Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

FRET Mikroskopi for sanntids overvåking av signalanlegg hendelser i levende celler Bruke Unimolecular biosensorer

doi: 10.3791/4081 Published: August 20, 2012

Summary

Förster resonans energi overføring (FRET) mikroskopi er en kraftfull teknikk for sanntids overvåking av signalanlegg hendelser i levende celler ved hjelp av ulike biosensorer som journalister. Her beskriver vi hvordan du kan bygge en tilpasset epifluorescence FRET imaging system fra kommersielt tilgjengelige komponenter og hvordan du bruker den for FRET eksperimenter.

Abstract

Förster resonans energi overføring (FRET) mikroskopi fortsetter å vinne økende interesse som en teknikk for sanntids overvåking av biokjemiske og signalering hendelser i levende celler og vev. Sammenlignet med klassiske biokjemiske metoder, denne romanen teknologien preget av høy temporal og romlig oppløsning. FRET bruker eksperimenter ulike genetisk kodede biosensorer som kan uttrykkes og avbildes over tid in situ eller in vivo 1-2. Typiske biosensorer kan enten rapportere protein-protein interaksjoner ved å måle FRET mellom en fluorofor-merket par proteiner eller konformasjonsforandringer endringer i et enkelt protein som havner donor og akseptor fluoroforer innbyrdes forbundet med et bindende del for et molekyl av interesse 3-4. Bimolecular biosensorer for protein-protein interaksjoner omfatter f.eks, konstruerer utviklet for å overvåke G-protein aktivering i celler 5, mens de unimolecular sensorer measuring konformasjonsforandringer endringer er mye brukt til bilde andre budbringere som kalsium 6, 7-8 cAMP, xylanase 9 og cGMP 10-11. Her beskriver vi hvordan du kan bygge en tilpasset epifluorescence FRET imaging system fra enkle kommersielt tilgjengelige komponenter og hvordan å kontrollere hele oppsettet med Micro-Manager freeware. Denne enkle, men kraftige instrument er utformet for rutinemessig eller mer sofistikert FRET målinger i levende celler. Ervervet bilder er behandlet ved hjelp selvskrevet plug-ins for å visualisere endringer i FRET forholdet i sanntid i løpet av noen eksperimenter før de blir lagret i en grafikk format som er kompatibelt med den innebygde ImageJ freeware brukes for etterfølgende data analyse. Dette rimelige systemet er preget av høy fleksibilitet og kan med hell brukes til å overvåke ulike biokjemiske hendelser og signalmolekyler av en mengde tilgjengelig FRET biosensorer i levende celler og vev. Som et eksempel viser vi how å bruke dette bildesystem for å utføre sanntids overvåkning av cAMP i levende 293A celler upon stimulering med en β-adrenerg reseptoragonist og stopperen.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Sette opp en FRET Imaging mikroskop

I prinsippet kan en hvilken som helst invertert fluorescensmikroskop som er tilgjengelig i laboratoriet og har et kamera port være tilrettelagt for FRET avbildning. Den endelige oppsettet skal omfatte følgende viktige komponenter: et mikroskop, en lyskilde med eller uten ytterligere lukker, en bjelke-splitter for utslipp lys og et CCD-kamera (se Figur 1). Maskinvareenhetene, spesielt lyskilde, lukkeren og kameraet er integrert i og kontrollert av bildebehandlingsprogrammer som gjør bildeopptak og analyse. Nedenfor beskrives en fremgangsmåte for å sette sammen et enkelt FRET system fra kommersielt tilgjengelige komponenter.

  1. Koble lyskilde til mikroskopet. For eksempel bruke en enkelt bølgelengde lysdiode (CoolLED P E-100, 440 nm) som selektivt excites forbedret cyan fluorescerende protein (CFP) brukes som en donor i de fleste FRET biosensorer. Det kan være direktely og lett koblet til epifluorescence belysning port av mikroskopet. Det finnes også multi-bølgelengde lysdioder tilgjengelige som kan kobles på en lignende måte. Istedenfor av LED, andre vanlige lyskilder som XBO75 xenon buelampe (ofte brukt for Olympus og Zeiss mikroskoper) eller HBO kvikksølvlampe (vanligvis installert på Nikon mikroskoper) kan brukes. I tilfelle av en fluorescerende lampe, bør det også plasseres en skodde mellom lampen og belysning port til aktivere programvare-assistert kontroll av magnetiseringssystemet lyset kommer inn prøven. CoolLED krever ingen ekstra skodde siden det kan være direkte slås av og på av programvaren. Ulempen med de ensfargede LED-systemer er et begrenset antall eksitasjonsbølgelengdene, mens et lysrør med ulike filter sett er en mer fleksibel alternativ, spesielt når du arbeider med flere og bimolecular biosensorer. Alternativt kan monokromator lyskilder (f.eks Polychrome V, TILLPhotonics) værebrukt, de vanligvis har en integrert lukker som kan være programvare-kontrollert via en trigger signal.
  2. Plasser et passende filter kube i mikroskopet. For rutinemessig FRET målinger med CFP og forbedret gule fluorescerende protein (YFP) eller noen av deres varianter som FRET par, bruker vi et enkelt filter kube som inneholder en ET436/30M eksitasjon filter (som kan utelates når LED brukes, men er uunnværlig ved bruk av en xenon eller kvikksølvlampe fremfor LED) og en DCLP455 dikroisk speil. Mikroskopet skal også være utstyrt med en objektiv egnet for en god oppløsning fluorescens mikroskopi, for eksempel med en plan-fluor, plan-neofluar eller plan-apochromat 40x, 60x eller 100x olje-immersion mål.
  3. Slå på fluorescerende lys og sjekk om den lyse flekken er jevnt fordelt over hele synsfeltet. Hvis dette ikke er tilfelle, er ytterligere innretting av LED eller lampen kreves for å oppnå optimal belysning av prøven. Dette kan være prestamed ved hjelp av skruene som posisjonere diode eller lampen i verdensrommet.
  4. Koble beam-splitter via en C-mount til en av mikroskop utslippsbehov porter. For eksempel bruke DV2 DualView (Fotometri) som deler utslipp lys inn to (donor og mottakermolekyl) kanaler som kan brukes samtidig overvåkes på en enkelt CCD-kamera chip. Alternativt finnes det andre sammenlignbare produkter som Optosplit (Cairn Research) eller en strålesplitter integrert i Hamamatsu ORCA-D2 dual-bølgelengde kamera. For CFP / YFP FRET par, bruker vi 05-EM filtrere satt inneholder 505dcxr dichroic speil pluss ET480/30M og ET535/40M utslipp filtre for CFP og YFP, henholdsvis som følger med DV2. I stedet for en bjelke-splitter, to filter kuber for giveren (som inneholder ET436/30M eksitasjon filter for CFP, den DCLP455 dichroic speil og CFP utslipp filter) og akseptor (inneholder CFP eksitasjon filter, DCLP455 og YFP utslipp filter) kanaler benyttes imange FRET systemer. Alternativt kan ett filter kube uten utslipp filter og en automatisk utslipp filterhjul posisjon før kameraet være installert. I dette tilfellet, til en motorisert mikroskop eller filteret hjulet alternerer mellom to utslipp filteret stillinger innenfor ~ 200-300 msek utføre Proporsjonal avbildning. Dette mindre forsinkelse er akseptabelt når imaging ganske treg intracellulære prosesser, for eksempel cAMP signaler, der virkelig samtidig kjøp av begge kanaler er ikke kritisk.
  5. Koble CCD-kamera (bruk for eksempel ORCA-03G eller ORCA-R2 fra Hamamatsu Photonics) til strålesplitter. Bruk en FireWire-kabel til å koble kameraet til IEEE1394 datamaskin-grensesnitt, slik det er beskrevet i manualen som fulgte med kameraet. Installere kamera drivere uten å slå på kameraet.
  6. Til slutt, for å etablere kommunikasjon mellom datamaskinen og lyskilden, koble Arduino I / O-kort (bruk for eksempel Arduino Duemilanove eller Arduino Uno) til LED eller to lukkeren ved hjelp av en BNC kabel som bør inneholde en normal BNC plugg på LED side og to enkle ledninger på den andre enden er koblet til pinnene GND (0) og 8 av styret som vist i figur 2. Den sammensatte styret kan kobles direkte til en USB-port på datamaskinen.

2. Sette opp Imaging Software

Å kontrollere og synkronisere lyskilde med å ta bilder med kameraet, bør bildebehandlingsprogrammer være installert på datamaskinen. Det er flere kommersielt tilgjengelige programvarepakker inkludert MetaFluor (Molecular Devices), Slidebook (Intelligent Imaging Innovations), VisiView (Visitron Systems). Her har vi demonstrere bruk av open-source Micro-Manager freeware som tilbyr en høy grad av fleksibilitet for lave kostnader bildebehandling.

  1. Last ned denne programvaren på http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Micro-Manager_Version_Archive. Vi anbefaler at du installerer den 1.4.5 versjonen som er lett konfigurerbart i våre hender.
  2. Koble Arduino bord til en USB-port på datamaskinen. Last ned programvare for å styre Arduino styret fra http://www.arduino.cc/en/Main/software . Følg instruksjonene på denne nettsiden og kjøre denne programvaren bare én gang før du starter Micro-Manager. Last en kode for bruk av styret med Micro-Manager programvare. Koden kan lastes ned på http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Arduino .
  3. Slå på LED og kameraet. Start programmet og konfigurere Micro-Manager kommunikasjon med kameraet og LED (andre lyskilder og skodde) ved å velge Verktøy> Hardware Configuration Wizard (se figur 3). Legg de nødvendige komponenter, inkludert kameraet(Dvs. Hamamatsu_ DCAM) og Arduino Board (legg Arduino-Switch, Arduino-Hub og Arduino-Shutter-enheter). I løpet av de neste trinnene, bruker standardinnstillingene foreslått av veiviseren. Lagre det nye systemet konfigurasjon når du blir bedt om av veiviseren.
  4. Bruk hovedmenyen for å åpne Verktøy> Device Eiendom Browser. Rull ned til "Arduino Switch State" og velg "1". Lukke dialogboksen. Kontroller at "auto-shutter" er merket av i de viktigste programvaren dialogen. Trykk Fil> Lagre System State å lagre programvarekonfigurasjonen som skal åpnes når som helst etter at du starter programvaren. Dette vil etablere kommunikasjon mellom styret og programvaren som trengs for å utføre image oppkjøpet.
  5. Trykk på "Live"-knappen for å overvåke signalet fra kameraet. Sørg for at fluorescerende lys går på når som helst "Live" eller "Snap"-funksjonen er valgt. Før du starter de første målingene, følger du instruksjonene som følger med strålesplitter til perdanne det optiske innretting av begge kanaler.

3. Cellekultur og transfeksjoner

  1. Forbered 6-brønners plater med autoklaveres runde 24 mm glass coverslides (1 coverslide per brønn). Alternativt kan glass-bunn celle-kultur retter brukes.
  2. Plate 293A celler hylsene for plater eller retter i D-MEM medium (supplert med 10% FCS, 1% L-glutamin og 1% penicillin / streptomycin løsning) slik at cellene når 50-70% konfluens etter en dag.
  3. 24 hr etter plating, transfektere cellene i en laminær benk med en FRET sensor plasmid med kalsiumfosfat transfeksjon metoden (se 3.5). cAMP biosensor plasmider kan fås fra vår gruppe på forespørsel. Leseren er også referert til de omfattende vurderinger 7,8 beskriver andre tilgjengelige cAMP biosensorer.
  4. Før transfecting celler for første gang, forberede transfeksjon reagenser. Utgjør en 2,5 M CaCl 2 og 2xBBS løsninger (sistnevnte inneholder1,5 mM Na 2 4 HPO, 50 mM BES, 280 mM NaCl, juster til pH 6,95 med NaOH) i deionisert vann. Steril filtratet løsningene ved hjelp av en vanlig 0,2 mikrometer filter.
  5. Å transfektere en 6-brønns plate eller 6 glass-bunn retter, bland 10 ug FRET sensor plasmid, 50 pl av 2,5 M CaCl 2 løsning og sterilt vann opp til 500 pl. Bland godt.
  6. Legg til 500 ul 2x BBS. Bland godt og inkuber blandingen i 10 minutter ved romtemperatur.
  7. Pipetter 165 ul av transfeksjon mix dråpevis på hver brønn eller parabol. Rør forsiktig platen og sette den tilbake i inkubatoren. Cellene er vanligvis klar for FRET målinger 24 timer etter transfeksjon. Sørg for at cellene ikke har nådd sammenflyting på dette punktet, fordi dette kan påvirke aktiviteten av flere celle-overflate reseptorer.

4. FRET Målinger i levende celler

  1. Før måling for første gang, å forberede FRET buffer inneholdende 144 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1mM 2 MgCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES i deionisert vann og justere pH til 7,3 med NaOH. Fortynn de forbindelser som skal brukes i dine bildebehandling eksperimenter med FRET bufferen.
  2. Start bildebehandlingsprogrammer. Laste tidligere definert system konfigurasjon. Velg File> Load System stat å velge den tidligere konfigurert system tilstand.
  3. Monter en coverslide med tilhenger transfekterte 293A celler i bildebehandling kammeret (f.eks Attofluor celle kammer). Vask cellene gang med FRET buffer og legger til 400 ul FRET buffer. Ved bruk glass-bunn celle-kultur retter vaske adherente celler og tilsett 2 ml av buffer per parabolen. Vi utfører alle målinger ved romtemperatur i FRET buffer inneholdende HEPES, slik at ingen CO 2 kontroll er nødvendig.
  4. Sette noen immersjonsolje på objektiv og overføre bildebehandling kammer på mikroskopet. Fokus på celle laget ved hjelp transillumination lys.
  5. Slå på fluorescerende LIGht ved å trykke på "Live"-knappen, og velg en celle for forsøket. Velg en celle med en optimal sensor uttrykk, noe som betyr at det skal være ikke altfor lyst og ikke for svak. Etter å finne en passende celle, slå av fluorescerende lys umiddelbart for å unngå photobleaching av FRET sensoren.
  6. Justere eksponeringen tid under "Kamerainnstillinger" (vanligvis 10-50 msek) på en måte som fører til et godt signal-til-støy-forhold på det oppkjøpte bildet etter å ha trykket på "Snap"-knappen. For lang eksitasjon ganger kan resultere i photobleaching, mens for kort tid gir lav bildekvalitet.
  7. Trykk på "Multi-D Acq." -knappen og antall tidspunkter og tidsintervallet for bildeopptak. For vår cAMP-FRET sensor, får vi ett bilde hver 5 sek.
  8. Starter målingen ved å trykke på "Hent"-knappen.
  9. Under en måling, kan man bruke "FRET online" plug-in (tilgjengelig i Online Supplement, må alle plug-ins være politimannIED inn i "plugins"-mappen på Micro-Manager programvare før du starter den) for å overvåke FRET ratio endringer på nettet. Kjør dette plug-in og velg en region av interesse i FRET forholdet bildet ved hjelp av "Freehand valg"-verktøyet. Legg regionen i ROI manager og trykk på "Get gjennomsnittet"-knappen i "Time-serien analysator"-vinduet. Fret ratio spor vises. Hvis du vil oppdatere spor under målingen, kjør "FRETratioOnline2" plug-in og trykk på "GetAverage"-knappen.
  10. Så snart FRET forholdet har nådd en stabil grunnlinje påføre ønskede forbindelsen ved nøyaktig pipettere det inn i tallerken / kammer. Å behandle cellene med farmakologiske forbindelser, kan et perfusjon system istedenfor enkle pipettering brukes på dette stadiet.
  11. Etter endt forsøket, lagre time-lapse stabel med bilder. Fjern målekammeret fra mikroskopet og rengjør målet ved hjelp av en objektiv vev.
  12. Gå tilbake til trinn 4,3 til gjenta målingen med enny prøve.

5. Offline Data Analysis

Fret imaging data kan analyseres offline når som helst etter forsøket med ImageJ programvare. Som et supplement til denne protokollen, gir vi "FREToffline" plug-in som brukes i vårt laboratorium for å splitte de oppkjøpte bilder til donor og akseptor kanaler og måle fluorescerende intensiteter i flere regioner av interesse. Disse intensiteter kan videre kopi-limt inn i et Excel-eller Origin regneark til å beregne korrigert FRET forholdet. Å visualisere FRET endringer av unimolecular biosensorer, enkel ratiometry ofte brukt. I dette tilfellet er det bare donor fluoroforen (CFP) spent, og to bilder tatt på CFP og YFP utslipp topper. Den beregnede YFP / CFP ratio (noen ganger også referert til som FRET / CFP ratio) representerer graden av FRET mellom de to fluoroforer. I unimolecular biosensorer, antall CFP og YFP deler er like, slik at den enkle ratiometry er tilstrekstrekkelig til å representere FRET effektivitet 12.

  1. Bruk ImageJ programvare for å åpne forsøket fil ved å velge Plugins> Micro-Manager> Åpne Micro-Manager fil.
  2. Kjør "FREToffline" plug-in som deler time-lapse stabelen i enkelte CFP og YFP kanaler.
  3. Hvis bakgrunnsstøyen korrigering er nødvendig, kan dette utføres ved hjelp ImageJ programvare.
  4. Klikk på YFP stabel med bilder og velge en eller flere regioner av interesse ved hjelp av "Freehand valg"-verktøyet og legge dem til "MultiMeasure" plug-in-vinduet ved å trykke på "Legg til"-knappen.
  5. Velg regionene av interesser i "MultiMeasure"-vinduet og trykk "Multi" for å få en tabell med gjennomsnittlig grå verdier for hver ramme og hver region. Kopiere dataene til utklippstavlen ved å velge alle bruker Ctrl + A og ved å trykke Ctrl + C. Åpne en Excel eller Origin regneark og lime inn dataene ved å trykke Ctrl + V.
    Målinger utført av programmet kan konfigureres under Analyser> Set M easurements der du kan definere parametre som skal måles. Vi velger vanligvis bare "Mean grå verdi" i denne dialogen.
  6. Klikk på CFP bunken med bilder. Utføre det samme som beskrevet i 5.5. Lim CFP intensitet data i samme Excel eller Origin regneark.
  7. Bruke Excel eller Origin programvare, beregne korrigert FRET forholdet. Når enkle single-kjeden unimolecular biosensorer er avbildes, korrigere vi bare for bleedthrough av donor fluorescens i akseptor kanalen. I dette tilfellet, er den korrigerte akseptor / donor-forhold:
    Forhold = (YFP - B x CFP) / CFP
    Hvor B er korreksjonsfaktoren som kan fastslås ved å transfecting celler med CFP plasmid og måle en prosentandel av donor fluorescence i YFP kanal (B = YFP / CFP). Utelate denne korreksjon for unimolecular biosensorer er mulig, siden det vil bare påvirke den samlede amplitude av FRET respons uten kvalitative virkning på formen av kurven.
jove_title "> 6. Representant Resultater

Figur 1 viser et eksempel på et ferdig montert FRET avbildning oppsett bestående av et Nikon invertert mikroskop, CoolLED, DV2 DualView og Hamamatsu ORCA-03G CCD kamera. For å etablere kommunikasjon mellom maskinvarekomponenter og datamaskinen, er I / O-Arduino bord koblet til datamaskinen og til CoolLED som vist i figur 2. For å kontrollere lyskilde og ta bilder med kameraet på en synkronisert mote, har Micro-Manager programvare som skal installeres og riktig konfigurert (se figur 3). Dette freeware kan enkelt tilpasses den enkelte eksperimentelle behov ved å legge nødvendige plug-ins. Figur 4A viser et representativt rå FRET ratio spor fra en måling med cAMP sensor Epac1-camp 13 uttrykt i 293A celler til å overvåke effekten av β-agonist isoproterenol anvendes på tidspunkt 150 sek og & satsea,-blokker propranolol tilsatt ved tidspunkt 300 sek (utført som beskrevet i 4,3 til 4,10). Disse dataene kan analyseres offline og korrigert for bleedthrough av CFP i YFP kanal som beskrevet i 5.1 til 5.7 for å få korrigert FRET forholdet spor vist i figur 4B. Denne representant eksperimentet viser en langsom nedgang i overvåkes FRET forholdet ved isoproterenol behandling som indikerer en økning av intracellulær cAMP. Propranolol som β-blokker reverserer isoproterenol signal, som fører til en reduksjon av cAMP til basalnivåer. Disse endringene i FRET signal kan overvåkes elektronisk under alle eksperimenter (som beskrevet i 4.9). Slike eksperimenter kan utføres med en rekke vanlig brukte biosensorer designet til å overvåke forskjellige andre budbringere eller biokjemiske prosesser.

Figur 1
Figur 1. Oppbygning av FRET bildebehandling oppsett består av en CoolLED, ikonverteres Nikon mikroskop, DV2 DualView, og ORCA-03G CCD-kamera.

Figur 2
Figur 2. Arduino I / O-kortet og dets forbindelser. Styret er plassert i en selvbetjent montert plastboks. En standard BNC kabel forbinder LED til pinne 8 og GND (0) av styret.

Figur 3
Figur 3. Skjermbilder som viser integrasjon av komponentene bruker maskinvare veiviseren. A) Start Hardware konfigurasjonsveiviseren. B) Legg de nødvendige enhetene som nevnt i punkt 2.3. Klikk her for å se større figur .

Figur 4
Figur 4. En representant FRET experiment som måler cAMP-nivåer i 293A celler transfektert med Epac1-leirene. Først ble cellene stimulert med β-adrenerg agonist isoproterenol (100 nM, ved rammen 30 eller ved 150 sek) for å øke cAMP (observert som en nedgang i YFP / CFP FRET ratio). Celler ble deretter behandlet med den β-blokker propranolol (10 uM, på rammen 60 eller ved 300 sek) som fører til en økning på FRET ratio, som reflekterer en nedgang i cAMP. A) Rå online FRET ratio spor fra en region av interesse tilsvarende til en enkelt celle overvåkes under eksperimentet. B) Korrigert ratio spor etter offline data analyse utført som beskrevet i 5.1 til 5.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

i denne protokollen, viser vi hvordan du kan bygge en enkel rimelig, men kraftig FRET imaging system for rutinemessig bruk med en rekke tilgjengelige biosensorer. Systemet som presenteres her er utformet for CFP og YFP eller lignende typer fluorescerende proteiner, som giver-akseptor par. Imens andre individuelle biosensorer blir tilgjengelige som bruker for eksempel grønne og røde fluoriserende proteiner 14. Å tilpasse den beskrevne systemet for andre farger, bør egnede lyskilder og / eller filter sett velges. I tilfelle av LED, en annen enkelt LED linje, for eksempel 490 nm å eksitere grønt fluorescerende protein kan brukes. Single-bølgelengde LED kan være lett (i løpet av sekunder) demonteres og skiftes ut. Alternativt finnes det LED arrays tilgjengelig som inneholder flere linjer for å opphisse ulike fluorescerende proteiner (f.eks Pe-2 CoolLED). Slik aktiverer målinger med alternativ FRET par, kan andre fluorescerende filter kuber settes inn i microsc ope, og til slutt utslipp beam-splitter filtre bør skiftes ut. Fotometri tilbyr flere utslipp filter glidebryterne for DV2 DualView. Noen nylig utviklede applikasjoner bruker to eller flere biosensorer samtidig å overvåke flere prosesser på samme tid, for eksempel cAMP og cGMP sammen i en celle 15. I dette tilfellet, kan en QuadView (fotometriske) inneholdende fire utslipp kanaler benyttes, ImageJ plug-in for bilde splitting og analyse kan deretter tilpasses til bruk med fire kanaler og til å beregne to FRET forholdstall. ImageJ programvare er svært fleksibel i forhold til bildeanalyse og online fremstilling av resultatene. Enkel tekst-redigert plug-ins tillate tilpasning av programvare algoritme til behovene ethvert individ imaging system og eksperimentere. Dette er noen ganger veldig nyttig og gir raske løsninger på de tekniske problemene, som kan kreve lange tider når de må gjennomføres i noen kommersiell programvare pakke.

innhold "> Når du gjør FRET eksperimenter, er det avgjørende å unngå photobleaching som vises når eksitasjon ganger er for lang eller når bildene er tatt for ofte. I dette tilfellet kan et foton-indusert kjemisk skade eller kovalente modifikasjoner av fluorophores oppstå og minske FRET effektivitet. å unngå photobleaching, kan man redusere eksponeringstiden og hyppigheten av bildeinnlastingen. Det er også etablert protokoller 12,16 å korrigere for dette fenomenet. Under dataanalyse, er det mulig å korrigere for krysstale mellom giver-og akseptor-kanaler (bleedthrough). Ved bruk unimolecular FRET biosensorer (i hvilket tilfelle donor og akseptor fluoroforer er alltid uttrykt på samme nivå) for enkle Proporsjonal målinger, kan det være nok til å rette bare for bleedthrough av donor til akseptor kanal eller utelate denne korreksjonen helt fordi den ikke påvirker kvalitativt formen på FRET forholdet kurve. Den bleedthrough av the akseptor i donor-kanalen er vanligvis ubetydelig. Når bimolecular biosensorer består av to forskjellige proteiner blir brukt, kan disse uttrykkes på ulike nivåer. I dette tilfellet, bleedthrough korrigering og en ekstra korreksjon for direkte YFP magnetisering ved 440 nm lys er også tilrådelig. Vennligst se til publisert protokoll 12 der alle korreksjon prosedyrer er beskrevet i mer detalj. Ytterligere omfattende informasjon om utviklingen av biosensorer, FRET mikroskopi, mulige fallgruver på teknikk og om dataanalyse er tilgjengelig i tidligere publiserte protokoller 17-18. I konklusjon, gir enkel og kraftig imaging system beskrevet her en fleksibel plattform for å overvåke ulike biokjemiske hendelser og signalmolekyler med høy temporal og romlig oppløsning i levende celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Anke Rüttgeroth og Karina Zimmermann for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (tilskudd NI 1301/1-1 til VON) og University of Göttingen Medical Center ("pro futura" tilskudd til VON).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BES Buffer Grade AppliChem A1062
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C5010
Glass coverslides Thermo Scientific 004710781 Diameter 24 mm
Glass-bottomed cell-culture dishes World Precision Instruments FD3510-100
D-MEM medium Biochrom AG F0445
Fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30073.02
L-Glutamine Biochrom AG K0283
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P5405
MgCl2 hexahydrate AppliChem A4425
NaCl AppliChem A1149
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9707
Penicillin/Streptomycin Biochrom AG A2213
Inverted fluorescent microscope e.g. Nikon Request at Nikon
CoolLED CoolLED pE-100 440 nm
DualView Photometrics DV2-SYS
DualView filter slider Photometrics 05-EM
CFP/YFP filter set Chroma Technology 49052 without the emission filter
ORCA-03G camera Hamamatsu Photonics C8484-03G02
Arduino I/O board Sparkfun Electronics DEV-00666
Attofluor cell chamber Invitrogen A-7816
Personal computer with WindowsXP or Windows7 system Any supplier Include hard-drive with high capacity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
  2. Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
  3. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
  4. Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
  5. Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
  6. Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
  7. Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
  8. Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
  9. Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
  10. Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. 229-243 (2009).
  11. Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
  12. Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
  13. Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
  14. Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
  15. Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
  16. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
  17. Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
  18. Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
FRET Mikroskopi for sanntids overvåking av signalanlegg hendelser i levende celler Bruke Unimolecular biosensorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors. J. Vis. Exp. (66), e4081, doi:10.3791/4081 (2012).More

Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors. J. Vis. Exp. (66), e4081, doi:10.3791/4081 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter