Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

FRET микроскопии для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках Использование Мономолекулярные Биосенсоры

doi: 10.3791/4081 Published: August 20, 2012

Summary

Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) микроскопия является мощным средством для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках с помощью различных биосенсоров, как журналисты. Здесь мы опишем, как создать индивидуальный эпифлуоресцентной FRET системы формирования изображения из коммерчески доступных компонентов и как использовать его для FRET экспериментов.

Abstract

Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) микроскопии продолжает набирать все больший интерес как метод для мониторинга в реальном времени биохимических и сигнальных событий в живых клетках и тканях. По сравнению с классическими биохимическими методами, эта новая технология характеризуется высоким временным и пространственным разрешением. FRET экспериментах используют различные генетически закодированный биосенсоры, которые могут быть выражены и отображаемого с течением времени на месте или в естественных условиях 1-2. Типичные биосенсоров может либо сообщить белок-белковых взаимодействий путем измерения FRET между флуорофором с метками пары белков или конформационных изменений в единый белок, который питает донора и акцептора флуорофоров взаимосвязаны с обязательным фрагментом для молекулы интереса 3-4. Бимолекулярные биосенсоры для белок-белковых взаимодействий относятся, например, строит, предназначенная для контроля G-белок активации в клетках 5, в то время как мономолекулярный датчики измеренияSuring конформационные изменения, которые широко используются для изображения вторичные мессенджеры, такие как кальций 6, цАМФ 7-8, инозитфосфатов 9 и цГМФ 10-11. Здесь мы опишем, как создать индивидуальный эпифлуоресцентной FRET система визуализации от одного коммерчески доступных компонентов и, как контролировать все настройки с помощью Micro-менеджер бесплатно. Этот простой, но мощный инструмент предназначен для регулярного или более сложные FRET измерений в живых клетках. Полученные изображения обрабатываются с помощью самостоятельной письменной плагинов для визуализации изменений в соотношении FRET в режиме реального времени во время любых экспериментов перед сохранением в графическом формате совместимым с встроенным в ImageJ бесплатной использованы для последующего анализа данных. Эта недорогая система характеризуется высокой гибкостью и могут быть успешно использованы для мониторинга различных биохимических событий и сигнальные молекулы множество доступных FRET биосенсоров в живых клетках и тканях. В качестве примера мы покажем, чвл использовать это изображение системы для выполнения мониторинга в реальном времени цАМФ в клетках живых 293А при стимуляции β-адренорецепторов агонистов рецепторов и блокатора.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Настройка FRET визуализации микроскопа

В принципе, любой инвертированный микроскоп флуоресценции, которая доступна в лаборатории и имеет порт камеры могут быть адаптированы для FRET изображений. Окончательная настройка должна включать следующие важные компоненты: микроскоп, источник света с или без дополнительного затвора, светоделитель для излучения света и CCD-камеры (см. Рисунок 1). Устройств, особенно источник света, затвор и камера интегрирована в и под контролем визуализации программного обеспечения, которое позволяет получать и анализа изображений. Ниже мы опишем процедуру, чтобы собрать простое FRET системы из коммерчески доступных компонентов.

  1. Подключите источник света в микроскоп. Например, использование одной длине волны светоизлучающих диодов (охлаждается р E-100, 440 нм), которые селективно возбуждает расширенной голубой флуоресцентный белок (CFP), используемый в качестве донора в большинстве FRET биосенсоров. Это может быть прямойют и легко подключается к порту эпифлуоресцентной освещения микроскопа. Есть также несколько длин волн светодиодов доступны, которые могут быть связаны таким же образом. Вместо того, светодиоды, другие стандартные источники света, такие как XBO75 ксеноновой дуговой лампы (часто используется для Olympus и микроскопы Zeiss) или HBO ртутной лампы (обычно устанавливается на микроскоп Nikon) могут быть использованы. В случае люминесцентные лампы, вы также должны разместить затвора между лампой и подсветка порта для включения программного обеспечения при содействии управления возбуждением света, идущего на ваш образца. Охлаждается не требует никакого дополнительного затвора, так как он может быть непосредственно включается и выключается с помощью программного обеспечения. Недостатком одноцветных светодиодных систем является ограниченное число длин волн возбуждения, в то время как люминесцентные лампы с различными наборами фильтров является более гибким вариантом, особенно при работе с несколькими бимолекулярной и биосенсоров. Кроме того, монохроматор источников света (например, Polychrome V, TILLPhotonics) может бытьиспользованы, они обычно имеют встроенный затвор, который может быть программно управлять с помощью сигнала запуска.
  2. Поместите соответствующий фильтр куба в микроскоп. Для обычных измерений FRET с CFP и более желтый флуоресцентный белок (YFP) или их варианты, как FRET пара, мы используем простой фильтр куб, содержащий ET436/30M фильтр возбуждения (которое может быть опущен, если светодиод используется, но необходимы При использовании ксеноновой или ртутной лампы, а не светодиодная) и DCLP455 дихроичным зеркалом. Микроскоп также должны быть оснащены цели пригодны для хорошего разрешения флуоресцентной микроскопии, например, с планом-фтор, план-neofluar или план-апохромат 40x, 60x или 100x нефти погружения цели.
  3. Включите флуоресцентный свет и проверьте светового пятна равномерно распределены по всему полю зрения. Если это не так, дополнительное выравнивание светодиод или лампа, необходимых для достижения оптимального освещения образца. Это может быть PerforМед с помощью винтов, которые позиционировать диод или лампа в пространстве.
  4. Подключите светоделитель через C-креплением к одной из выбросов микроскопа портов. Например, можно использовать DV2 DualView (Фотометрия), которое распадается излучения света на два (доноров и акцепторов) каналов, которые могут быть одновременно контролировать на одной микросхеме ПЗС-камеры. Кроме того, есть и другие подобные продукты, такие как Optosplit (Cairn исследований) или светоделителем интегрированы в Hamamatsu ORCA-D2 на двух длинах волн камере. Для CFP / YFP FRET пар, мы используем 05-EM набор фильтров, содержащих 505dcxr зеркальные плюс ET480/30M и ET535/40M выбросов фильтрами для CFP и YFP, соответственно, который поставляется вместе с DV2. Вместо того, чтобы светоделитель, два фильтра кубы для донора (содержащие ET436/30M фильтр возбуждения CFP, DCLP455 дихроичным зеркалом и CFP выбросов фильтр) и акцептора (содержащие CFP фильтра возбуждения, DCLP455 и YFP выбросов фильтр) каналы используются вмногие FRET систем. Кроме того, один фильтр куба без фильтра выбросы и выбросы автоматического фильтра позиции колеса перед камерой могут быть установлены. В этом случае моторизованного микроскопа или фильтр заместители колеса между двумя фильтр твердых позициях в пределах ~ 200-300 мс для выполнения радиометрические изображения. Это небольшая задержка является приемлемым, когда изображение довольно медленно внутриклеточных процессов, таких как сигналы цАМФ, где действительно одновременное получение обоих каналов не является критическим.
  5. Подключите камеру CCD (например, использование ORCA-03G или ORCA-R2 от Hamamatsu Photonics) на светоделитель. С помощью FireWire-кабель для подключения камеры к компьютеру интерфейс IEEE1394, как описано в руководстве, поставляемом с камерой. Установка драйверов камеры без включения камеры.
  6. И, наконец, установить связь между компьютером и источником света, подключить Arduino платы ввода / вывода (использовать, например, Arduino Duemilanove или Arduino Uno) на светодиод или тO затвора с помощью BNC кабеля, который должен содержать нормальное BNC разъем на светодиодные стороны и два отдельных проводов на другом конце соединяются в контакты GND (0) и 8 плату, как показано на рисунке 2. Собранная плата может быть напрямую подключен к USB-порту вашего компьютера.

2. Настройка изображений программное обеспечение

Для управления и синхронизации источника света с захвата изображения с камеры, изображения программное обеспечение должно быть установлено на компьютере. Есть несколько коммерчески доступных программных пакетов, включая MetaFluor (Molecular Devices), Slidebook (Intelligent изображений инновации), VisiView (Visitron Systems). Здесь мы демонстрируем использование с открытым исходным кодом Micro-менеджер бесплатной которая предлагает высокую степень гибкости при низкой стоимости обработки изображений.

  1. Скачать эту программу на http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / индекс.PHP / Micro-Manager_Version_Archive. Мы рекомендуем устанавливать 1.4.5 релиз, который легко настраивается в наших руках.
  2. Подключите плату Arduino к порту USB вашего компьютера. Скачать программное обеспечение для управления Arduino плата от http://www.arduino.cc/en/Main/software . Следуйте инструкциям найти на этом сайте и запустить эту программу только один раз перед началом Micro-Manager. Загрузить код для использования платы с Micro-менеджер программного обеспечения. Этот код может быть загружен в http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Arduino .
  3. Включите светодиод и камера. Запустить программу и настроить Micro-менеджер общения с камерой и LED (другой источник света и затвор), выбрав Инструменты> Оборудование Configuration Wizard (см. Рисунок 3). Добавить необходимые компоненты, включая камеры(Т.е. Hamamatsu_ DCAM) и Arduino совет (добавить Arduino-Switch, Arduino-Hub и Arduino-Shutter устройств). Во время следующего шага, использовать настройки по умолчанию предложенные мастером. Сохраните новую конфигурацию системы в ответ на запрос мастера.
  4. Используйте в главном меню, чтобы открыть Tools> Device Property Browser. Прокрутите вниз до "Arduino коммутатор государства" и выберите "1". Закройте диалоговое окно. Убедитесь, что "авто-затвор" окно галочкой в ​​главном окне программы. Нажмите Файл> Сохранить состояния системы, чтобы сохранить конфигурацию программного обеспечения, которая должна быть открыт в любое время после запуска программного обеспечения. Это позволит установить связь между платой и программное обеспечение, необходимое для выполнения захвата изображений.
  5. Нажмите кнопку "Онлайн" для мониторинга сигнала, поступающего с камеры. Убедитесь, что флуоресцентный свет идет на любое время "Онлайн" или "Snap" функция выбрана. Перед началом первого измерения, следуйте инструкции, прилагаемой к светоделитель в вформируют оптическое выравнивание обоих каналов.

3. Культура клеток и Трансфекции

  1. Подготовка 6-луночные планшеты с автоклавного круглые 24 мм стекло coverslides (1 coverslide на лунку). Кроме того, со стеклянным дном клеточных культур блюда могут быть использованы.
  2. Плита 293А клеток на пластинах или блюда в D-MEM среде (с добавлением 10% FCS, 1% L-глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина раствора), так что клетки достигают 50-70% слияния после того, как один день.
  3. 24 часа в сутки после посева, трансфекции клеток в лавке ламинарного потока с датчиком FRET плазмиды помощью трансфекции фосфата кальция метода (см. 3.5). Плазмиды цАМФ биосенсора может быть получена из нашей группы по запросу. Читатель также называют всеобъемлющих обзоров 7,8 описанием других доступных биосенсоров цАМФ.
  4. Перед трансфекции клеток в первый раз, готовят реагентов трансфекции. Составьте 2,5 М CaCl 2 и 2xBBS решений (последний содержащие1,5 мМ Na 2 HPO 4, 50 мМ BES, 280 мм NaCl, отрегулировать рН до 6,95 с NaOH) в деионизированной воде. Стерильный фильтрат решений с использованием регулярных фильтр 0,2 мкм.
  5. Для трансфекции 6-луночный планшет или 6 стеклянным дном посуды, смешайте 10 мкг FRET датчик плазмиды, 50 мкл 2,5 М CaCl 2 решения и стерильной водой до 500 мкл. Все хорошо перемешать.
  6. Добавить 500 мкл 2x BBS. Все хорошо перемешать и инкубировать смеси в течение 10 мин при комнатной температуре.
  7. Внесите 165 мкл трансфекции смесь по каплям на каждой лунке или на блюдо. Аккуратно перемешайте пластины и положил его обратно в инкубатор. Клетки, как правило, готовы к FRET измерения через 24 часа после трансфекции. Убедитесь в том, что клетки не достигли слияния в этот момент, так как это может влиять на активность нескольких рецепторами клеточной поверхности.

4. FRET Измерения в живых клетках

  1. Перед измерением в первый раз, готовят FRET буфера, содержащего 144 мм NaCl, 5,4 мМ KCl, 1мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 10 мМ HEPES в деионизированной воде и доводят рН до 7,3 с помощью NaOH. Развести соединения, которые будут использоваться в экспериментах изображений с FRET буфера.
  2. Начало обработки изображений. Загрузите ранее определенные конфигурации системы. Выберите File> Load System State выбрать предварительно сконфигурированные системы государства.
  3. Установите coverslide с сторонник трансфицированных 293А клеток в камере изображений (например, Attofluor ячейки камеры). Вымойте клетки один раз FRET буфера и добавить 400 мкл буфера FRET. При использовании стеклянным дном клеточных культур блюда мыть прилипшие клетки и добавить 2 мл буфера на блюдо. Мы выполняем все измерения при комнатной температуре в ладу буфера, содержащего HEPES, так что не CO 2 контроля необходимо.
  4. Положите несколько иммерсионного масла на объективные и передачи изображения камеры на микроскоп. Фокус на ячейку слоя с помощью просвечивания светом.
  5. Включите флуоресцентные маякHT, нажав кнопку "Live" кнопку, и выбрать ячейку для эксперимента. Выберите ячейку с оптимальной экспрессии датчик, это означает, что оно должно быть не слишком ярким и не слишком тусклым. После нахождения соответствующей ячейке, выключите флуоресцентный свет немедленно, чтобы избежать фотообесцвечивания FRET датчика.
  6. Отрегулируйте время экспозиции в рамках "Настройки камеры" (обычно 10-50 мс) таким образом, что приводит к хорошему сигнал-шум полученного изображения после нажатия кнопки "Snap" кнопку. Слишком долгое время возбуждения может привести к фотообесцвечивания, а слишком короткое время в результате низкого качества изображения.
  7. Нажмите кнопку «Multi-D Acq". кнопку и установить количество моментов времени и интервала времени для получения изображений. Для наших цАМФ-FRET датчик, мы приобретаем одно изображение каждые 5 секунд.
  8. Начало измерений, нажав кнопку "Получить" кнопку.
  9. Во время любого измерения, можно использовать "FRET онлайн" плагинов (доступны в онлайн-дополнение, все плагины должны быть полицейскимСВУ в "Плагины" папку Micro-менеджер программного обеспечения перед его началом) для мониторинга FRET соотношение меняется в Интернете. Запустите плагин и выбрать интересующую область в FRET соотношение изображения с помощью "Freehand выборы" инструмент. Добавить в регионе менеджера ROI и нажмите кнопку "Получить среднее" кнопку в программе "Время анализатор серии" окна. FRET отношение след будет отображаться. Чтобы обновить следа во время измерений, запустите "FRETratioOnline2" плагин и нажмите кнопку "GetAverage" кнопку.
  10. Как только FRET соотношение достигло стабильного базового применять нужное соединение, точно пипеткой его в блюдо / камеру. Для лечения клетки фармакологических соединений, перфузионной системы вместо простого пипетирования могут быть использованы на данном этапе.
  11. После окончания эксперимента, сохранить покадровой стопку фотографий. Удалить измерительную камеру с микроскопом и очистить целью использования объективной ткани.
  12. Вернитесь к шагу 4,3 до повторите измерение снового образца.

5. Offline анализа данных

FRET данные изображения могут быть проанализированы форума в любое время после эксперимента с использованием ImageJ программного обеспечения. В дополнение к этому протоколу, мы предоставляем "FREToffline" подключаемый модуль используется в нашей лаборатории разделить полученные изображения в донора и акцептора каналов и для измерения интенсивности флуоресцентного в нескольких регионах, представляющих интерес. Эти интенсивности может быть дополнительно копирования и вставки в таблицу Excel или происхождения для расчета исправленной FRET отношение. Для визуализации изменений FRET мономолекулярных биосенсоры, простые ratiometry часто используется. В этом случае, только донор флуорофора (CFP) возбуждается, а два изображения, принятые на пики CFP и YFP выбросов. Расчетная YFP / CFP отношения (иногда также называют FRET / CFP отношение) представляет степень FRET между двумя флуорофоров. В мономолекулярной биосенсоров, число CFP и YFP остатки равны, так что простой ratiometry достадостаточна для представления FRET эффективности 12.

  1. Используйте ImageJ программного обеспечения, чтобы открыть эксперимент файл, выбрав плагины> Micro-Manager> Open Micro-File Manager.
  2. Запустите "FREToffline" плагин, который расщепляет покадровой стека в отдельных CFP и YFP каналов.
  3. Если фоне коррекции не требуется, это может быть выполнено с использованием ImageJ программного обеспечения.
  4. Нажмите на YFP стопку фотографий и выберите один или несколько регионов интереса с помощью "Freehand выборы" инструмент и добавьте их в "MultiMeasure" в окне плагина, нажав на кнопку "Добавить".
  5. Выберите регионы интересы в "MultiMeasure" окно и нажмите "Multi", чтобы получить таблицу со средним серым значения для каждого кадра и каждого региона. Скопируйте данные в буфер обмена, выбрав все с помощью Ctrl + A и нажав Ctrl + C. Откройте Excel или происхождения таблицу и вставить данные, нажав Ctrl + V.
    Измерения, проведенные в рамках программы могут быть настроены в соответствии Анализ> Set M easurements, где Вы можете определить параметры должны быть измерены. Мы обычно выбрать только "Среднее значение серого" в этом диалоге.
  6. Нажмите на CFP стопку фотографий. Выполните такой же, как описано в 5.5. Вставить CFP данных интенсивности в тот же Excel или происхождения таблицы.
  7. Использование Excel или происхождение программного обеспечения, рассчитать исправлены FRET отношение. Когда простые одноцепочечные биосенсоров мономолекулярной загружаются, мы исправляем только для bleedthrough из флуоресценции донора в акцептора канала. В этом случае, исправлены акцептором / донора соотношение:
    Ratio = (YFP - B х CFP) / CFP
    Где B является поправочный коэффициент, который может быть определен путем трансфекции клеток с CFP плазмиды и измерения в процентах от флуоресценции донора в YFP канала (B = YFP / CFP). Опуская эту поправку для мономолекулярной биосенсоров можно, так как это влияет только на общую амплитуду FRET ответ без каких-либо качественных влияние на форму кривой.
jove_title "> 6. Результаты представитель

На рисунке 1 показан пример полностью собранный FRET изображений установки, состоящей из инвертированный микроскоп Nikon, охлаждается, DV2 DualView и Hamamatsu ORCA-03G CCD камера. Для установления связи между аппаратными компонентами и компьютер, I / O Arduino доска подключена к компьютеру и охлаждается, как показано на рисунке 2. Для управления источником света и захвата изображения с камеры в синхронном моды, Micro-менеджер программного обеспечения должен быть установлен и правильно настроен (см. Рисунок 3). Эта бесплатная программа может быть легко адаптированы к индивидуальным потребностям экспериментальных путем добавления необходимых плагинов. Рисунке 4а показаны представитель сырья FRET отношение след от измерений с помощью датчиков цАМФ Epac1 лагерей 13 выражены в клетках 293А для мониторинга эффектов β-адренергических агонистов изопротеренол применяется в момент времени 150 сек и и ставки;-блокатор пропранолол добавлены в момент времени 300 сек (как описано в 4.3-4.10). Эти данные могут быть проанализированы и исправлены форума для bleedthrough из CFP в канал YFP, как описано в 5.1-5.7 получить исправленную FRET отношение след показано на рисунке 4В. Этот представитель эксперимент показывает медленное снижение мониторинг соотношения FRET на изопротеренол лечения, который указывает на увеличение внутриклеточного цАМФ. Пропранолол, как β-блокаторы меняет изопротеренол сигнала, что приводит к снижению лагерь базального уровня. Эти изменения в FRET сигнала может контролироваться онлайн в любое эксперименты (как описано в 4,9). Такие эксперименты могут быть выполнены с различных часто используемых биосенсоров, предназначенных для мониторинга различных вторичных мессенджеров или биохимических процессов.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема FRET изображений установки состоит из охлаждается, впреобразуется микроскоп Nikon, DV2 DualView, и ORCA-03G CCD камера.

Рисунок 2
Рисунок 2. Arduino платы ввода / вывода и его соединений. На плате расположено в себя монтаж пластиковой коробке. Стандартный кабель BNC соединяет светодиодные к контактам 8 и GND (0) совета.

Рисунок 3
Рисунок 3. Скриншоты демонстрируют интеграцию компонентов системы с помощью мастера конфигурации оборудования.) Запустите мастер конфигурации оборудования. B) добавить нужные устройства, как указано в п. 2.3. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 4
Рисунок 4. Представитель FRET экспериментальныхт, который измеряет уровни цАМФ в клетках 293А трансфицировали Epac1-лагеря. Во-первых, клетки стимулировали β-адренергических агонистов изопротеренол (100 нМ, в кадре 30 или на 150 сек) для увеличения цАМФ (наблюдается как снижение YFP ​​/ CFP FRET отношение). Клетки затем обрабатывали β-блокатор пропранолол (10 мкМ, в кадре 60 или на 300 сек), что приводит к увеличению FRET соотношении, отражающем снижение в лагере.) Raw онлайн FRET отношение след от одной области интересов соответствующего на одну ячейку контролируются во время эксперимента. B) Исправлено отношение след после форума анализа данных, как описано в 5.1-5.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В этом протоколе, мы покажем, как построить простой недорогой, но мощный FRET системы визуализации для обычных приложений с различных доступных биосенсоров. Система, представленная здесь, предназначена для CFP и YFP или аналогичных типов флуоресцентных белков, как донорно-акцепторных пар. Между тем, другие отдельные биосенсоры станут доступны, которые используют, например, зеленого и красного флуоресцентного белка 14. Для адаптации описанной системы для других цветов, подходящих источников света и / или наборы фильтров должны быть выбраны. В случае светодиоды, светодиодные одной другой линии, например, 490 нм для возбуждения зеленый флуоресцентный белок может быть использован. Single-волны светодиодов можно легко (в течение секунд) спешился и обмен. Кроме того, имеются светодиодные массивы доступны, которые содержат несколько строк, чтобы возбудить различные флуоресцентные белки (например, Пе-2 охлаждается). Для обеспечения измерений с альтернативными FRET пар, других флуоресцентных светофильтров могут быть помещены в microsc ОПЕ, и в итоге выбросы светоделитель фильтры должны быть заменены. Фотометрия предлагает дополнительную эмиссию фильтр ползунки для DV2 DualView. Некоторые недавно разработанных приложений используют два или более биосенсоров одновременно следить за несколькими процессами одновременно, например, цАМФ и цГМФ вместе в одной клетке 15. В этом случае, QuadView (Фотометрия), содержащий четыре канала излучение может быть использовано, ImageJ плагин для расщепления и анализа изображений может быть затем адаптирована для использования с четырьмя каналами и вычислить два FRET отношения. ImageJ программное обеспечение является очень гибким с точки зрения анализа изображений и интернет-представительство результаты. Простой текстовый раз редактировалось плагины позволяют адаптировать программное обеспечение алгоритма к потребностям каждого отдельного системы визуализации и эксперимента. Это иногда очень полезно и предлагает быстрые решения технических проблем, которые могут потребовать длительного времени, когда они должны быть реализованы в любом коммерческом пакете программного обеспечения.

Содержание "> При выполнении FRET экспериментов, крайне важно, чтобы избежать фотообесцвечивания, который появляется при возбуждении пояс слишком долго или когда изображения взяты слишком часто. При этом фотон-индуцированного повреждения химическими или ковалентных модификаций флуорофоров может произойти и уменьшение FRET эффективности. Чтобы избежать фотообесцвечивания, можно сократить время экспозиции и частоты получения изображений. Там также установлены протоколы 12,16 для коррекции этого явления. во время анализа данных, можно скорректировать перекрестные помехи между донора и акцептора каналов (bleedthrough). При использовании мономолекулярной FRET биосенсоров (в которой донор и акцептор случае флуорофоров всегда выражаются на том же уровне) для простых измерений логометрические, она может быть достаточно, чтобы исправить только для bleedthrough из донора в акцептора канала или даже опустить эту поправку в целом, поскольку она качественно не влияет на форму кривой соотношения FRET. bleedthrough йэлектронной акцептором в донора канала, как правило, незначительны. При бимолекулярной биосенсоров состоит из двух разных белков, то их может быть выражена на различных уровнях. В этом случае коррекция bleedthrough и дополнительной коррекции для прямого возбуждения YFP на 440 нм свет также целесообразным. Пожалуйста, обратитесь к опубликованному протоколу 12, где все коррекции процедуры описаны более подробно. Дополнительная исчерпывающую информацию о развитии биосенсоров, FRET микроскопии, возможны подводные камни техники и об анализе данных имеются в ранее опубликованных протоколах 17-18. В заключение, простая и мощная система визуализации описаны здесь предоставляет гибкую платформу для мониторинга различных биохимических событий и сигнальных молекул с высоким временным и пространственным разрешением в живых клетках.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Анке Rüttgeroth и Карина Zimmermann для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (грант NI 1301/1-1 фон) и Геттингенском университете Медицинского Центра ("за Futura" грант VON).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BES Buffer Grade AppliChem A1062
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C5010
Glass coverslides Thermo Scientific 004710781 Diameter 24 mm
Glass-bottomed cell-culture dishes World Precision Instruments FD3510-100
D-MEM medium Biochrom AG F0445
Fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30073.02
L-Glutamine Biochrom AG K0283
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P5405
MgCl2 hexahydrate AppliChem A4425
NaCl AppliChem A1149
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9707
Penicillin/Streptomycin Biochrom AG A2213
Inverted fluorescent microscope e.g. Nikon Request at Nikon
CoolLED CoolLED pE-100 440 nm
DualView Photometrics DV2-SYS
DualView filter slider Photometrics 05-EM
CFP/YFP filter set Chroma Technology 49052 without the emission filter
ORCA-03G camera Hamamatsu Photonics C8484-03G02
Arduino I/O board Sparkfun Electronics DEV-00666
Attofluor cell chamber Invitrogen A-7816
Personal computer with WindowsXP or Windows7 system Any supplier Include hard-drive with high capacity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
  2. Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
  3. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
  4. Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
  5. Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
  6. Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
  7. Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
  8. Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
  9. Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
  10. Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. 229-243 (2009).
  11. Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
  12. Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
  13. Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
  14. Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
  15. Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
  16. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
  17. Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
  18. Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
FRET микроскопии для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках Использование Мономолекулярные Биосенсоры
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors. J. Vis. Exp. (66), e4081, doi:10.3791/4081 (2012).More

Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors. J. Vis. Exp. (66), e4081, doi:10.3791/4081 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter