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Biology

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

doi: 10.3791/4081 Published: August 20, 2012

Summary

포스터 공명 에너지 전달은 (걱정) 현미경 기자 등 다양한 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 강력한 기술이다. 여기 어떻게 사용자 정의 epifluorescence를 구축하는 것은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소와 방법을 실험을 안달을 위해 사용하는 방법에서 영상 시스템을 초조해 설명합니다.

Abstract

포스터 공명 에너지 전달은 (걱정) 현미경 라이브 세포와 조직의 생화학 및 신호 이벤트의 실시간 모니터링을위한 기법으로 증가 관심을 얻기 위해 계속합니다. 클래식 생화학 방법에 비해,이 소설 기술은 높은 시간적 공간적 해상도가 특징입니다. 실험 표현하고 원위치 또는 생체 1-2에 시간이 지남에 따라 이미징 될 수있는 다양한 유전자 인코딩 바이오 센서를 사용 초조해. 일반적인 바이오 센서 중 하나 단백질의 형광 태그 쌍 또는 기증자와 3-4 관심 분자에 대한 구속력있는 잔기와 상호 수용체 fluorophores을 비호하는 단일 단백질의 conformational 변화 사이에 걱정 측정하여 단백질 단백질 상호 작용을 신고 할 수 있습니다. 단백질 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 바이오 센서 포함, 예를 들어, 동안 unimolecular 센서 MEA, 세포 5 G-단백질 활성화를 모니터링하기위한 구성합니다suring conformational 변화 널리 칼슘 6, 캠프 7-8, 이노시톨 인산염 9 cGMP 10-11과 같은 이미지 초 메신저로 사용됩니다. 여기 어떻게 사용자 정의 epifluorescence를 구축하는 것이 하나의 상업적으로 이용 가능한 구성 요소와 방법 마이크로 관리자 프리웨어를 사용하여 전체 설정을 제어하는​​ 방법에서 영상 시스템을 초조해 설명합니다. 이 간단하지만 강력한 계기는 라이브 셀에 걱정 일상이나보다 정교한 측정을 위해 설계되었습니다. 획득 이미지는 그래픽 형식으로 저장되기 전에 모든 실험을하는 동안 실시간으로 초조해 비율의 변화를 시각적으로 자기 작성된 플러그인을 사용하여 처리됩니다와 호환 빌드 된 다음 데이터 분석에 사용 ImageJ 프리웨어. 이 저렴한 비용으로 시스템이 높은 유연성을 특징으로하며 성공적으로 사용할 수의 과다에 의해 다양한 생화학 행사 및 신호 분자를 모니터링하는 데 사용할 수있는 것은 라이브 세포와 조직에 바이오 센서를 안달. 예를 들어, 우리는 H를 보여β-아드레날린 수용체 작용제 및 차단기가있는 자극시 라이브 293A 세포에서 캠프의 실시간 모니터링을 수행하려면이 이미징 시스템을 사용하는 아야.

Protocol

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1. 설정하면 영상 현미경을 안달

원칙적으로 연구실에서 사용할 수 있으며 카메라 포트를 가진 역 형광 현미경은 이미지를 걱정에 적응 할 수 있습니다. 현미경과 광원 또는 추가 셔터, 방출 빛과 CCD 카메라 (그림 1 참조) 빔 - 스플리터가없는 : 최종 설정은 다음과 같은 중요한 구성 요소를 포함해야합니다. 하드웨어 장치, 특히 광원, 셔터와 카메라 통합 및 이미지 수집 및 분석을 수있는 이미징 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 다음은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소에서 간단한 안달 시스템을 조립하는 절차를 설명합니다.

  1. 현미경에 광원을 연결합니다. 예를 들어, 선택적으로 대부분의 기증자로 사용 강화 된 시안 형광 단백질 (CFP)는 바이오 센서를 걱정 자극 단일 파장 발광 다이오드 (P E-100, 440 nm의 CoolLED)을 사용합니다. 그것은 직접 할 수 있습니다리와 쉽게 현미경의 epifluorescence 조명 포트에 연결되어 있습니다. 비슷한 방법으로 연결할 수 있습니다 사용 가능한 멀티 파장 LED가 마련되어 있습니다. 대신 이러한 XBO75 크세논 아크 램프 (종종 올림푸스와 Zeiss 현미경에 사용) 또는 HBO 수은 램프 (보통 니콘 현미경에 설치)와 같은 LED, 다른 표준 광원의 사용할 수 있습니다. 형광 램프의 경우에, 당신은 또한 램프와 샘플에 가고 여기 빛의 소프트웨어 지원 제어를 가능하게하는 조명 포트 사이의 셔터를 배치해야합니다. 가 직접 소프트웨어로 켜고 전환 할 수 있기 때문에 CoolLED은 추가 셔터를 필요로하지 않습니다. 복합 및 bimolecular 바이오 센서와 협력 특히 다양한 필터 세트와 형광 램프,보다 유연한 옵션 중에 단일 색상 LED 시스템의 단점은, 여기 파장의 수는 제한되어 있습니다. 또는 단색화 장치의 광원 (예 : 색채 V, TILLPhotonics)가 될 수 있습니다사용, 그들은 일반적으로 트리거 신호를 통해 소프트웨어 제어 할 수있는 통합 셔터가 있습니다.
  2. 현미경에 적절한 필터 큐브를 배치합니다. 일상에 대한 CFP 및 향상된 노란색 형광 단백질 (YFP) 또는이 쌍을 걱정로서 변형의와 측정 초조, 우리는 LED가 사용될 때 생략 할 수 있습니다 ET436/30M 여기 필터를 (포함 된 간단한 필터 큐브를 사용하지만 필수 불가결합니다 크세논 또는 수은 램프보다는 LED)와 DCLP455 이색 성 거울을 사용하는 경우. 현미경은 40x 계획 - 형석, 계획 - neofluar 또는 계획 - 고차 색지움, 60x 또는 100x 기름 침지 목표로 예를 들어, 좋은 해상도 형광 현미경에 적합한 목표 장착해야합니다.
  3. 형광등 스위치를 빛 곳이 균등하게 시야에 걸쳐 분산되어 있는지 여부를 확인합니다. 이 경우가 아닌 경우, 추가 LED의 정렬 또는 램프는 표본의 최적의 조명을 달성하기 위해 필요합니다. 이 perfor 수 있습니다공간에 다이오드 또는 램프를 배치 나사를 사용하여 메드.
  4. 현미경의 방출 포트 중 하나에 C-마운트를 통해 빔 - 스플리터를 연결합니다. 예를 들어, 동시에 하나의 CCD 카메라 칩에 모니터링 할 수있는 두 (기증자와 수용체) 채널로 방출 빛을 분할 DV2 DualView (Photometrics)을 사용합니다. 또한, 이러한 Optosplit (케른 연구) 또는 하마 마츠 ORCA-D2 듀얼 파장을 카메라에 통합 된 빔 스플리터와 같은 다른 유사한 제품이 있습니다. CFP / YFP가 쌍을 안달를 들어, 우리는 사용하는 05-EM DV2와 함께 제공되는 각각 505dcxr 이색 성 거울 플러스 ET480/30M와 CFP와 YFP에 대한 ET535/40M 방출 필터를, 포함 필터를 설정.주세요 대신 빔 - 스플리터, 두 필터 기증자에 대한 큐브 (CFP, DCLP455 이색 성 거울, CFP 방출 필터의 ET436/30M 여기 필터를 포함)와 수용체 (CFP 여기 필터 DCLP455와 YFP 방출 필터를 포함) 채널에 사용됩니다많은 사람들이 시스템을 초조해. 또한, 카메라하기 전에 방출 필터와 자동 방출 필터 휠의 위치가없는 하나의 필터 큐브가 설치 될 수 있습니다. 이 경우, 동력 현미경이나 ~ 200-300 밀리 초 내에 두 개의 방출 필터 위치 사이의 필터 휠 가며 ratiometric 이미징을 수행합니다. 두 채널의 진정한 동시 인수는 중요하지 어디에 이미징 오히려 이러한 캠프 신호로 세포 내 프로세스를, 천천히 때 약간의 지연이 허용됩니다.
  5. 빔 스플리터에 CCD 카메라를 (예를 들어 ORCA-03G 나 하마 마츠 포토닉스에서 ORCA-R2의 사용) 연결합니다. 카메라와 함께 제공된 설명서에 설명 된대로, IEEE1394 컴퓨터 인터페이스에 카메라를 연결 FireWire 케이블을 사용합니다. 카메라 전환없이 카메라 드라이버를 설치합니다.
  6. 마지막으로, 컴퓨터와 광원 사이의 통신을 설립, LED 또는 t에 아두 이노 I / O 보드를 (예를 들어 아두 이노 Duemilanove이나 아두 이노 우노에 사용)를 연결그림 2와 같이 핀 GND (0)와 보드의 8에 연결된 LED 측면과 반대쪽에 두 개의 싱글 와이어에 일반 BNC 플러그를 포함해야합니다 BNC 케이블을 사용하여 셔터를 O. 조립 보드는 직접 컴퓨터의 USB 포트에 연결 할 수 있습니다.

2. 이미징 소프트웨어를 설정

이미지가 카메라에서 캡처와 광원을 제어하고 동기화하려면 이미징 소프트웨어가 컴퓨터에 설치되어 있어야합니다. MetaFluor (분자 장치), Slidebook (지능형 영상 혁신), VisiView (Visitron 시스템) 등 여러 가지 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 패키지가 있습니다. 여기 저렴한 비용으로 이미지에 대한 유연성의 높은 학위를 제공하는 오픈 소스 마이크로 관리자 프리웨어의 사용을 보여줍니다.

  1. 에서이 소프트웨어를 다운로드 http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / 색인.PHP / 마이크로 Manager_Version_Archive. 우리는 쉽게 우리 손에 구성되어있는 1.4.5 버전을 설치하시기 바랍니다.
  2. 컴퓨터의 USB 포트에 아두 이노 보드를 연결합니다. 에서 아두 이노 보드 제어 할 수있는 소프트웨어를 다운로드 http://www.arduino.cc/en/Main/software를 . 이 웹 사이트에있는 지시에 따라이 소프트웨어에게 사전에 마이크로 관리자를 시작하기 만 한 번 실행합니다. 마이크로 Manager 소프트웨어와 보드의 사용에 대한 코드를 업로드 할 수 있습니다. 코드에서 다운로드 할 수 있습니다 http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / 아두 이노 .
  3. LED와 카메라에 전환합니다. 소프트웨어를 시작하고 도구> 하드웨어 구성 마법사를 (그림 3 참조)를 선택하여 카메라와 LED (기타 광원 및 셔터)와 마이크로 관리자 통신을 구성합니다. 카메라를 포​​함하여 필수 구성 요소를 추가(예 : Hamamatsu_ DCAM)와 아두 이노 보드 (아두 이노 - 스위치, 아두 이노 - 허브와 아두 이노 - 셔터 장치를 추가). 다음 단계 동안, 마법사에 의해 제안 된 기본 설정을 사용합니다. 마법사하라는 메시지가 새로운 시스템 구성을 저장합니다.
  4. 도구> 장치 속성 브라우저를 엽니 주 메뉴를 사용합니다. "아두 이노 스위치 상태"를 아래로 스크롤하여 "1"을 선택합니다. 대화 상자를 닫습니다. "자동 셔터"상자가 주요 소프트웨어 대화 상자에 불만되어 있는지 확인합니다. 파일을 누르면> 소프트웨어를 시작한 후 언제든지 열 수 있어야 소프​​트웨어 구성을 저장 시스템 상태를 저장합니다. 이 보드 및 이미지 수집을 수행하기 위해 필요한 소프트웨어 간의 통신을 설정합니다.
  5. 카메라에서 오는 신호를 모니터링하기 위해 "라이브"버튼을 누르십시오. 형광 빛이 언제든지 "라이브"또는 "스냅"기능이 선택되어 일어나는 있는지 확인하십시오. 첫 번째 측정을 시작하기 전에, 당에 빔 스플리터와 함께 제공된 지침을 따르십시오두 채널의 광학 정렬을 형성하고 있습니다.

3. 세포 배양 및 Transfections

  1. autoclaved 원형 24mm 유리 coverslides (물론 당 1 coverslide)과 6 잘 접시를 준비합니다. 또한, 바닥이 유리로 셀 문화 요리는 사용할 수 있습니다.
  2. 세포가 한 하루를 보낸 후 50-70%이 confluency에 도달하는 D-가상 매체에있는 접시 나 요리로 293A 전지 (10 % FCS, 1 % L-글루타민과 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션으로 보충) 때문에 플레이트.
  3. 24 시간 도금 후 칼슘 인산염 transfection 방법 (3.5를 참조)를 사용하여 플라스미드 걱정 센서와 층류 벤치에서 셀을 transfect. 캠프 바이오 센서의 plasmids은 요청시 우리 그룹에서 구할 수 있습니다. 리더는 7,8 가능한 다른 캠프 바이오 센서를 설명하는 포괄적 인 리뷰라고합니다.
  4. 처음으로 세포를 transfecting 전에 transfection의 시약을 준비합니다. 2.5 M CaCl 2 2xBBS 솔루션을합니다 (후자 포함1.5 MM 그렇단 2 HPO 4, 50 밀리미터 BES, 280 MM NaCl은 탈 이온수에) NaOH로 pH를 6.95로 조정합니다. 멸균 여과 정기적 0.2 μm 필터를 사용하여 솔루션입니다.
  5. 의 6 잘 플레이트 또는 6 바닥이 유리로 요리를 transfect하려면 혼합 10 μg는 최대 500 μl에 2.5M CaCl 2 용액과 멸균 물 센서 플라스미드, 50 μl를 안달. 잘 섞는다.
  6. 배 BBS 500 μl를 추가합니다. 잘 섞은 후 실온에서 10 분의 혼합물을 품다.
  7. transfection 믹스의 피펫 165 μl은 각 잘 나 요리에 dropwise. 부드럽게 한 접시를 저어하고 보육에 다시 넣어. 세포는 일반적으로 transfection 한 후 측정 24 시간을 초조에 대한 준비가되어 있습니다. 이 여러 세포 표면 수용체의 활동에 영향을 미칠 수로 세포가,이 시점에서 confluency에 도달하지 않았는지 확인하십시오.

4. 라이브 셀의 측정을 안달

  1. 처음으로 측정하기 전에, 144 MM NaCl, 5.4 MM KCl, 1을 포함하는 걱정 버퍼를 준비MM MgCl 2, 2 MM CaCl 2, 10 MM 탈 이온수에 HEPES와 NaOH를 7.3로 산도를 조정합니다. 걱정 버퍼를 사용하여 이미징 실험에 사용되는 화합물을 희석.
  2. 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 이전에 정의 된 시스템 구성을로드합니다. 이전에 구성된 시스템 상태를 선택하는 파일>로드 시스템 상태를 선택합니다.
  3. 이미징 챔버 (예 : Attofluor 셀 챔버)에 자기편 transfected 293A 전지 coverslide를 탑재합니다. 버퍼를 걱정을 한 번 세포를 깨끗이 씻어 버퍼를 걱정 400 μl를 추가합니다. 사용하면 유리가 바닥 셀 문화 요리 자기편 세포를 씻고 요리 당 버퍼의 2 ML를 추가합니다. 우리는 CO 2 제어가 필요하지 않습니다 있도록 HEPES를 포함하는 걱정 버퍼에 실내 온도에서 모든 측정을 수행합니다.
  4. 목표에 일부 집중 기름을 넣고 현미경로 이미징 챔버를 전송할 수 있습니다. transillumination 빛을 사용하여 셀 레이어에 초점을 맞 춥니 다.
  5. 형광 lig에 전환"라이브"버튼을 눌러, 그리고 실험의 셀을 선택하여 HT. 너무 밝고 너무 희미하지 못해해야 즉, 최적의 센서 표현으로 셀을 선택합니다. 적절한 셀을 찾는 후, 걱정 센서의 photobleaching 피하기 위해 즉시 형광등을 전환 할 수 있습니다.
  6. "스냅"버튼을 눌러 후 획득 이미지의 좋은 신호 대 잡음 비율로 연결하는 방식으로 "카메라 설정"(보통 10-50 밀리 초)에서 노출 시간을 조정합니다. 낮은 이미지 품질이 너무 짧은 시간 결과 동안 너무 오래 여기 시간은, photobleaching 될 수 있습니다.
  7. "멀티-D Acq을"을 누르십시오. 버튼과 시간 포인트의 수와 이미지 수집을위한 시간 간격을 설정합니다. 우리 캠프 안달 센서의 경우, 우리는 하나의 이미지마다 5을 획득.
  8. "수집"버튼을 눌러 측정을 시작합니다.
  9. 모든 측정하는 동안 하나는 "온라인 걱정"플러그인 (온라인 보충에서 사용할 수있는 모든 플러그인해야 경찰 사용할 수 있습니다모니터링 할을 시작하기 전에 귀하의 마이크로 Manager 소프트웨어의 "플러그인"폴더)에 폭발물은 온라인으로 비율을 변경 초조해. 이 플러그인을 실행하고 "프리 핸드 선택"도구를 사용하여 안달 비율 이미지에 대한 관심의 영역을 선택합니다. 투자 수익 (ROI) 관리자에 지역을 추가하고 "시간 시리즈 분석기"창에서 "가져 오기 평균 '버튼을 누르십시오. 비율 추적이 걱정이 표시됩니다. 측정하는 동안 추적을 업데이트하려면 "FRETratioOnline2"플러그 - 인을 실행하고 "GetAverage"버튼을 누르십시오.
  10. 즉시이 걱정으로 비율이 안정 기준을 정확하게 요리 / 챔버 내로을 pipetting하여 원하는 화합물을 적용 도달했습니다. 약리 화합물로 세포를 치료하는 대신 간단한 pipetting의 재관류 시스템은이 단계에서 사용할 수 있습니다.
  11. 실험을 완료 한 후, 이미지의 시간 경과 스택을 저장합니다. 현미경에서 측정 챔버를 제거하고 객관적 조직을 사용하여 목표를 청소하십시오.
  12. 로 측정을 반복 4.3 단계로 돌아 가기새로운 샘플.

5. 오프라인 데이터 분석

걱정 이미징 데이터는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 실험 후 언제든지 오프라인 분석 할 수 있습니다. 이 프로토콜에 대한 보충으로, 우리는 "FREToffline"플러그 - 인 기증자와 수용체 채널로 획득 한 이미지를 분할하고 관심의 여러 지역에서 형광 강도를 측정하기 위해 실험실에서 사용을 제공합니다. 이 농도는 더 할 수 있습니다 복사 붙여 넣기 수정 안달 비율을 계산하는 Excel 또는 원산지 스프레드 시트에. unimolecular 바이오 센서의 변경 사항을 안달 시각화하기 위해 간단한 ratiometry은 종종 사용됩니다. 이 경우 만 기증자 형광 (CFP)가 흥분하고 있으며, 두 이미지는 CFP와 YFP 방출 피크에서 찍은 수 있습니다. 계산 YFP / CFP 비율 (종종 CFP / 안달 비율로 지칭)는 두 fluorophores 사이에 걱정의 정도를 나타냅니다. unimolecular 바이오 센서에 CFP와 YFP의 moieties의 번호는 간단한 ratiometry이 suffi이 있도록 같다효율성 12 안달 대표 할 cient.

  1. 플러그인주세요> 마이크로 관리자> 열기 마이크로 관리자 파일을 선택하여 실험 파일을 열 ImageJ 소프트웨어를 사용합니다.
  2. "FREToffline"플러그인을 실행 개별 CFP와 YFP 채널로 시간 경과 스택을 분할된다.
  3. 배경 보정이 필요한 경우,이 친구는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행 할 수 있습니다.
  4. 이미지의 YFP 스택을 클릭하고 하나의 "프리 핸드 선택"도구를 사용하여 관심의 여러 영역을 선택하고 '추가'버튼을 눌러 창에서 플러그인 "MultiMeasure"에 추가합니다.
  5. "MultiMeasure"창에서 관심 지역을 선택하고 각 프레임과 각 지역의 평균 회색 값으로 표를 얻기 위해 "멀티"를 누르십시오. Ctrl 키를 사용하여 모든을 선택하여 클립 보드에 데이터를 복사 + A 및 Ctrl + C를 눌러 Excel 또는 원래 스프레드 시트를 열고 Ctrl 키를 + V.를 눌러 데이터를 붙여 넣기
    프로그램에 의해 수행 된 측정> 세트 M에게 분석에서 구성 할 수 있습니다 이 매개 변수를 측정 할 정의 할 수 있습니다 easurements. 우리는 일반적으로이 대화 상자에서 "회색 값을 평균"을 선택합니다.
  6. 이미지의 CFP 스택에 클릭합니다. 5.5에서 설명 된대로 동일한을 수행합니다. 같은 Excel 또는 원산지 스프레드 시트에 CFP 강도 데이터를 붙여 넣습니다.
  7. Excel 또는 원산지 소프트웨어 사용하여 수정 걱정 비율을 계산합니다. 간단한 단일 체인 unimolecular의 바이오 센서가 이미징 때, 우리는 수용체 채널에 기증 형광의 bleedthrough에 대한 수정합니다. 이 경우 수정 수용체​​ / 기부자 비율은 다음과 같습니다 :
    비율 = (YFP - B X CFP) / CFP
    B는 CFP 플라스미드와 셀을 transfecting와 YFP 채널 (B = YFP / CFP)에 기증 형광의 비율을 측정하여 결정 할 수있는 보정 계수입니다. 그것은 단지 곡선의 모양에 어떤 질적 영향없이 걱정 응답의 전체 진폭에 영향을 미칠 수 있기 때문에 unimolecular 바이오 센서에 대해이 수정을 생략하는 것은 가능합니다.
jove_title "> 6. 대표 결과

그림 1은의 예를 보여줍니다 완전히 니콘 역 현미경, CoolLED, DV2 DualView와 하마 마츠 ORCA-03G CCD 카메라로 구성된 이미지 설정을 초조해 조립.주세요 하드웨어 구성 요소와 컴퓨터 간의 통신을 설정하려면, I / O 아두 이노 보드는 컴퓨터와 CoolLED 그림 2에 표시된 연결되어 있습니다. 동기화 방식으로 카메라에 의해 캡처 광원과 이미지를 제어하려면 마이크로 Manager 소프트웨어가 설치되어야하고 적절하게 (그림 3 참조) 구성. 이 프리웨어는 쉽게 플러그인 필요를 추가하여 개별 실험 요구에 적응 할 수 있습니다. 그림 4A는 대표 원시은 β-아드레날린 작용제의 효과를 모니터링하기 위해 293A 세포로 표현 캠프 센서 Epac1 - 캠프 13 사용하여 측정의 비율 흔적을 안달 보여줍니다 isoproterenol 시간이 지점 150 초에서 적용 및 내기, - 차단기가 propranolol 시간을 포인트 300 초 (등 4.3-4.10에 설명 된 수행)에 추가되었습니다. 이러한 데이터를 분석 할 수 있습니다 오프라인 얻기 위해 5.1-5.7에 설명 된대로 YFP 채널에 CFP의 bleedthrough에 대한 수정도 4b에 도시 된 바와 같이 비율 추적을 초조해 수정. 이 대표 실험은 세포 내 캠프의 증가를 나타냅니다 isoproterenol 치료시 걱정 모니터링 비율로 속도가 느린 감소를 보여줍니다. β-차단은 기초 수준 캠프의 감소로 이어지는, isoproterenol 신호를 반전으로 Propranolol. 의 이러한 변화는 신호가 어떤 실험을합니다 (4.9에서 설명)에 온라인으로 모니터링 할 수 있습니다 초조해. 이러한 실험은 다른 초 메신저 또는 생화학 프로세스를 모니터링하기위한 일반적으로 사용되는 바이오 센서의 다양한 수행 할 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 레이아웃에 CoolLED 구성 이미지 설정을 안달verted 니콘 현미경, DV2 DualView, 그리고 ORCA-03G CCD 카메라.

그림 2
그림 2. 아두 이노 I / O 보드와의 연결. 보드는 자체 장착 된 플라스틱 상자에 위치하고 있습니다. 표준 BNC 케이블은 보드의 핀 8 GND (0)으로 LED를 연결합니다.

그림 3
하드웨어 구성 마법사를 사용하여 시스템 구성 요소의 통합을 보여 그림 3. 스크린 샷이 있습니다. A) 하드웨어 구성 마법사를 시작합니다. 2.3에 언급 된대로 B) 필요한 장치를 추가 할 수 있습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 4
그림 4. 담당자가 experimen을 안달Epac1 - 캠프와 transfected 293A 세포에서 캠프 수준을 측정 t. 첫째, 전지 (YFP / CFP의 감소로 관찰 비율을 걱정) 캠프를 높일 수있는 β-아드레날린 작용제의 isoproterenol (100 NM, 초 프레임 30이나 150)를 자극했다. 셀은 이후 캠프에 감소를 반영, 아가야 비율의 증가로 연결 propranolol β-차단 (초 프레임 60 또는 300 10 μM)로 처리되었습니다. A) 원료 온라인 상응하는 관심 중 하나가 지역에서 비율 흔적을 안달 오프라인 데이터 분석 등의 5.1-5.7에 설명 된 수행 한 후 실험이 진행되는 동안 모니터링 한 셀에. B) 비율 추적을 교정.

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Discussion

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이 프로토콜에서, 우리는 가능한 바이오 센서의 다양한 일상 응용 프로그램에 대한 간단한 저렴한 비용으로하지만 강력한 걱정 이미징 시스템을 구축하는 방법을 보여줍니다. 여기에 제시된 시스템은 기증자 - 수용체 쌍으로 CFP와 YFP, 또는 형광 단백질의 유사한 유형을 위해 설계되었습니다. 한편, 다른 개인의 바이오 센서는 예를 들어 녹색과 적색 형광 단백질에게 14 사용하는 사용할 수 있습니다. 다른 색상의 설명 시스템을 적응하려면 적절한 광원 및 / 또는 필터 세트 선택해야합니다. LED, 또 다른 하나의 LED 라인의 경우, 예를 들어 490 nm의 녹색 형광 단백질을 사용하실 수 있습니다 흥분이 있습니다. 단일 파장 LED가 탑재 해제 및 교환 (초 이내) 쉽게 할 수 있습니다. 또한, 다양한 형광 단백질 (예를 들면 PE-2 CoolLED) 재밌게하기 위해 여러 줄을 포함 사용할 수 LED 배열이 있습니다. 대안으로 측정을 활성화하려면하면 쌍을 걱정, 다른 형광 필터 큐브는 microsc에 배치 할 수 있습니다 ope, 결국 방출 빔 - 스플리터 필터는 교환해야합니다. Photometrics는 DV2 DualView에 대한 추가 방출 필터 슬라이더를 제공합니다. 일부 최근에 개발 된 응용 프로그램은 예를 들어 캠프, 동시에 여러 프로세스를 모니터링하고 한 셀 15 함께 cGMP에 동시에 두 개 이상의 바이오 센서를 사용합니다. 이미지 분할 및 분석은 다음 4 개의 채널과 함께 사용되도록 구성 할 수 있으며 계산하기 위해이 경우에는, 4 방출 채널을 포함하는 QuadView (Photometrics)가 사용할 수 ImageJ는 플러그인 둘은 비율을 초조해. ImageJ 소프트웨어 이미지 분석 및 결과의 온라인 표현의 관점에서 매우 유연합니다. 간단한 텍스트 편집 플러그인은 개별 이미징 시스템과 실험의 필요에 따라 소프트웨어 알고리즘의 적응을 할 수 있습니다. 이은 때로 아주 도움이 될 것입니다 그리고 어떤 상용 소프트웨어 패키지로 구현되어있을 때 긴 시간을 필요로 할 수있는 기술적 인 문제에 빠른 솔루션을 제공합니다.

내용 "> 실험을 걱정하는 경우가 여기 시간은 이미지가 너무 자주 촬영하는 경우 너무 길거나 할 때 나타나는 photobleaching 피하기 위해 매우 중요합니다.이 경우, 광자 - 유도 화학 손상 또는 fluorophores의 공유 결합 수정 발생할 수 있습니다 효율성을 걱정 낮출 수 있습니다. photobleaching 피하기 위해, 하나는 노출 시간과 이미지 수집의 빈도를 줄일 수 있습니다. 또한이 현상에 대한 해결하기 위해 프로토콜 12,16 명이 설립되어 있습니다. 데이터 분석에는 그 사이의 크로스 토크에 대한 수정 할 수 있습니다 기증자와 수용체 채널 (bleedthrough)가. unimolecular를 사용하면 간단한 ratiometric 측정을위한 바이오 센서를 (있는 경우 기증자와 수용체 fluorophores은 항상 동일한 수준에서 표현됩니다) 걱정,이 수용체에 접근하는 가장 기증자의 bleedthrough에 대한 해결하기 위해 충분한 수 채널 또는 그 질적 안달 비율 곡선의 모양에 영향을주지 않기 때문에도 모두이 수정을 생략하십시오. 일의 bleedthrough기증자 채널로 전자 수용체는 일반적으로 무시할 수 있습니다. 두 개의 서로 다른 단백질로 구성 bimolecular 바이오 센서가 사용되면,이은 다양한 수준에서 표현 될 수 있습니다. 이 경우 bleedthrough 수정 및 440 nm의 빛에 의해 직접 YFP를 여기에 추가 보정도 권장합니다. 모든 보정 절차를 자세히 설명되어있는 게시 된 프로토콜 12을 참조하십시오. 바이오 센서의 개발에 대한 자세한 포괄적 인 정보가 현미경을 걱정, 기술과 데이터 분석에 대한 가능한 함정은 이전에 다음 ID로 출판 프로토콜 17-18에서 사용할 수 있습니다. 결론적으로, 여기에 설명 된 간단하고 강력한 이미징 시스템은 라이브 셀에 높은 시간적 공간적 해상도로 다양한 생화학 행사 및 신호 분자를 모니터링 할 수있는 유연한 플랫폼을 제공합니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

저자는 기술 지원을 Anke Rüttgeroth와 카리나 Zimmermann 감사드립니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (폰에 부여 NI 1301/1-1)와 괴팅겐 의료 센터의 대학 (폰에 '프로 futura "보조금)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BES Buffer Grade AppliChem A1062
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C5010
Glass coverslides Thermo Scientific 004710781 Diameter 24 mm
Glass-bottomed cell-culture dishes World Precision Instruments FD3510-100
D-MEM medium Biochrom AG F0445
Fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30073.02
L-Glutamine Biochrom AG K0283
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P5405
MgCl2 hexahydrate AppliChem A4425
NaCl AppliChem A1149
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9707
Penicillin/Streptomycin Biochrom AG A2213
Inverted fluorescent microscope e.g. Nikon Request at Nikon
CoolLED CoolLED pE-100 440 nm
DualView Photometrics DV2-SYS
DualView filter slider Photometrics 05-EM
CFP/YFP filter set Chroma Technology 49052 without the emission filter
ORCA-03G camera Hamamatsu Photonics C8484-03G02
Arduino I/O board Sparkfun Electronics DEV-00666
Attofluor cell chamber Invitrogen A-7816
Personal computer with WindowsXP or Windows7 system Any supplier Include hard-drive with high capacity

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References

  1. Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
  2. Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
  3. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
  4. Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
  5. Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
  6. Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
  7. Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
  8. Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
  9. Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
  10. Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. 229-243 (2009).
  11. Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
  12. Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
  13. Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
  14. Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
  15. Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
  16. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
  17. Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
  18. Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달
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Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors. J. Vis. Exp. (66), e4081, doi:10.3791/4081 (2012).More

Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors. J. Vis. Exp. (66), e4081, doi:10.3791/4081 (2012).

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