Summary
Wir präsentieren eine Variation der QUICK (quantitativen Immunpräzipitation mit Knockdown kombiniert) Ansatz, der zuvor wurde eingeführt, um zwischen wahr und falsch Protein-Protein-Wechselwirkungen zu unterscheiden. Unser Ansatz basiert auf
Abstract
Protein-Protein-Wechselwirkungen sind für viele biologische Prozesse in der Zelle von grundlegender Bedeutung. Deshalb spielt deren Charakterisierung eine wichtige Rolle in der gegenwärtigen Forschung und eine Vielzahl von Methoden für ihre Untersuchung steht ein. Protein-Protein Wechselwirkungen sind oft sehr dynamisch und kann auf der subzellulären Lokalisation, posttranslationale Modifizierungen und dem lokalen Proteinumgebung 2 abhängen. Daher sollten sie in ihrer natürlichen Umgebung untersucht werden, für die Co-Immunopräzipitation Ansätze die Methode der Wahl 3 sind. Co-gefällte Interaktionspartner werden entweder durch Immunoblotting in einem zielgerichteten Ansatz oder durch Massenspektrometrie (LC-MS/MS) in einer ungezielte Weise identifiziert. Die letztgenannte Strategie wird oft negativ von einer großen Zahl von falsch positiven Entdeckungen, vor allem aus der hohen Empfindlichkeit der modernen Massenspektrometern, die selbstbewusst erkennt Spuren von unspezifisch Ausfällen von Proteinen abgeleitet betroffen. A recent Ansatz zur Überwindung dieses Problems liegt der Gedanke zugrunde, dass verringerte Mengen an spezifischen Bindungspartner wird Copräzipitat mit einer gegebenen Zielprotein deren zelluläre Konzentration wird durch RNAi reduziert, während die Mengen an unspezifisch Ausfällen von Proteinen sein sollte unberührt. Dieser Ansatz, genannt QUICK zur quantitativen Immunpräzipitation mit Knockdown 4 Kombinierte beschäftigt Stable Isotope Labeling von Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) 5 und MS, um die Mengen von Proteinen aus Wildtyp-und knock-down Stämme immunpräzipitiert quantifizieren. Proteinen in einem Verhältnis von 1:1 zu finden ist als Verunreinigungen, die in Ausscheidungen vom Wildtyp als spezifische Bindungspartner des Zielproteins angereichert betrachtet werden. Obwohl innovative trägt QUICK einige Einschränkungen: Erstens ist SILAC kostenintensiv und beschränkt auf Organismen, die im Idealfall auxotroph für Arginin und / oder Lysin. Außerdem, wenn schwere Arginin eingespeist wird, Arginin-zu-Prolin Umwandlung führt additional Masse verschiebt für jeden Prolin in einem Peptid und leicht verdünnt schwere mit Licht Arginin, die Quantifizierung mühsamer und weniger genau 5,6 macht. Zweitens erfordert QUICK dass Antikörper titriert sind, dass sie nicht in die Sättigung mit Zielprotein in Extrakten aus knock-down-Mutanten.
Hier stellen wir ein modifiziertes Quick-Protokoll, das die obengenannten Einschränkungen von SCHNELL durch Ersetzen SILAC für 15 N metabolische Markierung und durch Ersetzen RNAi-vermittelte knock-down für Affinität Modulation von Protein-Protein-Wechselwirkungen überwindet. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieses Protokolls unter Verwendung der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii als Modellorganismus und der Chloroplasten HSP70B Chaperon als Zielprotein 7 (Abbildung 1). HSP70s sind dafür bekannt, mit speziellen Co-Chaperone und Substrate nur in der ADP Zustand 8 interagieren. Wir nutzen diese Eigenschaft als ein Mittel, um den spezifischen überprüfenZusammenspiel von HSP70B mit seinen nucleotide exchange factor CGE1 9.
Protocol
Ein. Antikörper Adsorption
- Abwiegen 120 mg Protein A Sepharose in einem 15-ml konischen Röhrchen (Falcon). Als 15 mg Protein A Sepharose für jeden Immunopräzipitation (IP) benötigt wird diese Menge ausreichend für 8 IPs. 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) und ließ das Protein A Sepharose Dünung für 30 min bei 4 ° C.
(Beachten Sie, dass alle Schritte von diesem Punkt an, um mit Handschuhen durchgeführt werden müssen, um eine Kontamination mit Keratin und auf Eis zu vermeiden Proteinabbau / Areal Dissoziation zu vermeiden.)
- Zentrifuge für 60 sec bei 1.000 x g und 4 ° C bis Pellet das gequollene Protein A Sepharose. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren die Perlen in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4). Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal um die Perlen gründlich waschen.
- Nach dem letzten Zentrifugationsschritt, entfernen lassen Überstand und etwa 0,5 ml Phosphatpuffer. Hinzufügen 0,9 ml 0,5 M Phosphatpuffer (pH 7,4), 400ul affinitätsgereinigten Primärantikörper (50 ul pro IP) gegen das Zielprotein (hier HSP70B) und 16 ul Antikörper gegen ein Kontroll-Protein (hier CF1β). Füllen Sie ddH 2 O auf ein Gesamtvolumen von 5 ml.
(Beachten Sie, dass affinitätsgereinigten Antikörper verwendet werden, sollten, um eine Kontamination durch unspezifische IgGs, die mit Nano-LC-MS-Analyse stören reduzieren - für ein Protokoll siehe Willmund et al (2005) 10 CF1β als Ladungskontrolle fiel aus und wurde gewählt.. weil es reichlich vorhanden ist und nach der Zelllyse in löslicher und Membranfraktionen präsentieren. Alternativ Ebenen von verunreinigenden Proteinen verwendet werden, um dadurch ungleiche Belastung normalisieren.)
- Erlauben Protein A-Sepharose Kügelchen zu adsorbieren IgGs während einer 1-stündigen Inkubation bei 25 ° C auf einer Rohrwalze (CAT RM5W, 36 UpM).
- Zentrifuge für 60 sec bei 1.000 x g und 4 ° C zu pelletieren die Protein A-Sepharose-Kügelchen. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspend der Kügelchen in 5 ml 0,1 M Natriumborat-Puffer (pH 9,0). Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal gründlich zu entfernen Amine, die den Vernetzer auslöschen würde.
- Man wiegt 25,9 mg frisches, festes dimethylpimelimidate und resuspendieren in 5 ml 0,1 M Natriumborat-Puffer (pH 9,0), um eine Endkonzentration von 20 mM zu erhalten. Fügen Sie diese Lösung für die Protein-A-Sepharose-Kügelchen.
- Erlauben IgGs zu vernetzen, um Protein A für 30 min bei 25 ° C auf einer Rohrwalze.
- Zentrifuge für 60 sec bei 1.000 x g und 4 ° C zu pelletieren die Kügelchen. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren die Perlen in 5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5) freie Vernetzer stillen zu können. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal und inkubieren für 2 Stunden bei 25 ° C oder 12-24 Stunden bei 4 ° C auf einem Rohr Rolle.
- Optional, wenn Protein A Sepharose-Kügelchen gekoppelt IgGs nicht direkt für IP, Lagerung für bis zu einer Woche verwendet ist möglich. Dafür Zentrifuge für 60 sec bei 1.000 xg und 4 ° C bis Pellet die Perlen, entfernen Sie vorsichtig die supernatant und resuspendieren Kügelchen in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) mit 0,02% Natriumazid und lagern bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung.
2. Cell Lysis, Vernetzung und Probenvorbereitung
- Wachsen zwei Chlamydomonas Kulturen in Medium mit 7,5 mM 14 NH 4 Cl oder 15 NH 4 Cl als Stickstoffquelle zu einer Dichte von ~ 5 × 10 6 Zellen / ml. Zellen müssen über mindestens zehn Generationen für die vollständige Kennzeichnung passieren. Hier wurden die Zellen in TAP photomixotrophically Medium 11 auf einer rotatorischen Schüttler bei 25 ° C gezüchtet unter kontinuierlicher Bestrahlung mit weißem Licht (30 uE m -2 s -1).
- Übertragen zwei Aliquots von jeweils 14 N-und 15 N-markierte Zellen bis vier Rohren GSA und Ernte Zellen durch ein 4-min Zentrifugation bei 4.000 × g und 4 ° C (Die Zellzahl für jedes Aliquot geerntet hängt von der zellulären Konzentration des Targets Protein und Bedürfnisse zu ermitteln e werdenmpirically im Voraus, um sicherzustellen, dass genügend Zielprotein ausgefällt wird. Ein guter Ausgangspunkt ist 10 9 Zellen pro Aliquot, dh 200 ml einer Kultur mit 5 x 10 6 Zellen / ml.)
Zur Vernetzung nur: bei Proteinkomplexe vor IP vernetzt werden, benötigen Zellen gewaschen, um Amine in dem Medium zu entfernen. Hierzu übertragen resuspendieren Zellen in 40 ml vorgekühlter KH-Puffer (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 80 mM KCl) und sie zu 50-ml-Falcon-Röhrchen. Zentrifuge für 60 sec bei 1.000 xg und 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. - Die Zellen in 2 ml Lysepuffer (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 1 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 154 mM NaCl) bis 4 vorgekühlt ° C und übertragen Sie sie auf 15-ml-Falcon-Röhrchen. Sammeln restlichen Zellen in GSA Rohre mit einem weiteren 1 ml Lysepuffer jedem. Dann werden 50 ul 25 x Proteaseinhibitor und 12,5 ul 1 M MgCl 2 (bis zu einer Endkonzentration von 3,5 mM) zu jedem Aliquot.
- Fügen Sie 150ul Lysepuffer, 12,5 ul 1 M ATP, 833 ul 270 mM Kreatinphosphat und 7 ul 5 ug / ul Kreatinphosphokinase (die Endkonzentration beträgt 2,5 mM ATP, 45 mM Creatinphosphat, und 7 pg / ml Kreatinphosphokinase) an eine der die Aliquots mit 14 N-und 15 N-markierten Zellen (das sind die ATP + Aliquots).
- Hinzufügen 930 ul Lysepuffer und 70 ul 1 U / ul Apyrase zu den anderen Aliquots mit 14 N-und 15 N-markierten Zellen (das sind die ATP-Aliquots).
- Inkubieren für 2 min bei 25 ° C auf einer Rohrwalze festzustellen ATP-Abbau und ATP-angefüllt Zuständen. Wenn die Vernetzung Schritt ausgelassen wird, einen weiteren 1 ml Lyse-Puffer.
Für die Vernetzung nur: im Falle der untersuchten Protein-Protein-Interaktionen vergänglich sind, ist es ratsam, sie durch eine Vernetzung Schritt erfassen. Hierzu fügt 500 ul 20 mM Dithio-bis (succinimidylpropionat) (DSP) in DMSO (Endkonzentration 2 mM) bis each Rohr unmittelbar vor Beschallung. - Beschallen vier mal 20 sec auf Eis, um Zellen mit 20-sec Pausen dazwischen zur Kühlung zu brechen. (Wir verwenden die Bandelin Sonoplus HD2070 mit einem KE76 Spitze am Ausgang Kontrolle über 75% und Tastverhältnis von 60%. Die notwendigen Einstellungen für andere Maschinen / Geräte / tips müssen im Voraus bestimmt werden, um eine vollständige Lyse zu gewährleisten und um zu vermeiden verschütten. )
Zur Vernetzung nur: ermöglichen Proteinkomplexe zu vernetzen durch Inkubation für 1 Stunde bei 4 ° C auf einer Rohrwalze. Nach der Vernetzung ergänzen Rohr mit 500 ul 1 M Glycin und inkubieren auf einer Rohrwalze für weitere 15 Minuten bei 4 ° C bis freien Vernetzer quenchen. - Planen vier 6-ml Saccharose Kissen (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 0,6 M Saccharose) in SW41 Ti dünnwandigen Rohren (Beckman Coulter Art.Nr: 344.059), sorgfältig lag der gesamte ~ 5,5 ml der Zell-Lysate auf die Saccharose Kissen (Waage mit Lysepuffer) und Zentrifuge für 30 min bei 200.000 x g und 4 ° C in einem SW41 Ti rotor.
- Übertragen der Oberseite des Gradienten, die lösliche Protein-Komplexen in vier 15-ml-Falcon-Röhrchen (zur Vermeidung der Übertragung Teile des Saccharosekissen) fügen 350 ul 10% Triton X-100 bis zu einer Endkonzentration von 0,5% auf jede von ihnen, vorsichtig mischen und fügen Lysepuffer auf ein Gesamtvolumen von 7 ml.
(Transfer 70 ul jeder lösliche Zellextrakt an die frische 1,5-ml konischen Röhrchen (Eppendorf-Röhrchen) und fügen Sie 70 ul 2 x SDS-Probenpuffer (4% SDS, 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20% Glycerin, 10 % 2-Mercaptoethanol) mit jedem für die SDS-PAGE und Immunoblot-Analysen.) - Entsorgen Sie die Saccharose Kissen und resuspendieren Membran-Pellets in 3 ml Lysepuffer jeder. In den jeweils 1 ml 10% Triton X-100 bis zu einer Endkonzentration von 2%, auf Eis beschallt, um Pellets lösen sich, und geben Lysis-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 5 ml gelöst.
- Bereiten Sie weitere vier 6-ml Saccharose Kissen in SW41 Ti dünnwandige Rohre, lag der ~ 5 ml solubilisierten Membranen von Schritt 2,10 vorsichtig auf die SaccharoseKissen, und Zentrifuge für 30 min bei 200.000 x g und 4 ° C in einem SW41 Ti Rotor.
- Übertragen der Oberseite des Gradienten enthält Membranproteinkomplexen in vier 15-ml-Falcon-Röhrchen und geben Lysis-Puffer (enthaltend 2% Triton X-100) auf ein Endvolumen von 7 ml gelöst. (Transfer 70 ul jeder lösliche Zellextrakt zu frischem Eppendorf Röhrchen und geben 70 ul 2 x SDS-Probe mit jedem für die SDS-PAGE und Immunoblot-Analysen.)
3. Immunpräzipitation
- Pellet die Protein A-Sepharose Kügelchen enthaltenden gekoppelten Antikörpern (von den Schritten 1.8 oder 1.9) von einem 60-sec Zentrifugation bei 1.000 × g und 4 ° C werden vorsichtig die überstehende Wülste und resuspendieren in 4 ml Lysepuffer. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal Perlen in Lysepuffer äquilibriert.
- Füllen bis zu 8 ml mit Lysepuffer und übertragen 1 ml der Suspension mit jeder der acht 15-ml-Falcon-Röhrchen mit löslichen oder Membran-Protein-Komplexen aus ATP-angefüllt und ATP-abzureichern 14 15 N-markierten Zellen (aus Stufe 2.9 und 2.12).
- Inkubieren für 2 Stunden bei 4 ° C auf einer Rohrwalze auszufallen Proteinkomplexen.
- Pellet die Kügelchen von einem 60-sec Zentrifugation bei 1.000 × g und 4 ° C und die Überstände verworfen. Einen kleinen Volumen von Flüssigkeit auf der Oberseite der Sicken, um die Übertragung zu ermöglichen.
- Übertragen Sie die Perlen aus jedes Falcon-Röhrchen bis 1,5-ml konischen Röhrchen (Eppendorf-Röhrchen). Um alle restlichen Perlen in den Falcon-Röhrchen sammeln, fügen Sie eine weitere 0,8 ml Lysis-Puffer mit 0,1% Triton jedem, vorsichtig vortexen, zentrifugieren für 60 sec bei 1.000 xg und 4 ° C und überweisen Sie den Puffer mit Rest-Perlen auf die Eppendorf-Röhrchen. Rohr Austausch ist notwendig, um Verunreinigungen aus Proteinen Einhaltung der Kunststoff-Wänden zu verhindern.
- Pellet die Perlen von einem 15-sec Zentrifugation bei 16.100 xg und 4 ° C, vorsichtig die Überstände und resuspendieren Perlen in 1,3 ml Lysis-Puffer mit 0,1% Triton. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal mit Lyse buffer mit Triton und zweimal mit Lysepuffer fehlt Triton gründlich waschen Perlen. Einen kleinen Volumen von Flüssigkeit auf der Oberseite der Sicken, um die Übertragung zu ermöglichen.
- Erneut übertragen die Perlen an die frische 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen, um Proteine Einhaltung der Kunststoff-Wänden zu entfernen. Waschen Sie die alten Röhren mit 1 ml Lysepuffer fehlt Triton und übertragen alle restlichen Perlen auf die frische Röhrchen.
- Zentrifuge für 15 Sekunden bei 16.100 xg und 4 ° C, entfernen Sie die Überstände zunächst mit einer normalen Pipette, dann entfernen Sie alle verbleibenden Überstand vollständig mit einem 50-ul Hamilton Spritze.
4. Probenvorbereitung für Nano-LC-MS/MS
- Fügen Sie 100 ul frisch zubereiteten Elutionspuffer (8 M Harnstoff, 25 mM NH 4 HCO 3) in jedes Röhrchen, verwenden Sie die 100 ul Elutionspuffer abwaschen Perlen Festhalten an der Hamilton-Spritze und Inkubation für 10 min in einem Thermomixer bei 800 rpm und 65 ° C, und für weitere 20 min bei 30 ° C (A wesentlich vollständigerElution der gebundenen Proteine durch Elution mit 2% SDS und anschließende Fällung mit 80% Aceton gelöst.)
- Zentrifuge für 15 Sekunden bei 16.100 xg und 25 ° C. Übertragen Überstände an die frische Rohre mit einem 50-ul Hamilton Spritze.
- Fügen Sie 50 ul Elutionspuffer zu den Perlen, verwenden Sie die 50 ul Elutionspuffer abwaschen Perlen Festhalten an Hamilton-Spritze und wiederholen Inkubation und Zentrifugation Schritte 4,1 und 4,2 sind. Bündeln die jeweiligen Eluate.
(Transfer 30 ul der Eluate an die frische Eppendorf-Röhrchen, fügen Sie 30 ul 2 x SDS-Probenpuffer jeweils für SDS-PAGE und Immunoblot-Analysen.) - Kombinieren der eluierte Ausscheidungen von + /-ATP-behandelt, 14 N-und 15 N-markierten löslichen und Membranproteinen wie folgt:
120 ul 15 N / + ATP und 120 ul 14 N /-ATP
120 ul 14 N / + ATP und 120 ul 15 N /-ATP
120 ul 15 N / + ATP und 120 ul 14 N /-ATP <br /> 120 ul 14 N / + ATP und 120 ul 15 N /-ATP - Hinzufügen 1,5 ul frisch zubereiteten 1 M DTT bis zu einer Endkonzentration von 6,5 mM, um jede der vier Kombinationen Disulfidbindungen (einschließlich jener im Vernetzer) zu reduzieren und inkubiere für 30 Minuten bei 25 ° C.
- Fügen 10,5 ul frisch zubereiteten 0,6 M Iodacetamid zu einer Endkonzentration von 25 mM die reduzierten Thiole carboxymethylieren und Inkubation für 20 min bei 25 ° C im Dunkeln.
- Fügen Sie 256 ul 40 mM NH 4 HCO 3 und 4 ul Lys-C (0,1 ug / ul), seal Röhrchen mit Parafilm und inkubieren für mindestens 16 Stunden über Nacht auf einem Drehrad bei 37 ° C.
- Hinzufügen 470 ul 20 mM NH 4 HCO 3, 10 ul 100% Acetonitril (in einer Endkonzentration von 1%) und 8 ul Trypsin Kügelchen und inkubieren auf einem Rotationsrad für mindestens 16 Stunden bei 37 ° C.
- Zentrifuge für 5 min bei 16.100 xg und 4 ° C, und die Übertragung Überstände an die frische 2-ml Eppendorf Badewannees. Waschen Sie die alten Röhren mit 50 ul 20 mM NH 4 HCO 3, 0,5% Essigsäure und Pool mit ersten Überstände.
- Zur Entsalzung, bereiten hausgemacht C 18-StageTips durch Ausschneiden zwei Scheiben aus Empore C 18-Material mit einer Spritze Nadel und sie in einen 200-ul Pipettenspitze. Auf diese Weise vorzubereiten vier 200-ul-Tipps. Stanzlöcher in den Deckeln von vier 2-ml-Eppendorf-Röhrchen und Insert Spitzen.
- Voraussetzung der C 18-StageTips mit 50 ul Lösung B (80% Acetonitril, 0,5% Essigsäure). Zentrifuge für 3 min bei 800 g und 25 ° C.
- Äquilibrieren Sie die C 18-StageTips mit 100 ul Lösung A (0,5% Essigsäure, 2% Acetonitril). Zentrifuge für 3 min bei 800 g und 25 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
- Last 100 ul der Überstände aus den tryptischen Verdaus (4,9) an der C 18-Zentrifuge StageTips und für 3 min bei 800 g und 25 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die komplette Überstände angewendet wurdendie Spalten.
- Waschen Sie die C 18-StageTips mit 100 ul Lösung A. Zentrifuge für 3 min bei 800 g und 25 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Eluieren tryptischen Peptide in eine frische 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen mit 50 ul Lösung B Zentrifuge für 3 min bei 800 g und 25 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. Dry Peptide bis zur Fertigstellung in einer Geschwindigkeit vac.
- Optional: seal Eppendorf-Röhrchen mit Parafilm und bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Resuspendieren getrockneten Peptide mit 20 ul Lösung A und inkubieren für mindestens 1 h auf Eis, gefolgt von zwei 15-min Inkubation in einem Ultraschallgerät Bad unterbrochen. Zentrifuge für 20 min bei 16.100 xg und 4 ° C, und gelten Überstand Nano-LC-MS/MS.
5. Repräsentative Ergebnisse
Wie beispielhaft für die 14 N-markierten Zellextrakten in 2A gezeigt, sind HSP70B und CGE1 fast ausschließlich der löslichen Fraktion, unabhängig von dem Zustand ATP lokalisiert. InDagegen CF1β wird, um lösliche und membrangebundene angereicherten Fraktionen lokalisiert, wie Ultraschallbehandlung abschert Teil davon aus membranständigen CF o, und dient daher als Verladesteuerung für beide Fraktionen. Wie in 2B gezeigt, wurden ähnliche Mengen HSP70B mit den Anti-Antikörper von HSP70B 14 N-und 15 N-markierten löslichen Extrakten, unabhängig von der ATP Zustand ausgefällt. Im Gegensatz dazu wurde nur wenig HSP70B aus Membranfraktionen mit etwas größeren Mengen, die von ATP-depletierten Membranfraktionen zu ATP angefüllt Fraktionen gegenüber ausgefällt, damit übereinstimmende früheren Ergebnissen 9. Kein CGE1 wurde mit HSP70B in ATP-voll löslich oder Membranfraktionen copräzipitiert, während große Mengen an CGE1 wurden mit HSP70B von ATP-depletierten lösliche Fraktionen co-präzipitiert und wenig von ATP-depletierten Membranfraktionen.
Die Wechselwirkung mit CGE1 HSP70B nur im ADP Zustand wird auch in dem beobachtetenMS-Analyse: in 3 gezeigt, stellvertretend MS1 Spektren HSP70B und CGE1 Peptide von Ausscheidungen mit der HSP70B Antiserum aus löslichen Zellextrakte erzeugt werden gezeigt. In dem Experiment in 3A gezeigt, Präzipitate wurden aus Gemischen von 14 N-markiertem Extrakten fehlen ATP und 15 N-markierte ATP enthaltenden Extrakten. Während die schweren und leichten markierten Form des Peptids HSP70B in gleichen Intensitäten nachgewiesen wurden, wurde nur das Licht markierten Form des Peptids CGE1 (aus ATP-Extrakte) gefunden. In 3B die gleichen Peptide aus der Anti-HSP70B Niederschlags aus Mischungen von wechselseitig markierten löslichen Zellextrakte abgeleitet werden gezeigt. Dementsprechend diesmal nur die schwere markierten Form des Peptids CGE1 (aus ATP-Extrakte) detektiert wurde, während dies wieder der Fall zu den beiden, leichte und schwere markierten HSP70B Peptide.
<strong> Abbildung 1. Experimentelle Arbeitsablauf. Zellen werden metabolisch mit 14 N und 15 N für mindestens 10 Generationen markiert, geerntet und mit abgereichertem oder von ATP. Nach Zelllyse Protein-Komplexen können gegebenenfalls vernetzten (X-Link) mit DSP werden. Lysierten Zellen werden dann in löslicher getrennt (Sol) und der Membran angereichert (Pel) Fraktionen. Zielproteine (hier HSP70B) und eine Kontroll-Protein (hier CF1β) mit spezifischen Antikörpern, die an Protein A-Sepharose-Kügelchen (schwarz) immunpräzipitiert. Nach dem Waschen werden ausgefällten Proteine eluiert und entweder direkt analysiert durch Immunoblotting, oder die entsprechenden 14-N und 15 N-markierten Fraktionen in + ATP und ATP-Zustände werden gepoolt, verdaut und analysiert durch Nano-LC-MS/MS. Im Beispielfall hier das 15 N-markierte ATP wurde Fraktion aus abgereichertem gezeigt. Dementsprechend bezeichnet das Verhältnis der Intensitäten von schweren markierten (dunklen Farben) zu beleuchten (Lichtfarben) peptide aus dem Kontrollprotein(CF1β), das Zielprotein (HSP70B) und nicht-spezifisch gebundenen Verunreinigungen sollte um ein, während dieses Verhältnis wird voraussichtlich sehr hoch sein für Proteine spezifisch mit dem Zielprotein (CGE1). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Eine Analyse des Eingangs für HSP70B Immunpräzipitation. Gesamtprotein wurde aus löslichen (Sol) und der Membran angereichert (Pel) Fraktionen entweder aus ATP (-ATP) abgereichert oder angereichert mit ATP und einem ATP-regenerierenden Systems (+ ATP) extrahiert. 0,01% der Protein-Extrakte wurden auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, und die Höhe der HSP70B und CGE1 Protein relativ zu Verladesteuerung CF1β wurden durch Immunoblotting analysiert. Analyse B Immunpräzipitaten. HSP70B aus 14 wurde immunpräzipitiert N-und15 N-markierten löslichen und Membran-angereicherten Zellextrakte enthalten oder fehlt ATP. Proteine entsprechend 3,3% der Immunpräzipitate wurden auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel und Ebenen der HSP70B und CGE1 relativ zu Verladesteuerung CF1β durch Immunoblotting analysiert wurden getrennt. Hier eine größere Zahl anzuzeigen .
Abbildung 3. Ein Repräsentative Massenspektren HSP70B und CGE1 Peptide aus anti-HSP70B Immunpräzipitate auf gemischten löslichen Fraktionen (14 N-ATP / 15 N + ATP) durchgeführt. Voll MS-Spektren von 14 N und 15 N markierten Peptiden, entsprechend der +-ATP und ATP Zuständen bzw. von HSP70B et immunpräzipitierten CGE1 gezeigt. Beide Peptide dreifach geladen sind, enthält das Peptid HSP70B 22 Stickstoffatome, die CGE1 Peptide 19, entsprechend einer Verschiebung der Masse 7,33 und 6,33 m / z sind. B Repräsentative Massenspektren aus dem reziproken Experiments (14 N + ATP / 15 N-ATP). Vollständiges MS-Spektren der gleichen 14 N und 15 N markierte Peptide, hier entsprechend dem + ATP und ATP-Zuständen bzw. von HSP70B et immunpräzipitierten CGE1 gezeigt. Hier eine größere Zahl anzuzeigen .
Discussion
Eine Vernetzung Schritt zur Erfassung transienter Protein-Protein-Interaktionen (QUICK-X), und eine Steuereinheit Niederschläge für ungleiche Niederschläge Wirkungsgrade 6 normalisieren: Wir haben vor kurzem zwei Verbesserungen an der QUICK Ansatz eingeführt. Hier haben wir ein Protokoll, das zwei weitere Verbesserungen der QUICK präsentieren: Zunächst ersetzen wir SILAC 5 für 15 N metabolische Markierung. Die Vorteile sind, dass 15 N metabolische Markierung viel billiger als SILAC ist, wenn 15 N als einfache anorganische Salz versehen ist. Weiterhin mit 15 N metabolische Markierung QUICK können Organismen prototrophen für alle Aminosäuren angewendet werden, wie die meisten Pflanzen, Pilzen und Bakterien. Und schließlich ist Arginin-zu-Prolin Interkonversion inhärent SILAC 5,6 kein Problem für die Quantifizierung von 15 N markierten Peptiden. Beispiele für geeignete Instrumente für die quantitative Auswertung von 15 N Proteomik-Daten sind MSQUANT 12 oder IOMIQS 13.
Zweitens stellen wir Affinität Modulation als Mittel zur gezielten Verringerung der Menge an Proteinen Interagieren mit einer gegebenen Zielproteins in einer Probe gegenüber einem anderen. Die Vorteile dieser Vorgehensweise sind, dass sie den Bau von Knockdown-Mutanten, die für einige Modellsysteme sind schwer zu erzeugen oder gar nicht bei wesentlichen Zielproteine erzeugt werden umgeht. Ferner vermeidet sie Fehlinterpretationen durch differentielle Proteinexpression eventuell auftretende als Antwort der Zelle auf Klopfen Niederhalter ein Zielprotein verursacht: wenn andere Proteine herabreguliert sind so gut und mit dem Antiserum für die Immunpräzipitation eingesetzt kreuzreagieren, würden sie interpretiert werden als wahr Interaktionspartner des Zielproteins. Endlich hebt Affinität Modulation die Notwendigkeit der Suche nach einem geeigneten Antikörper-to-Antigen-Verhältnis.
Obwohl wir unser Protokoll Chlamydomonas reinhardtii als Modellorganismus, Kann es leicht zu einem anderen Organismus, in Zellkultur gezüchtet werden können und in der Lage ist Ammonium oder Nitrat als Stickstoffquelle zu verwenden angepasst werden. Affinität Modulation von Proteinkomplexen durch ATP / ADP kann direkt an andere Chaperone, deren Wechselwirkung mit Substraten und Kohorte Proteine hängt vom ATP Zustand aufgetragen werden, wie die GroEL/HSP60/Cpn60 oder HSP90 Chaperonsysteme 14,15, oder zu einem anderen System, bei dem Bindungsaffinitäten sind moduliert durch ATP. Affinität Modulation sollte auch für Fälle, in denen Affinitäten zwischen Protein-Wechselwirkungen durch spezifische Medikamente, wie Radicicol oder Geldanamycin im Fall von HSP90-Systeme 15 verändert werden arbeiten.
Eine klare Beschränkung unserer Protokoll ist, dass es erfordert affinitätsgereinigten Antikörper gegen ein Zielprotein bekanntlich empfindlich auf eine spezifische Behandlung / Medikament, seine Affinität für Partner Proteine moduliert. Daher ist es nicht Hochdurchsatzverfahren.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Olivier Vallon für den Antiserum gegen CF1β. Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft und Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (Systems Biology Initiative FORSYS, Projekt GoFORSYS) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ProteinA Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| DMP (Dimethyl pimelimidate) | Sigma-Aldrich | D8388 | Store desiccated at -20 °C, dissolve directly before use |
| Protease inhibitor (complete, EDTA-free) | Roche Applied Science | 11873580001 | |
| ATP (Adenosin-5'-triphosphat) | Carl Roth | K054 | |
| Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | 27920 | |
| Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C7886 | |
| DSP Dithiobis [succinimidyl propionate] | Thermo Sientific | 22585 | Store desiccated at 4 °C |
| 15NH4Cl | Cambridge isotope laboratories, Andover, MA | NLM-467 | |
| Lys-C (Endoproteinase Lys-C) |
Roche Applied Science | 11047825001 | |
| Trypsin beads (Poroszyme Immobilized Trypsin) | Applied Biosystems | 2-3127-00 | Mix vigorously directly before use |
| Empore C18 47 mm Disk | Varian | 12145004 |
References
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