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Biology

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

doi: 10.3791/4081 Published: August 20, 2012

Summary

Förster transferência de energia por ressonância (FRET) microscopia é uma técnica poderosa para monitoramento em tempo real de eventos de sinalização em células vivas usando biossensores diversos como repórteres. Aqui descrevemos como construir um epifluorescência personalizado FRET sistema de imagens a partir de componentes disponíveis comercialmente e como usá-lo para FRET experimentos.

Abstract

Förster transferência de energia por ressonância (FRET) microscopia continua a ganhar cada vez mais interesse como uma técnica de monitoramento em tempo real de eventos bioquímicos e sinalização em células vivas e tecidos. Comparado com métodos bioquímicos clássicos, esta nova tecnologia é caracterizada por resolução temporal e espacial. FRET usar vários experimentos geneticamente codificados biossensores que podem ser expressas e representado ao longo do tempo in situ ou in vivo 1-2. Biossensores típicos pode relatar interacções proteína-proteína, medindo FRET entre um par fluoróforo etiquetado de proteínas ou mudanças conformacionais em uma única proteína que abrigam dador e aceitador fluoróforos interligados com uma porção de ligação para uma molécula de interesse 3-4. Biossensores bimoleculares para interacções proteína-proteína incluem, por exemplo, constrói concebido para monitorizar a activação da proteína G em células de 5, enquanto que os sensores unimoleculares meaSuring alterações conformacionais são amplamente utilizados para mensageiros segunda imagem, tais como o cálcio 6, cAMP 7-8, 9 e fosfatos de inositol cGMP 10-11. Aqui descrevemos como construir um epifluorescência personalizado FRET sistema de imagem de simples componentes disponíveis comercialmente e como controlar toda a configuração utilizando o freeware Manager-Micro. Este instrumento simples, mas poderosa é projetado para medições de rotina ou mais sofisticados FRET em células vivas. Imagens obtidas são processadas utilizando auto-escrito plug-ins para visualizar mudanças em relação FRET em tempo real durante todas as experiências antes de ser armazenado em um formato de vídeo compatível com o build-in ImageJ de freeware utilizado para posterior análise de dados. Este sistema de baixo custo, é caracterizada por uma elevada flexibilidade e pode ser utilizado com sucesso para monitorar diversos eventos bioquímicos e moléculas de sinalização por uma pletora de biossensores FRET disponível em células vivas e tecidos. Como um exemplo, demonstramos how para usar este sistema de imagem para realizar monitorização em tempo real de cAMP em células 293-vivo por estimulação com um agonista do receptor β-adrenérgico e bloqueador.

Protocol

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1. Configurando um FRET Microscópio imagem

Em princípio, qualquer microscópio de fluorescência invertido, que se encontra disponível no laboratório e tem uma porta da câmara pode ser adaptado para a imagiologia FRET. A configuração final deve incluir os seguintes componentes essenciais: um microscópio, uma fonte de luz com ou sem obturador adicional, um divisor de feixe para a emissão de luz e uma câmara CCD-(ver Figura 1). Os dispositivos de hardware, em especial a fonte de luz, o obturador e a câmara são integrados e controlado pelo software de imagem que permite a aquisição e análise de imagens. Abaixo descreve-se um processo para a montagem de um sistema de FRET simples a partir de componentes comercialmente disponíveis.

  1. Conecte a sua fonte de luz para o microscópio. Por exemplo, usar um único comprimento de onda do diodo emissor de luz (CoolLED p E-100, 440 nm), que excita selectivamente melhorada proteína fluorescente ciano (PCP), usado como um doador mais em FRET biossensores. Ela pode ser diretaly e facilmente ligado à porta de iluminação do microscópio de epifluorescência. Existem também vários comprimentos de onda LEDs disponíveis que podem ser ligados de uma forma semelhante. Em vez de LED, outras fontes de luz convencionais, tais como XBO75 lâmpada de arco de xénon (muitas vezes usado para microscópios Olympus e Zeiss) ou mercúrio HBO lâmpada (normalmente instalada no microscópio Nikon) pode ser usado. No caso de uma lâmpada fluorescente, também deve colocar um obturador entre a lâmpada e da porta para activar o controlo de iluminação assistida por software da luz de excitação que são introduzidos a amostra. CoolLED não requer qualquer obturador adicional, uma vez que podem ser directamente ligados e desligados com o software. A desvantagem dos sistemas de um único diodo emissor de luz de cor é um número limitado de comprimentos de onda de excitação, enquanto que uma lâmpada fluorescente com vários conjuntos de filtros é uma opção mais flexível, especialmente quando se trabalha com biossensores múltiplas e bimolecular. Em alternativa, as fontes de luz (por exemplo, monocromador Polychrome V, TILLPhotonics) pode serutilizados, eles geralmente têm um obturador integrado, que pode ser controlado através de software, um sinal de disparo.
  2. Coloque um cubo de filtro apropriado no microscópio. Para rotina FRET medições com PCP e proteína fluorescente amarela melhorada (YFP) ou qualquer de suas variantes, como um par FRET, usamos um simples cubo filtro com um filtro de excitação ET436/30M (que pode ser omitido quando o LED é usado, mas é indispensável quando se utiliza uma lâmpada de xenon ou mercúrio, em vez de diodo emissor de luz) e um espelho dicróico DCLP455. O microscópio deve também estar equipado com uma objectiva de um microscópio adequado para boa resolução de fluorescência, por exemplo, com um plano-fluor, plano ou plano Neofluar-Apochromat-40x, 60x ou 100x objectiva de imersão em óleo.
  3. Ligar a luz fluorescente e verificar se o ponto de luz é distribuída uniformemente por todo o campo de visão. Se este não for o caso, o alinhamento adicional do diodo emissor de luz ou a lâmpada é necessária para se obter a iluminação óptima da amostra. Este desempenho pode sermed usando os parafusos que posicionam o diodo ou da luz no espaço.
  4. Conecte o divisor de feixe-através de uma montagem C, a uma das portas do microscópio de emissão. Por exemplo, usar o DualView DV2 (Fotometria), que divide a emissão de luz em duas (doador e receptor) canais que podem ser monitoradas simultaneamente em um único chip câmera CCD. Em alternativa, há outros produtos comparáveis, tais como Optosplit (Cairn Research) ou um divisor de feixe integrado no ORCA-D2 Hamamatsu câmara dupla de comprimento de onda. Para o PCP / YFP par FRET, usamos o 05-EM filtrar conjunto contendo os 505dcxr dicróicas espelho mais ET480/30M e filtros de emissão ET535/40M para PCP e YFP, respectivamente, o que é fornecido com o DV2. Em vez de um feixe de separador, dois cubos de filtro para o dador (que contém o filtro de excitação ET436/30M para PCP, o espelho dicróico e DCLP455 PCP filtro de emissão) e aceitadores (contendo PCP filtro de excitação, e o DCLP455 YFP filtro de emissão) canais são usados ​​emmuitos sistemas FRET. Como alternativa, um cubo de filtro sem qualquer filtro de emissão e um automático de emissão de posição da roda do filtro antes de a câmera pode ser instalada. Neste caso, um microscópio motorizado ou os substitutos da roda do filtro entre as duas posições de emissão de filtro dentro de ~ 200-300 ms para efectuar a imagiologia raciométrica. Este atraso menor é aceitável quando em vez de imagens retardar processos intracelulares, tais como os sinais de cAMP, em que a aquisição simultânea real de ambos os canais não é crítica.
  5. Ligue a câmera CCD (uso por exemplo ORCA-03G ou ORCA-R2 de Hamamatsu Photonics) para o divisor de feixe. Use um cabo FireWire para conectar a câmera ao computador interface IEEE1394, como descrito no manual fornecido com a câmera. Instalar drivers da câmera sem ligar a câmera.
  6. Finalmente, para estabelecer a comunicação entre o computador e a fonte de luz, ligar o Arduino placa I / O (por exemplo, usar Arduino Duemilanove ou Arduino Uno) para o diodo emissor de luz ou to o obturador por meio de um cabo BNC que deve possuir um tampão normal de BNC no lado do LED e dois fios individuais, sob a outra extremidade conectada ao GND pinos (0) e 8 do tabuleiro, como mostrado na Figura 2. O conselho reunido pode ser conectado diretamente a uma porta USB do seu computador.

2. Configurar o software de imagem

Para controlar e sincronizar a fonte de luz com captura da imagem pela câmera, o software de imagem deve ser instalado no computador. Existem vários pacotes de software comercialmente disponíveis, incluindo MetaFluor (Molecular Devices), Slidebook (Intelligent Imagem Inovações), VisiView (Sistemas Visitron). Aqui demonstramos o uso do open-source de freeware Manager-Micro, que oferece um alto grau de flexibilidade para baixo custo de imagem.

  1. Baixe este software em http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Micro-Manager_Version_Archive. Recomendamos instalar a versão 1.4.5, que é facilmente configurável em nossas mãos.
  2. Ligue a placa Arduino a uma porta USB do seu computador. Faça o download do software para controlar a placa Arduino de http://www.arduino.cc/en/Main/software . Siga as instruções encontradas neste site e executar este software apenas uma vez antes de iniciar Micro-Manager. Carregar um código para uso da placa com Micro-Manager software. O código pode ser baixado em http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Arduino .
  3. Ligar o LED e a câmara. Inicie o software e configurá-Manager Micro comunicação com a câmera e LED (outra fonte de luz e do obturador), selecione Ferramentas> Hardware Configuration Wizard (ver Figura 3). Adicione os componentes necessários, incluindo a sua câmara(Ou seja, Hamamatsu_ DCAM) e Arduino (adicionar Arduino-Switch, Arduino-Hub e Arduino obturador de dispositivos). Durante os próximos passos, usar as configurações padrão sugeridas pelo assistente. Salve a nova configuração do sistema, quando solicitado pelo assistente.
  4. Use o menu principal para abrir Ferramentas> Browser de Propriedades de dispositivos. Desça até "Estado Mudar Arduino" e selecione "1". Feche a caixa de diálogo. Certifique-se de que o "obturador automático" caixa está marcada na caixa de diálogo de software principal. Pressione Arquivo> Salvar o estado do sistema para salvar a configuração do software que deve ser aberto a qualquer momento depois de iniciar o software. Isto irá estabelecer a comunicação entre a placa eo software necessários para realizar a aquisição da imagem.
  5. Pressione o botão "Live" para monitorar o sinal que vem da câmera. Certifique-se de que a luz fluorescente vai em qualquer momento "Live" ou função "Snap" é selecionado. Antes de iniciar as primeiras medições, siga as instruções fornecidas com o divisor de feixe para porformar o alinhamento óptico de ambos os canais.

3. Cultura de Células e Transfecções

  1. Preparar as placas de 6 poços com autoclavados redondas 24 coverslides mm de vidro (1 coverslide por poço). Como alternativa, o vidro de fundo de células de cultura de pratos podem ser utilizados.
  2. Placa 293-células para as placas ou pratos em meio D-MEM suplementado com FCS (10%, 1% de L-glutamina e 1% de solução de penicilina / estreptomicina), de modo que as células atingem 50-70% de confluência ao fim de um dia.
  3. 24 horas após o plaqueamento, transfectar as células de um banco de fluxo laminar, com um sensor de FRET plasmídeo usando o método de transfecção com fosfato de cálcio (ver secção 3.5). plasmídeos biossensor campo pode ser obtido a partir de nosso grupo, mediante solicitação. O leitor também é referido as revisões abrangentes 7,8 descrevendo outros biossensores cAMP disponíveis.
  4. Antes de a transfecção de células, pela primeira vez, preparar reagentes de transfecção. Tornar-se um 2,5 M de CaCl2 e soluções 2xBBS (este último contendo1,5 mM de Na 2 HPO 4, 50 mM de BES, NaCl 280 mM, ajustado a pH 6,95 com NaOH) em água desionizada. Estéril filtrado a solução usando um filtro de 0,2 um regular.
  5. Para transfectar uma placa de 6 poços, ou 6 de vidro com fundo de pratos, misturar 10 ug de plasmídeo sensor de FRET, 50 ul de 2,5 M solução de CaCl 2 e água estéril até 500 ul. Misturar bem.
  6. Adicionar 500 ul de 2x BBS. Misturar bem e incubar a mistura durante 10 min à temperatura ambiente.
  7. Pipetar 165 da mistura de transfecção gota a gota para cada bem ou prato. Misture delicadamente a placa e colocá-lo de volta para a incubadora. As células são normalmente preparados para FRET medidas 24 horas após a transfecção. Certifique-se de que as células não tenham atingido a confluência, neste ponto, uma vez que podem influenciar a actividade de vários receptores de superfície celular.

4. FRET Medidas em células vivas

  1. Antes da medição, pela primeira vez, preparar o tampão de FRET contendo 144 mM de NaCl, 5,4 mM KCl, 1mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES em água desionizada e ajustar o pH para 7,3 com NaOH. Diluir os compostos a serem utilizados em experiências de processamento de imagens com o tampão de FRET.
  2. Inicie o software de imagem. Carregar a configuração do sistema anteriormente definido. Selecione Arquivo> Estado Sistema de Carga para escolher o estado do sistema previamente configurado.
  3. Montar uma coverslide com aderentes células transfectadas 293-na câmara de imagem (por exemplo, câmara de celular Attofluor). Lave as células uma vez com tampão de FRET e adicionar 400 ul de tampão de FRET. Quando se utiliza vidro de fundo de células de cultura de pratos lavar as células aderentes e adicionar 2 ml de tampão por prato. Realizamos todas as medições à temperatura ambiente no tampão de HEPES contendo FRET, de modo que nenhum controle 2 CO é necessário.
  4. Coloque um pouco de óleo de imersão sobre o objetivo e transferir imagens da câmara para o microscópio. Concentre-se na camada de células usando a luz transiluminação.
  5. Ligue o Lig fluorescenteht, premindo o botão "Live", e selecione uma célula para o experimento. Escolha uma célula com um sensor de expressão ideal, o que significa que não deve ser muito brilhante e não muito fraca. Depois de encontrar uma célula apropriada, desligue a luz fluorescente imediatamente para evitar fotodegradação do sensor FRET.
  6. Ajuste o tempo de exposição sob o título "As configurações da câmera" (geralmente 10-50 ms) de uma forma que leva a uma relação sinal-ruído bem da imagem adquirida depois de pressionar o botão "Snap". Vezes excitação muito tempo pode resultar em fotodegradação, enquanto muito curta resultado vezes em qualidade de imagem baixa.
  7. Pressione o botão "Multi-D Acq". botão e definir o número de pontos de tempo e do intervalo de tempo para a aquisição de imagem. Para o nosso sensor de cAMP-FRET, adquirimos uma imagem a cada 5 s.
  8. Iniciar as medições, pressionando o botão "Acquire".
  9. Durante qualquer medida, pode-se usar o policial "traste online" plug-in (disponível no suplemento Online, todos os plug-ins devem serIED na pasta "Plugins" do seu software Gerenciador de Micro-lo antes de iniciar) para monitorar FRET relação muda online. Executar este plug in e selecione uma região de interesse na imagem relação FRET usando o "seleções à mão livre" ferramenta. Adicionar a região para o gerente de ROI e pressione o botão "Get média" no botão "Time série analisador" janela. A FRET traço proporção será exibida. Para atualizar o rastreamento durante a medição, executar o "FRETratioOnline2" plug-in e pressione o botão "getAverage" botão.
  10. Assim que o FRET proporção atingiu uma linha de base estável, aplicar o composto desejado por pipetagem com precisão que no prato / câmara. Para o tratamento de células com compostos farmacológicos, um sistema de perfusão, em vez de uma pipetagem simples pode ser usada nesta fase.
  11. Depois de terminar o experimento, salvar a pilha de lapso de tempo de imagens. Remova a câmara de medição do microscópio e limpar o objectivo através de um tecido objectivo.
  12. Volte ao passo 4,3 para repetir a medição com umnova amostra.

5. Análise de dados offline

Dados de imagem FRET pode ser analisado desligada a qualquer momento após a experiência usando software ImageJ. Como complemento a este protocolo, nós fornecemos o plug-in "FREToffline" usado em nosso laboratório para dividir as imagens adquiridas em canais doador e receptor e para medir as intensidades fluorescentes em várias regiões de interesse. Estas intensidades podem ser ainda cópia colado em uma planilha do Excel ou origem para calcular a taxa de FRET corrigido. Para visualizar o FRET mudanças de biossensores unimoleculares, ratiometry simples é muitas vezes utilizado. Neste caso, apenas o fluoróforo dador (PCP) é excitada e duas imagens são tomadas em picos de emissão da PCP e YFP. O rácio calculado YFP / PCP (por vezes também referido como taxa de FRET / PCP) representa o grau de FRET entre os dois fluoróforos. Em biossensores unimoleculares, o número de porções de PCP e YFP são iguais, de modo que a simples ratiometry é suficiente para representar a FRET eficiência 12.

  1. Use um software ImageJ para abrir o arquivo, selecionando experiência Plugins> Micro-Manager File> Open Micro-Manager.
  2. Executar o plug-in "FREToffline" que divide a pilha de lapso de tempo em PCP individual e canais YFP.
  3. Se a correcção de fundo é necessária, esta pode ser realizada utilizando o software ImageJ.
  4. Clique na pilha YFP de imagens e selecione uma ou mais regiões de interesse usando o "seleções à mão livre" ferramenta e adicioná-los à "MultiMeasure" plug-in janela pressionando o botão "Add".
  5. Selecionar as regiões de interesse no "MultiMeasure" janela e pressione "Multi" para obter uma tabela com valores médios de cinza para cada quadro e cada região. Copiar os dados para o clipboard, selecionando todos usando Ctrl + A e pressionando Ctrl + C. Abra uma planilha Excel ou Origem e colar os dados pressionando Ctrl + V.
    As medições realizadas pelo programa podem ser configuradas em Analisar> Set M easurements onde você pode definir os parâmetros a serem medidos. Nós geralmente selecionar apenas "Valor médio cinza" neste diálogo.
  6. Clique na pilha PCP de imagens. Realizar o mesmo descrito em 5.5. Cole os dados de intensidade PCP no Excel ou planilha mesma origem.
  7. Usando o Excel ou software Origin, calcular a proporção corrigida FRET. Quando biossensores simples de cadeia única unimoleculares são espelhados, que corrige somente para a bleedthrough da fluorescência do dador para o aceitador de canal. Neste caso, a relação corrigida doador / receptor é:
    = Relação (YFP - B x PCP) / PCP
    Onde B é o factor de correcção que pode ser determinado através da transfecção de células com o plasmídeo PCP e medindo a percentagem da fluorescência do dador no canal YFP (B = YFP / PCP). Omitindo este correcção para biossensores unimoleculares é possível, uma vez que afecta apenas a amplitude global da resposta de FRET, sem qualquer efeito qualitativo sobre a forma da curva.
jove_title "> 6. Resultados representativos

A Figura 1 mostra um exemplo de um. Totalmente montado FRET configuração de imagens constituído por um microscópio Nikon invertido, CoolLED, DV2 DualView eo Hamamatsu ORCA-03G câmara CCD Para estabelecer a comunicação entre os componentes de hardware e do computador, o I / O Arduino placa está ligada ao computador e ao CoolLED como mostrado na Figura 2. Para controlar a fonte de luz e de captura de imagem pela câmera de forma sincronizada, Micro-Manager software tem de ser instalado e configurado corretamente (ver Figura 3). Este freeware pode ser facilmente adaptado às necessidades individuais experimentais, adicionando plug-ins necessários. Figura 4A mostra uma matéria-prima representativa FRET traço proporção de uma medição usando o sensor de cAMP Epac1-campos 13 expressa em células 293-para monitorar os efeitos de β-adrenérgico isoproterenol aplicados no período de ponto de 150 segundos eo & apostarum; bloqueador propranolol adicionado no ponto de tempo 300 seg (realizada como descrito no 4,3-4,10). Estes dados podem ser analisados ​​off-line, e corrigida para a bleedthrough de PCP no canal YFP como descrito em 5,1-5,7 para obter a. FRET traço corrigido relação mostrada na Figura 4B Este experimento representativo mostra um decréscimo lento na razão FRET monitorizada por meio de tratamento com isoproterenol o que indica um aumento de cAMP intracelular. Propranolol como um β-bloqueador inverte o sinal de isoproterenol, conduzindo a uma diminuição do cAMP a níveis basais. Estas alterações no sinal de FRET pode ser monitorizado em linha durante os ensaios (como descrito em 4.9). Tais experiências podem ser realizadas com uma grande variedade de bio-sensores usados ​​para monitorizar os diferentes segundos mensageiros ou processos bioquímicos.

Figura 1
Figura 1. Esquema da FRET configuração de imagem composto por uma CoolLED, emmicroscópio Nikon convertida, DV2 DualView, e ORCA-03G câmera CCD.

Figura 2
Figura 2. Arduino placa I / O e suas conexões. A placa é colocada numa caixa de plástico auto-montadas. Um cabo BNC padrão liga o LED para os 8 pinos e GND (0) do conselho.

Figura 3
Figura 3. Imagens que demonstram a integração dos componentes do sistema usando o Assistente de configuração de hardware. Uma) Inicie o Assistente de Configuração de Hardware. B) Adicionar os dispositivos necessários, como mencionado em 2.3. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 4
4 figura. Um representante FRET experimentalt, que mede os níveis de cAMP em células transfectadas com 293-Epac1-campos. Primeiro, as células foram estimuladas com o isoproterenol agonista β-adrenérgico (100 nM, no quadro 30 ou a 150 sec) para aumentar o AMPc (observada como uma diminuição na YFP / PCP FRET ratio). As células foram subsequentemente tratadas com o β-bloqueador propranolol (10 uM, no quadro 60 ou a 300 sec), que leva a um aumento do rácio de FRET, reflectindo uma diminuição na AMPc. Em linha) Raw FRET traço proporção de uma região de interesse correspondente para uma única célula monitorizados durante a experiência. B) rectificado traço proporção após a análise de dados offline realizada como descrito no 5,1-5,7.

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Discussion

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neste protocolo, que demonstram como criar um sistema de imagens simples, de baixo custo, mas poderosa FRET para aplicações de rotina com uma variedade de biossensores disponíveis. O sistema aqui apresentado é projetado para PCP e YFP, ou tipos similares de proteínas fluorescentes, como o par dador-aceitador. Ao mesmo tempo, outros biossensores individuais tornam-se disponíveis que utilizam, por exemplo, de verde e vermelho proteínas fluorescentes 14. Para adaptar o sistema descrito para outras cores, fontes de luz adequadas e / ou conjuntos de filtros deve ser selecionado. No caso do LED, uma outra linha único diodo emissor de luz, por exemplo 490 nm para excitar a proteína fluorescente verde pode ser usado. Único comprimento de onda LEDs podem ser facilmente (em segundos) desmontou e trocados. Como alternativa, existem matrizes de LED disponíveis que contêm várias linhas para excitar diversas proteínas fluorescentes (por exemplo, PE-2 CoolLED). Para permitir medições em alternativa FRET pares, outros fluorescentes cubos de filtro pode ser colocado no Microsc ope, e, eventualmente, a emissão do feixe-divisor filtros devem ser trocados. Fotometria oferece barras de emissões adicionais de filtro para DV2 DualView. Algumas aplicações recentemente desenvolvidos utilizam dois ou mais biossensores para monitorizar simultaneamente vários processos, ao mesmo tempo, por exemplo, cAMP e cGMP em conjunto numa célula 15. Neste caso, um QuadView (Photometrics) que contém quatro canais de emissão podem ser utilizadas, o ImageJ plug-in para a separação e análise de imagem pode então ser adaptada para ser utilizada com quatro canais e calcular dois rácios de FRET. ImageJ software é muito flexível em termos de análise de imagem e representação online dos resultados. Simples texto editado plug-ins permitem a adaptação do algoritmo de software para as necessidades de qualquer sistema de imagem individual e experiência. Isso às vezes é muito útil e oferece soluções rápidas para os problemas técnicos, que podem exigir longos períodos quando têm de ser implementadas em qualquer pacote de software comercial.

conteúdo "> Ao fazer FRET experiências, é fundamental para evitar a fotodegradação que aparece quando os tempos de excitação são muito longos ou quando as imagens são tomadas com muita freqüência. Neste caso, a danos químicos fóton induzida ou modificações covalentes de fluoróforos podem ocorrer e FRET diminuir a eficiência. Para evitar fotodegradação, é possível reduzir o tempo de exposição e a frequência de aquisição de imagem. Existem também estabeleceu protocolos 12,16 para corrigir este fenómeno. Durante a análise dos dados, é possível corrigir para a conversa cruzada entre dador e aceitador de canais (bleedthrough). Ao utilizar unimolecular biossensores FRET (caso em que dador e aceitador de fluoróforos são sempre expressos no mesmo nível) para as medições de medida proporcional simples, pode ser suficiente para corrigir apenas para o bleedthrough do dador para o aceitador canal ou mesmo omitir esta correcção por completo porque não qualitativamente afectar a forma da curva da taxa de FRET. O bleedthrough de thaceitador e dador para o canal é normalmente insignificante. Quando biossensores bimoleculares constituídas por duas proteínas diferentes são utilizados, estes podem ser expressos em vários níveis. Neste caso, a correcção bleedthrough e uma correcção adicional para a excitação YFP directo com a luz de 440 nm são também aconselhável. Por favor, referir ao protocolo publicado a 12 em que todos os procedimentos de correcção são descritos em mais detalhe. Informações abrangentes adicionais sobre o desenvolvimento de biossensores, FRET microscopia, possíveis armadilhas da técnica e sobre a análise de dados estão disponíveis em protocolos publicado anteriormente 17-18. Em conclusão, o sistema de imagens simples e poderosa descrito aqui fornece uma plataforma flexível para monitorar diversos eventos bioquímicos e moléculas de sinalização, com resolução temporal e espacial de alta em células vivas.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Anke Rüttgeroth e Karina Zimmermann para assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (concessão NI 1301/1-1 a VON) e Universidade de Göttingen Medical Center ("pro futura" subvenção para VON).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BES Buffer Grade AppliChem A1062
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C5010
Glass coverslides Thermo Scientific 004710781 Diameter 24 mm
Glass-bottomed cell-culture dishes World Precision Instruments FD3510-100
D-MEM medium Biochrom AG F0445
Fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30073.02
L-Glutamine Biochrom AG K0283
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P5405
MgCl2 hexahydrate AppliChem A4425
NaCl AppliChem A1149
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9707
Penicillin/Streptomycin Biochrom AG A2213
Inverted fluorescent microscope e.g. Nikon Request at Nikon
CoolLED CoolLED pE-100 440 nm
DualView Photometrics DV2-SYS
DualView filter slider Photometrics 05-EM
CFP/YFP filter set Chroma Technology 49052 without the emission filter
ORCA-03G camera Hamamatsu Photonics C8484-03G02
Arduino I/O board Sparkfun Electronics DEV-00666
Attofluor cell chamber Invitrogen A-7816
Personal computer with WindowsXP or Windows7 system Any supplier Include hard-drive with high capacity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular
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Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors. J. Vis. Exp. (66), e4081, doi:10.3791/4081 (2012).More

Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors. J. Vis. Exp. (66), e4081, doi:10.3791/4081 (2012).

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