Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En protokol til identifikation af protein-protein interaktioner Udfra Published: September 24, 2012 doi: 10.3791/4083

Summary

Vi præsenterer en variation af QUICK (kvantitative Immunoprecipitation Kombineret med Knockdown) tilgang, der blev indført tidligere at skelne mellem sande og falske protein-protein interaktioner. Vores tilgang er baseret på

Abstract

Protein-protein interaktioner er afgørende for mange biologiske processer i cellen. Derfor bør deres karakterisering spiller en vigtig rolle i den aktuelle forskning og et væld af metoder til deres undersøgelse er tilgængelig 1. Protein-protein-interaktioner ofte er meget dynamisk og kan afhænge af subcellulær lokalisering, post-translationelle modifikationer og det lokale protein miljø 2. Derfor bør de blive undersøgt i deres naturlige miljø, hvor co-immunoudfældning metoder er den foretrukne metode 3. Co-udfældede interaktion partnere identificeres enten ved immunoblotting med en målrettet fremgangsmåde, eller ved massespektrometri (LC-MS/MS) i en ikke-målrettede måde. Sidstnævnte strategi ofte er negativt påvirket af et stort antal falske positive opdagelser, primært stammer fra den høje følsomhed af moderne massespektrometre, der trygt afsløre spor af uspecifikt fældningsreagenset proteiner. En recent metode til at overvinde dette problem er baseret på idéen om, at nedsatte mængder af specifikke interaktion partnere vil co-bundfald med et givet målprotein, hvis cellulære koncentration reduceres med RNAi, mens mængderne af uspecifikt udfældende proteiner bør være uberørt. Denne fremgangsmåde, der betegnes QUICK til kvantitativ Immunoprecipitation Kombineret med Knockdown 4, beskæftiger Stabil isotopmærkning af aminosyrer i cellekultur (SILAC) 5 og MS at kvantificere mængderne af proteiner immunpræcipiteret fra vildtype-og knock-down stammer. Proteiner fundet i et 1:1-forhold kan betragtes som kontaminanter, de beriget udfældes fra vildtypen som specifikke interaktion partnere af målproteinet. Selv innovative, QUICK bærer nogle begrænsninger: for det første, SILAC er omkostningskrævende og begrænset til organismer, der ideelt set er auxotrofe for arginin og / eller lysin. Når endvidere tunge arginin tilføres, arginin-til-prolin omdannelse resulterer i additional masse skift for hver prolin i et peptid og lidt fortynder tunge med lys arginin, hvilket gør kvantificering mere trættende og mindre nøjagtig 5,6. Sekund, QUICK kræver, at antistoffer titreres, således at de ikke bliver mættet med målprotein i ekstrakter fra knock-down mutanter.

Her introducerer vi en modificeret QUICK protokol, som overvinder de ovennævnte begrænsninger QUICK ved at erstatte SILAC for 15 N metabolisk mærkning og ved at erstatte RNAi-medieret knock-down for affinitet graduering af protein-protein interaktioner. Vi viser anvendeligheden af denne protokol ved hjælp af de encellede grønalge Chlamydomonas reinhardtii som model organisme og kloroplast HSP70B chaperone som målprotein 7 (figur 1). HSP70s er kendt for at interagere med specifikke co-chaperoner og substrater kun i ADP tilstand 8. Vi udnytter denne egenskab som et middel til at verificere de specifikkeinteraktion af HSP70B med dens nucleotid udveksling faktor CGE1 9.

Protocol

1. Antibody Adsorption

  1. Afvejes 120 mg Protein A-Sepharose i en 15 ml konisk rør (Falcon). Som 15 mg protein A-Sepharose er nødvendig for hver immunoprecipitation (IP) Denne mængde er tilstrækkelig til 8 IP'er. Der tilsættes 5 ml 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,4), og lad Protein A Sepharose kvældning i 30 min ved 4 ° C.

(Bemærk, at alle trin fra dette punkt på skal udføres med handsker for at undgå forurening med keratin og på is for at undgå proteinnedbrydning / kompleks dissociation.)

  1. Centrifugeres i 60 sekunder ved 1.000 x g og 4 ° C for at pelletere opkvældet protein A-Sepharose. Omhyggeligt fjerne supernatanten og resuspendere perlerne i 5 ml 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,4). Gentag dette trin tre gange for at vaske perlerne grundigt.
  2. Efter det sidste centrifugeringstrin, fjern supernatanten og efterlade cirka 0,5 ml phosphatbuffer. Tilsættes 0,9 ml 0,5 M phosphatpuffer (pH 7,4), 400pi affinitetsoprensede primære antistoffer (50 pi per IP) mod målproteinet (her HSP70B), og 16 gl antistoffer mod en kontrol-protein (her CF1β). Påfyld ddH 2 O til et samlet volumen på 5 ml.

(Bemærk, at affinitetsoprensede antistoffer skal anvendes til reduktion af kontaminering af uspecifikke IgG, som interfererer med nano-LC-MS-analyse - for en protokol se Willmund et al (2005) 10 CF1β fældes som en loading kontrol og blev valgt.. fordi det er rigelige og, efter cellelyse, er til stede i opløselige og membranassocierede fraktioner. Alternativt kan niveauer for forurenende proteiner anvendes til at normalisere til ulige belastning.)

  1. Tillad Protein A-Sepharose-perler til adsorption af IgG'er i løbet af en 1-times inkubation ved 25 ° C på et rør valse (CAT RM5W, 36 rpm).
  2. Centrifugeres i 60 sekunder ved 1.000 x g og 4 ° C for at pelletere protein A Sepharose-perler. Fjern forsigtigt supernatanten og resuspend perlerne i 5 ml 0,1 M natriumborat-puffer (pH 9,0). Gentag dette trin tre gange til grundigt at fjerne aminer, der ville slukke tværbinderen.
  3. Afvej 25,9 mg af frisk, solid dimethylpimelimidate og resuspendere den i 5 ml 0,1 M natriumborat-puffer (pH 9,0) til opnåelse af en slutkoncentration på 20 mM. Tilsættes til den protein A-Sepharose-perler.
  4. Tillad IgG'er til tværbinding til protein A i 30 minutter ved 25 ° C på et rør valse.
  5. Centrifugeres i 60 sekunder ved 1.000 x g og 4 ° C for at pelletere kuglerne. Omhyggeligt fjerne supernatanten og resuspendere perlerne i 5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5) for at kvæle frie tværbinder. Gentage dette trin én gang og inkuberes i 2 timer ved 25 ° C eller 12-24 timer ved 4 ° C på et rør valse.
  6. Valgfrit: Hvis Protein A-Sepharose-perler koblet med IgG ikke direkte anvendes til IP, opbevaring i op til en uge er mulig. Til dette, ° centrifuge i 60 sekunder ved 1.000 xg og 4 C til pellet perlerne, forsigtigt fjerne supernatant og resuspender perler i 5 ml 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,5) indeholdende 0,02% natriumazid og opbevar ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse.

2. Cellelyse, tværbinding og Prøvefremstilling

  1. Vokse to Chlamydomonas kulturer i medium indeholdende 7,5 mM 14 NH4CI eller 15 NH4CI som nitrogenkilde til en densitet på ~ 5 x 10 6 celler / ml. Celler er nødt til at passere gennem mindst ti generationer for fuld mærkning. Her blev celler dyrket photomixotrophically i TAP medium 11 på en roterende omryster ved 25 ° C under kontinuerlig bestråling med hvidt lys (30 μE m -2 s -1).
  2. Overfør to alikvoter hver af 14 N-og 15N-mærkede celler til fire GSA rør og høst celler af en 4 minutters centrifugering ved 4.000 x g og 4 ° C (Celletallet høstet for hver alikvot er afhængig af den cellulære koncentration af målet protein og skal bestemmes empirically i forvejen at sikre, at tilstrækkelig målprotein udfældes. Et godt udgangspunkt er 10 9 celler pr aliquot, dvs 200 ml af en kultur med 5 x 10 6 celler / ml.)
    Til tværbinding Kun: hvis proteinkomplekser vil blive tværbundet forud for undersøgelsesperioden, celler skal vaskes for at fjerne aminer er til stede i mediet. Til dette overføre Resuspender cellerne i 40 ml forafkølet KH-buffer (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 80 mM KCI), og dem til 50 ml Falcon-rør. Centrifugeres i 60 sekunder ved 1.000 x g og 4 ° C. Gentag dette trin én gang.
  3. Resuspender cellerne i 2 ml lysepuffer (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 1 mM MgCI2, 10 mM KCI, 154 mM NaCI) for-kølet til 4 ° C og overføre dem til 15 ml Falcon-rør. Opsaml de resterende celler i GSA rør med yderligere 1 ml lyseringsbuffer hver. Tilsættes 50 pi 25 x proteaseinhibitor og 12,5 gl 1 M MgCI2 (til en slutkoncentration på 3,5 mM) til hver portion.
  4. Tilsæt 150pi lysisbuffer, 12.5 pi 1 M ATP, 833 ul 270 mM creatinphosphat og 7 gl 5 ug / ul kreatinkinase (slutkoncentrationen er 2,5 mM ATP, 45 mM creatinphosphat, og 7 ug / ml creatinphosphokinase) til en af De alikvoter indeholdende 14 N-og 15N-mærkede celler (disse er de + ATP alikvoter).
  5. Tilsættes 930 ul lysepuffer og 70 gl 1 U / pl apyrase til de andre alikvoter indeholdende 14 N-og 15N-mærkede celler (disse er de-ATP alikvoter).
  6. Inkuber i 2 minutter ved 25 ° C på et rør valse til at etablere ATP-nedbryder og ATP-propfuld tilstande. Hvis tværbindingstrinnet udelades, tilsættes yderligere 1 ml lysisbuffer.
    Til tværbinding Kun: hvis de undersøgte protein-protein interaktioner er forbigående er det tilrådeligt at fange dem ved et tværbindingstrin. Til dette tilsættes 500 pi 20 mM dithio-bis (succinimidylpropionat) (DSP) opløst i DMSO (slutkoncentration er 2 mM) til each rør direkte før lydbehandling.
  7. Soniker fire gange 20 sek på is for at bryde cellerne med 20-sek pauser i mellem til afkøling. (Vi bruger BANDELIN Sonoplus HD2070 med en KE76 spids på udgang kontrol over 75% og duty cycle på 60%. De nødvendige indstillinger for andre maskiner / udstyr / tips skal fastlægges på forhånd for at sikre fuldstændig cellelyse og at undgå at spilde. )
    Til tværbinding Kun: tillade protein-komplekser til tværbinding ved inkubation i 1 time ved 4 ° C på et rør valse. Efter tværbinding, supplere hvert rør med 500 gl 1 M glycin og inkuberes på et rør valse i yderligere 15 minutter ved 4 ° C for at standse frie tværbinder.
  8. Forberede fire 6-ml saccharose puder (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 0,6 M saccharose) SW41 Ti tynd væg rør (Beckman Coulter Medie nr.: 344059), forsigtigt lægge hele ~ 5,5 ml cellelysater på saccharose puder (balance med lysepuffer) og centrifugeres i 30 minutter ved 200.000 x g og 4 ° C i en SW41 Ti rotor.
  9. Overfør toppen af ​​gradienten, der indeholder opløselige proteinkomplekser i fire 15-ml Falcon-rør (undgå at overføre dele af saccharosepude), tilsættes 350 pi 10% Triton X-100 til en slutkoncentration på 0,5% til hver af dem, blandes omhyggeligt og tilføje Lysis buffer til et samlet volumen på 7 ml hver.
    (Transfer 70 pi af hver opløselig celleekstrakt til friske 1,5 ml koniske rør (Eppendorf-rør), og der tilsættes 70 pi 2 x SDS-prøvepuffer (4% SDS, 125 mM Tris-HCI (pH 6,8), 20% glycerol, 10 % 2-mercaptoethanol) til hver for SDS-PAGE og immunoblot-analyser.)
  10. Kasser saccharose puder og resuspender membran pellets i 3 ml lyseringspuffer hver. Til hvert 1 ml 10% Triton X-100 til en slutkoncentration på 2%, sonikeres på is for at opløse pellets, og der tilsættes lysepuffer til et samlet volumen på 5 ml hver.
  11. Forbered yderligere fire 6-ml saccharose puder i SW41 Ti tyndvæggede rør, lægge ~ 5 ml af solubiliserede membraner fra trin 2,10 forsigtigt på saccharosepuder, og centrifuger i 30 minutter ved 200.000 x g og 4 ° C i en SW41 Ti rotor.
  12. Overfør toppen af gradienten, der indeholder membranprotein-komplekser i fire 15-ml Falcon-rør, og der tilsættes Lysis buffer (indeholdende 2% Triton X-100) til et slutrumfang på 7 ml hver. (Transfer 70 pi af hver opløselig celleekstrakt til frisk Eppendorf-rør og tilsæt 70 pi 2 x SDS-prøve til hvert af SDS-PAGE og immunoblot-analyser.)

3. Immunpræcipitation

  1. Pellet protein A Sepharose-perler indeholdende koblede antistoffer (fra trin 1,8 og 1,9) ved en 60 sec centrifugering ved 1.000 x g og 4 ° C, forsigtigt fjerne supernatanten og resuspender perler i 4 ml lyseringsbuffer. Gentag dette trin to gange at komme i ligevægt perler i Lysis buffer.
  2. Fyld op til 8 ml med lysisbuffer og overføres 1 ml af suspensionen på hver af de otte 15-ml Falcon rør indeholdende opløselige eller membran proteinkomplekser fra ATP-fyldt og ATP-nedbryder 14 15N-mærkede celler (fra trin 2.9 og 2.12).
  3. Der inkuberes i 2 timer ved 4 ° C på et rør valse til udfældning af proteinkomplekser.
  4. Pellet perlerne ved en 60-sec centrifugering ved 1.000 x g og 4 ° C og kasseres supernatanterne. Efterlade et lille væskevolumen på toppen af ​​perlerne for at lette overførslen.
  5. Overfør perlerne fra hvert Falcon-rør til 1,5 ml koniske rør (Eppendorf-rør). At indsamle alle resterende perler i Falcon-rør, tilføje yderligere 0,8 ml lysisbuffer indeholdende 0,1% Triton til hver, vortex forsigtigt, centrifugeres i 60 sekunder ved 1.000 x g og 4 ° C og overførsel af pufferen med resterende perler til Eppendorf-rør. Tube udveksling er nødvendig for at forhindre forureninger fra proteiner klæber til plast vægge.
  6. Pellet perlerne ved en 15-sec centrifugering ved 16.100 x g og 4 ° C, forsigtigt fjerne supernatanterne og resuspender perler i 1,3 ml lysebuffer indeholdende 0,1% Triton. Gentag dette trin to gange med lysis buffer indeholdende Triton og to gange med lyseringsbuffer mangler Triton til grundigt at vaske perlerne. Efterlade et lille væskevolumen på toppen af ​​perlerne for at lette overførslen.
  7. Igen overføres perlerne til friske 1,5 ml Eppendorf-rør til fjernelse af proteiner, der klæber til plastvæggene. Vask de gamle rør med 1 ml lysepuffer mangler Triton og overføre alle resterende perler til de friske rør.
  8. Der centrifugeres i 15 sekunder ved 16100 x g og 4 ° C, fjerne supernatanterne først med en normal pipette, og derefter fjernelse af eventuelt resterende supernatant fuldstændigt med en 50 pi Hamilton-sprøjte.

4. Sample Forberedelse til nano-LC-MS/MS

  1. Tilsæt 100 gl frisk fremstillet elueringspuffer (8 M urinstof, 25 mM NH4 HCO 3) til hvert rør, så brug 100 ul elueringspuffer at vaske perlerne klæber til Hamilton-sprøjte og inkuberes i 10 minutter i en Thermomixer ved 800 rpm og 65 ° C, og i yderligere 20 min ved 30 ° C. (En mere kompleteluering af bundne proteiner opnås ved eluering med 2% SDS og efterfølgende udfældning med 80% acetone.)
  2. Centrifuger i 15 sekunder ved 16.100 xg og 25 ° C. Overfør supernatanterne til friske rør med et 50 pi Hamilton-sprøjte.
  3. Tilsættes 50 ul elueringspuffer til perlerne, bruge 50 ul elueringspuffer at vaske perlerne klæber til Hamilton-sprøjte og gentage inkubation og centrifugering trin 4.1 og 4.2 hhv. Pool de respektive eluater.
    (Transfer 30 ul af eluaterne til friske Eppendorf-rør, 30 pi 2 x SDS-prøvepuffer til hver for SDS-PAGE og immunoblot-analyser tilsættes.)
  4. Kombiner den eluerede udfældes fra + /-ATP-behandlede, 14 N-og 15N-mærkede opløselige og membranassocierede proteiner som følger:
    120 pi 15 N / + ATP og 120 pi 14 N /-ATP
    120 pi 14 N / + ATP og 120 pi 15 N /-ATP
    120 pi 15 N / + ATP og 120 pi 14 N /-ATP <br /> 120 pi 14 N / + ATP og 120 pi 15 N /-ATP
  5. Tilsættes 1,5 gl frisk fremstillet 1 M DTT til en slutkoncentration på 6,5 mM til hver af de fire kombinationer til at reducere disulfidbindinger (herunder dem i tværbinder) og inkuberes i 30 minutter ved 25 ° C.
  6. Tilsættes 10,5 pi frisk fremstillet 0,6 M iodacetamid til en slutkoncentration på 25 mM til carboxymethylate de reducerede thioler og inkuberes i 20 minutter ved 25 ° C i mørke.
  7. Tilsættes 256 pi 40 mM NH4 HCO 3 og 4 pi Lys-C (0,1 pg / pl), forsegling rør med parafilm og inkuber i mindst 16 timer natten over på et rotationshjul ved 37 ° C.
  8. Tilsættes 470 pi 20 mM NH4 HCO 3, 10 pi 100% acetonitril (til en slutkoncentration på 1%) og 8 ul trypsin perler, og inkuberes i et rotationshjul i mindst 16 timer ved 37 ° C.
  9. Centrifugeres i 5 minutter ved 16.100 x g og 4 ° C og overførsel supernatanter til frisk 2-ml Eppendorf tubes. Vask de gamle rør med 50 ul 20 mM NH4 HCO 3, 0,5% eddikesyre, og pool med første supernatanter.
  10. For afsaltning, forberede hjemmelavede C 18-StageTips ved at skære ud to diske fra Empore C 18 materiale med en kanyle og placere dem i en 200-pi pipettespids. På denne måde forberede fire 200-ul tips. Punch huller i lågene af fire 2-ml Eppendorf rør og indsætte tips.
  11. Forudsætning af C 18-StageTips med 50 ul opløsning B (80% acetonitril, 0,5% eddikesyre). Centrifugeres i 3 minutter ved 800 g og 25 ° C.
  12. Ækvilibrere C18-StageTips med 100 gl Opløsning A (0,5% eddikesyre, 2% acetonitril). Centrifugeres i 3 minutter ved 800 g og 25 ° C. Gentag dette trin én gang.
  13. Load 100 gl af supernatanterne fra de tryptiske fordøjelser (4.9) på C18-StageTips og centrifugeres i 3 minutter ved 800 g og 25 ° C. Gentag dette trin, indtil de fuldstændige supernatanter blev anvendt tilkolonnerne.
  14. Vask C18-StageTips med 100 gl opløsning A. centrifugeres i 3 minutter ved 800 g og 25 ° C. Gentag dette trin to gange.
  15. Eluering tryptiske peptider i en frisk 1,5 ml Eppendorf-rør med 50 ul opløsning B. centrifugeres i 3 minutter ved 800 g og 25 ° C. Gentag dette trin én gang. Tørre peptider til færdiggørelse i en Speed ​​Vac.
  16. Valgfrit: sæl Eppendorf rør med parafilm og opbevares ved -80 ° C indtil videre anvendelse.
  17. Resuspender de tørrede peptider med 20 ul opløsning A og inkuberes i mindst 1 time på is, afbrudt af to 15-minutters inkubationer i et sonikatorbad. Centrifuger i 20 minutter ved 16.100 x g og 4 ° C, og anvende supernatanten til nano-LC-MS/MS.

5. Repræsentative resultater

Som vist eksemplarisk for de 14 N-mærkede celleekstrakter i figur 2A, er HSP70B og CGE1 næsten udelukkende lokaliseret til den opløselige fraktion, uafhængigt af ATP tilstand. IDerimod CF1β er lokaliseret til opløselige og membran-berigede fraktioner, som lydbehandling sakse med fra membran-lokaliserede CF o, og tjener derfor som loading kontrol for begge fraktioner. Som vist i figur 2B blev tilsvarende mængder af HSP70B præcipiteret med anti-HSP70B antistoffer fra 14 N-og 15N-mærket opløselige ekstrakter, uafhængigt af ATP tilstand. I modsætning hertil blev kun lidt HSP70B udfældet fra membranfraktioner med lidt større mængder stammer fra ATP-depleteret membranfraktioner i forhold til ATP propfuld fraktioner, således bekræfter tidligere resultater 9. Ingen CGE1 blev co-udfældet med HSP70B i ATP-propfuld opløselige eller membran fraktioner, mens store mængder CGE1 blev co-udfældet med HSP70B fra ATP-udtømte opløselige fraktioner, og lidt fra ATP-udtømte membranfraktioner.

Interaktionen af ​​CGE1 med HSP70B kun i ADP tilstand er også observeret iMS-analyse: i figur 3, som er repræsentativ MS1 spektre af HSP70B og CGE1 peptider fra præcipitater genereret med HSP70B antiserum fra opløselige celleekstrakter er vist. I eksperimentet vist i figur 3A, blev præcipitatet fra blandinger af 14 N-mærkede ekstrakter mangler ATP og 15 N-mærkede ekstrakter indeholdende ATP. Mens den tunge og lette mærket form af HSP70B peptidet blev påvist på samme intensiteter, blev kun lyset mærket form af CGE1 peptid (fra-ATP ekstrakter) fundet. I figur 3B de samme peptider fra anti-HSP70B bundfald afledt af blandinger af hinanden mærkede opløselige celleekstrakter er vist. Følgelig denne gang kun den tunge mærkede form af CGE1 peptid (fra-ATP ekstrakter) blev detekteret, mens dette var igen tilfældet for både, lette og tunge mærkede HSP70B peptider.

Figur 1
<strong> Figur 1. Eksperimentelle arbejdsgang. Cellerne metabolisk mærket med 14 N og 15 N i mindst 10 generationer, høstet og leveres med eller forarmet fra ATP. Efter cellelyse proteinkomplekser eventuelt kan være tværbundet (X-link) med DSP. Lyserede celler separeres derefter i opløselig (Sol) og membran-berigede (Pel) fraktioner. Målproteiner (her HSP70B) og en kontrol-protein (her CF1β) er immunpræcipiteret med specifikke antistoffer koblet til protein A-sepharosekugler (sort). Efter vask udfældede proteiner elueres og enten direkte analyseret ved immunoblotting, eller de respektive 14 N-og 15N-mærket fraktioner i + ATP og ATP-tilstande pooles, fordøjes og analyseres ved nano-LC-MS/MS. I eksemplet viste tilfælde her de 15 N-mærkede fraktion blev udtømt fra ATP. Følgelig er forholdet mellem intensiteter af tunge mærkede (mørke farver) til lys mærkede (lyse farver) peptider fra kontrolprotein(CF1β), målproteinet (HSP70B) og ikke-specifikt bundne forureninger skal vare ca, mens dette forhold forventes at være meget høj for proteiner specifikt interagerer med målproteinet (CGE1). se større tal .

Figur 2
Figur 2. En analyse af råmaterialer, HSP70B immunfældning. Samlet protein blev ekstraheret fra opløseligt (Sol) og membran-berigede (Pel) fraktioner enten depleteret fra ATP (-ATP) eller suppleret med ATP og et ATP-regenererende system (+ ATP). 0,01% af proteinekstrakter blev separeret på en 10% SDS-polyacrylamidgel, og niveauer af HSP70B og CGE1 protein i forhold til lastning kontrol CF1β blev analyseret ved immunoblotting. B Analyse af immunopræcipitater. HSP70B blev immunopræcipiteret fra 14 N-og15N-mærkede opløselige og membran-berigede celleekstrakter indeholder eller mangler ATP. Proteiner svarende til 3,3% af immunpræcipitater blev separeret på en 10% SDS-polyacrylamidgel og niveauer af HSP70B og CGE1 forhold til lastning kontrol CF1β blev analyseret ved immunoblotting. se større tal .

Figur 3
Figur 3. En repræsentant massespektre af HSP70B og CGE1 peptider fra anti-HSP70B immunpræcipitater udført på blandede opløselige fraktioner (14 N-ATP / 15 N + ATP). Full MS-spektre på 14 N og 15 N mærkede peptider, svarende til-ATP og + ATP stater, henholdsvis fra HSP70B og co-immunopræcipiterede CGE1 er vist. Begge peptider tredobbelt opladet, HSP70B peptidet indeholder 22 nitrogenatomer, de CGE1 Peptide 19, svarende til en masse skift af 7,33 og 6,33 m / z hhv. B repræsentant massespektre fra den reciprokke forsøg (14 N + ATP / 15 N-ATP). Fuld MS-spektre af de samme 14 N og 15 N mærkede peptider, her svarende til + ATP og-ATP stater, henholdsvis fra HSP70B og co-immunopræcipiterede CGE1 vises. Klik her for at se større figur .

Discussion

Vi har for nylig introduceret to forbedringer til hurtig tilgang: en tværbindingstrin til at indfange forbigående protein-protein interaktioner (QUICK-X), og en kontrolgruppe udfældning at normalisere for ulige nedbør effektivitetsgevinster 6. Her præsenterer vi en protokol med yderligere to forbedringer af QUICK: For det første, vi udskifter SILAC 5 for 15 N metabolisk mærkning. Fordelene er, at 15 N metabolisk mærkning er meget billigere end SILAC, hvis 15N er tilvejebragt som simple uorganiske salt. Endvidere med 15 N metabolisk mærkning QUICK kan anvendes på organismer prototrofe for alle aminosyrer, som de fleste planter, svampe og bakterier. Og endelig ser arginin-til-prolin interomdannelse forbundet til SILAC 5,6 ikke et problem for kvantificering af 15 N mærkede peptider. Eksempler på egnede redskaber til den kvantitative evaluering af 15 N proteomics data er MSQUANT 12 eller jegOMIQS 13.

For det andet introducerer vi affinitet modulation som et middel til specifikt at reducere mængden af ​​proteiner, der interagerer med et bestemt målprotein i en prøve versus en anden. Fordelene ved denne tilgang er, at den omgår konstruktionen af ​​knockdown-mutanter, hvilket for nogle modelsystemer er vanskelige at frembringe eller ikke kan frembringes på alle ved væsentlige målproteiner. Desuden er det undgår fejlfortolkninger forårsaget af forskellen proteinekspression potentielt opstår som reaktion af cellen for banker-down et målprotein: hvis andre proteiner er nedreguleret samt og krydsreagerer med antiserum anvendt til immunopræcipitation, ville de blive fortolket som ægte interaktion partnere af målproteinet. Til sidst ophæver affinitet modulation nødvendigheden af ​​at finde en passende antistof-til-antigen-forhold.

Selvom vi anvender vores protokol til Chlamydomonas reinhardtii som model organismeKan det let tilpasses enhver anden organisme, der kan dyrkes i cellekultur og kan anvende ammonium eller nitrat som nitrogenkilde. Affinity modulation af proteinkomplekser af ATP / ADP kan direkte anvendes på andre chaperoner, hvis interaktion med substrater og kohorte proteiner afhænger af ATP tilstand, ligesom de GroEL/HSP60/Cpn60 eller HSP90 chaperone systemer 14,15, eller ethvert andet system, hvor bindingsaffiniteter moduleres af ATP. Affinity graduering bør også arbejde for de tilfælde, hvor slægtskab mellem protein interaktioner er ændret ved specifikke lægemidler, såsom radicicol eller geldanamycin i tilfælde af HSP90 systemer 15.

En klar begrænsning af vores protokol, er at det kræver affinitetsoprensede antistoffer mod et målprotein kendt for at være følsomt over for en specifik behandling / lægemiddel, som modulerer dets affinitet for partner proteiner. Det er derfor ikke high-throughput metode.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Olivier Vallon for antiserummet mod CF1β. Dette arbejde blev støttet af Max Planck Society og tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) og Bundesministerium für Bildung und Forschung (Systembiologi Initiative FORSYS, projektledere GoFORSYS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ProteinA Sepharose Sigma-Aldrich P3391
DMP (Dimethyl pimelimidate) Sigma-Aldrich D8388 Store desiccated at -20 °C, dissolve directly before use
Protease inhibitor (complete, EDTA-free) Roche Applied Science 11873580001
ATP (Adenosin-5'-triphosphat) Carl Roth K054
Creatine phosphate Sigma-Aldrich 27920
Creatine phosphokinase Sigma-Aldrich C7886
DSP Dithiobis [succinimidyl propionate] Thermo Sientific 22585 Store desiccated at 4 °C
15NH4Cl Cambridge isotope laboratories, Andover, MA NLM-467
Lys-C (Endoproteinase
Lys-C)
Roche Applied Science 11047825001
Trypsin beads (Poroszyme Immobilized Trypsin) Applied Biosystems 2-3127-00 Mix vigorously directly before use
Empore C18 47 mm Disk Varian 12145004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods. J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).
  2. Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).
  3. Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins. Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).
  4. Selbach, M., Mann, M. Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK. Nat Methods. 3, 981-983 (2006).
  5. Ong, S. E., Mann, M. A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).
  6. Heide, H. Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C. Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).
  7. Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox. International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).
  8. Mayer, M. P., Bukau, B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).
  9. Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing. The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).
  10. Willmund, F., Schroda, M. HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).
  11. Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , Elsevier, Academic Press. San Diego, CA. (2008).
  12. Mortensen, P. MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics. J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).
  13. M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
  14. Bukau, B., Horwich, A. L. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell. 92, 351-366 (1998).
  15. Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. The Hsp90 chaperone machinery. J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).

Tags

Genetik Molecular Biology Fysiologi Plantebiologi, hurtig proteintværbinding Chlamydomonas co-immunopræcipitation molekylære chaperoner HSP70
En protokol til identifikation af protein-protein interaktioner Udfra<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolisk mærkning Immunoprecipitation, Kvantitativ massespektrometri og Affinity Modulation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmollinger, S., Strenkert, D.,More

Schmollinger, S., Strenkert, D., Offeddu, V., Nordhues, A., Sommer, F., Schroda, M. A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation. J. Vis. Exp. (67), e4083, doi:10.3791/4083 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter