate e / o insiemi filtro deve essere selezionato. Nel caso di LED, un'altra linea singolo LED, per esempio 490 nm per eccitare la proteina fluorescente verde può essere utilizzato. Singola lunghezza d'onda LED possono essere facilmente (entro secondi) smontato e scambiate. In alternativa, ci sono array di LED disponibili che contengono diverse linee di suscitare diverse proteine fluorescenti (p.es. PE-2 coolled). Per attivare le misure con l'alternativa FRET coppie, altri cubi fluorescenti filtro può essere collocato nel microsc Ope, e, infine, il fascio-splitter filtri di emissione devono essere scambiate. Fotometrici offre cursori supplementari delle emissioni di filtro per DV2 DualView. Alcune applicazioni sviluppate recentemente usare due o più biosensori per monitorare simultaneamente più processi contemporaneamente, ad esempio cAMP e cGMP insieme in una cella 15. In questo caso, un QuadView (Photometrics) contenente quattro canali di emissione può essere utilizzato, il ImageJ plug-in per la divisione e analisi d'immagine può essere quindi adattato per essere usato con quattro canali e di calcolare due rapporti FRET. ImageJ software è molto flessibile in termini di analisi di immagine e rappresentazione online dei risultati. Semplice testo modificato plug-in consentono di adattare l'algoritmo software per le esigenze di qualsiasi sistema di imaging individuale e sperimentare. Questo a volte è molto utile e offre soluzioni rapide ai problemi tecnici, che possono richiedere tempi lunghi quando devono essere attuate in qualsiasi pacchetto software commerciale.
contenuto "> Quando facendo esperimenti FRET, è fondamentale per evitare fotodecolorazione che appare quando i tempi di eccitazione sono troppo lunghi o quando le immagini sono prese troppo spesso. In questo caso, un fotone danno indotto chimica o modificazioni covalenti di fluorofori possono verificarsi e diminuire l'efficienza di FRET. Per evitare photobleaching, si può ridurre il tempo di esposizione e la frequenza di acquisizione delle immagini. Ci sono anche stabilito protocolli 12,16 per correggere questo fenomeno. Durante l'analisi dei dati, è possibile correggere il cross-talk tra canali donatore e accettore (bleedthrough). Utilizzando unimolecolare biosensori FRET (caso in cui donatore e accettore fluorofori sono sempre espressi allo stesso livello) per misurazioni raziometriche semplici, può essere sufficiente a correggere solo per il bleedthrough del donatore nel accettore canale o anche omettere questa correzione tutto quanto non qualitativamente influenzare la forma della curva di rapporto FRET. La bleedthrough di thaccettore e nel canale dei donatori è di solito trascurabile. Quando biosensori bimolecolari composto da due proteine differenti sono utilizzati, questi possono essere espressi a livelli diversi. In questo caso, la correzione bleedthrough e un'ulteriore correzione per l'eccitazione YFP diretta dalla luce 440 nm sono inoltre opportuni. Si prega di fare riferimento al protocollo pubblicato 12 dove sono descritte tutte le procedure di correzione in modo più dettagliato. Ulteriori informazioni complete sullo sviluppo di biosensori, microscopia FRET, possibili insidie della tecnica e sulla analisi dei dati sono disponibili protocolli precedentemente pubblicato con il 17-18. In conclusione, il sistema di imaging semplice e potente qui descritta fornisce una piattaforma flessibile per monitorare vari eventi biochimici e molecole di segnalazione con elevata risoluzione temporale e spaziale in cellule vive.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Anke Rüttgeroth e Karina Zimmermann per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (sovvenzione NI 1301/1-1 di VON) e Università di Göttingen Medical Center ("pro futura" sovvenzione VON).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
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