En protokoll for identifikasjon av protein-protein interaksjoner Basert på Published: September 24, 2012 doi: 10.3791/4083

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Stefan Schmollinger^1,2, Daniela Strenkert^1,2, Vittoria Offeddu^1,2, André Nordhues^1,2, Frederik Sommer^1,2, Michael Schroda^1,2

¹Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, ²University of Kaiserslautern

Summary

Vi presenterer en variant av den QUICK (kvantitativt Immunoutfelling Kombinert med Knockdown) tilnærming som ble introdusert tidligere å skille mellom sanne og falske protein-protein interaksjoner. Vår tilnærming er basert på

Abstract

Protein-protein interaksjoner er grunnleggende for mange biologiske prosesser i cellen. Derfor spiller deres karakterisering en viktig rolle i dagens forskning og en mengde metoder for deres undersøkelse er tilgjengelig ^1. Protein-protein interaksjoner ofte er svært dynamisk og kan avhenge subcellulære lokalisering, post-translasjonelle modifikasjoner og det lokale proteinet miljøet ^2. Derfor bør de undersøkes i sitt naturlige miljø, som co-immunoutfelling tilnærminger er metoden for valg ^3. Co-utfelte interaksjonspartnere identifiseres enten ved immunoblotting på en målrettet tilnærming, eller ved massespektrometri (LC-MS/MS) i en vilkårlige måte. Den sistnevnte strategi ofte er ugunstig påvirket av et stort antall falske positive funn, hovedsakelig avledet fra den høye følsomheten til moderne massespektrometre som trygt oppdage spor av uspesifikt fellingskjemikalier proteiner. En recent tilnærming å overvinne dette problemet er basert på ideen om at reduserte mengder av spesifikke interaksjonspartnere vil co-presipitat med en gitt målprotein hvis cellulære konsentrasjonen reduseres med RNAi, mens mengder av uspesifikt fellingskjemikalier proteiner bør være upåvirket. Denne tilnærmingen, kalt QUICK for kvantitative Immunoutfellingsanalyse Kombinert med Knockdown ^4, sysselsetter stabile isotoper Merking av aminosyrer i cellekultur (SILAC) ⁵ og MS å kvantifisere mengder proteiner immunoutfelt fra villtype og knock-down stammer. Proteiner som finnes i forholdet 1:1 kan betraktes som forurensninger, de anriket på presipitater fra villtype som bestemte interaksjonspartnere av målproteinet. Selv innovative, bærer QUICK noen begrensninger: For det første, er SILAC kostnadskrevende og begrenset til organismer som ideelt er auxotrop for arginin og / eller lysin. Videre, når bygg arginin mates, arginin-til-prolin interkonversjon resultater i additional massen turnus for hver prolin i et peptid og litt dilutes tung med lys arginin, som gjør kvantifisering mer langtekkelig og mindre nøyaktige ^5,6. Sekund, krever rask at antistoffer titreres slik at de ikke blir mettet med mål protein i ekstrakter fra knock-down mutanter.

Her introduserer vi en modifisert QUICK protokoll som overvinner de ovennevnte begrensningene QUICK ved å erstatte SILAC for ¹⁵ N metabolsk merking og ved å erstatte RNAi-mediert banke ned for affinitet modulering av protein-protein interaksjoner. Vi viser anvendelsen av denne protokollen ved hjelp av den encellede grønnalgen Chlamydomonas reinhardtii som modell organisme og kloroplast HSP70B anstand som målprotein ⁷ (figur 1). HSP70s er kjent for å samhandle med bestemte co-anstand og underlag bare i ADP staten ^8. Vi utnytte denne egenskapen som et middel for å kontrollere den spesifikkeinteraksjon HSP70B med sin nukleotid utveksling faktor CGE1 ^9.

Protocol

1. Antistoff Adsorpsjon

1. Vei ut 120 mg av protein A Sepharose i en 15-ml konisk rør (Falcon). Som 15 mg Protein A sepharose er nødvendig for hver immunoutfelling (IP) dette beløpet er tilstrekkelig for 8 IP-adresser. Tilsett 5 ml 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4) og la protein A Sepharose svelle i 30 minutter ved 4 ° C.

(Merk at alle trinn fra dette punktet må utføres med hansker for å unngå forurensning med keratin og på is for å unngå proteinnedbrytingen / kompleks dissosiasjon.)

2. Sentrifuger i 60 sek ved 1000 xg og 4 ° C for å pelletere den svellede Protein A Sepharose. Forsiktig fjerne supernatanten og resuspender perlene i 5 ml 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4). Gjenta dette trinnet tre ganger for å vaske perlene grundig.
3. Etter siste sentrifugering trinnet fjerne supernatant og la det være cirka 0,5 ml fosfatbuffer. Legg 0,9 ml 0,5 M fosfatbuffer (pH 7,4), 400pl affinitetsrenset primære antistoffer (50 ul per IP) mot målproteinet (her HSP70B), og 16 pl antistoffer mot en kontroll protein (her CF1β). Fyll opp med DDH ₂ O til et totalt volum på 5 ml.

(Merk at affinitetsrenset antistoffer bør brukes for å redusere forurensning av uspesifikke IgG, som interfererer med nano-LC-MS-analyse - for en protokoll se Willmund m.fl. (2005) ¹⁰ CF1β utfelles som en lasting kontroll og ble valgt.. fordi det er rikelig og etter cellelyse, stede i løselige og membran fraksjoner. Alternativt kan nivåer av kontaminerende proteiner bli brukt til å normalisere for ulik belastning.)

4. Tillat Protein A Sepharose-kuler til å adsorbere IgG under en 1-timers inkubasjon ved 25 ° C på et rør valse (CAT RM5W, 36 rpm).
5. Sentrifuger i 60 sek ved 1000 xg og 4 ° C for å pelletere protein A Sepharose-kuler. Fjern forsiktig supernatanten og resuspend perlene i 5 ml 0,1 M natriumborat-buffer (pH 9,0). Gjenta dette trinnet tre ganger for å grundig fjerne aminer som ville slukke tverrbindingsmiddelet.
6. Vei opp 25,9 mg av fersk, solid dimethylpimelimidate og resuspender den i 5 ml 0,1 M natriumborat-buffer (pH 9,0) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 20 mM. Legge dette løsningen til protein A Sepharose-kuler.
7. Tillat IgG å tverrbinde til protein A i 30 minutter ved 25 ° C på et rør valse.
8. Sentrifuger i 60 sek ved 1000 xg og 4 ° C for å pelletere perlene. Forsiktig fjerne supernatanten og resuspender perlene i 5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5) for å slukke fri tverrbinder. Gjenta dette én gang og inkuber i 2 timer ved 25 ° C eller 12-24 timer ved 4 ° C på et rør valse.
9. Valgfritt: hvis protein A Sepharose-kuler koblet til IgG ikke direkte brukes til IP, lagring for opp til en uke er mulig. For dette, sentrifuger i 60 sek ved 1000 xg og 4 ° C for å pelletere perlene, fjern forsiktig supernatant og resuspender perler i 5 ml 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,5) inneholdende 0,02% natriumazid og oppbevar ved 4 ° C inntil videre bruk.

2. Cellelyse, Crosslinking og Prøvepreparering

1. Vokse to Chlamydomonas kulturer i medium inneholdende 7,5 mM ¹⁴ _NH4Cl eller ¹⁵ _NH4Cl som nitrogenkilde til en tetthet på ~ 5 x 10 ⁶ celler / ml. Cellene trenger for å passere gjennom minst ti generasjoner for full merking. Her, ble cellene dyrket photomixotrophically i TAP medium ¹¹ på en roterende rister ved 25 ° C under kontinuerlig bestråling med hvitt lys (30 μE m ^-2 s ^-1).
2. Overfør to alikvoter hver på ¹⁴ N-og ¹⁵ N-merkede celler til fire GSA rør og høste celler av en 4-min sentrifugering ved 4000 xg og 4 ° C (cellenummer høstes for hver alikvot avhenger cellulære konsentrasjonen av målet protein og må bestemmes empirically på forhånd for å sikre at tilstrekkelig målprotein er utfelt. Et godt utgangspunkt er 10 ⁹ celler pr alikvot, dvs. 200 ml av en kultur med 5 x 10 ⁶ celler / ml.)
   For kryssbinding bare: i tilfelle protein komplekser blir tverrbundet før IP, celler må vaskes for å fjerne aminer tilstede i mediet. For dette, resuspender cellene i 40 ml på forhånd avkjølt KH buffer (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 80 mM KCl) og overføre dem til 50-ml Falcon-rør. Sentrifuger i 60 sek ved 1000 xg og 4 ° C. Gjenta dette trinnet gang.
3. Resuspender celler i 2 ml lyseringsbuffer (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 1 mM MgCl _2, 10 mM KCl, 154 mM NaCl) pre-avkjølt til 4 ° C og overføre dem til 15-ml Falcon-rør. Samle gjenværende celler i GSA rør med ytterligere 1 ml lyseringsbuffer hver. Tilsett 50 pl 25 x proteasehemmer og 12,5 pl 1 M MgCl ₂ (til en endelig konsentrasjon på 3,5 mM) til hver alikvot.
4. Legg til 150pl lysebuffer, 12,5 pl 1 mM ATP, 833 pl 270 mM kreatinfosfat og 7 pl 5 ug / ul kreatinfosfokinase (den endelige konsentrasjon er 2,5 mM ATP, 45 mM kreatinfosfat, og 7 ug / ml kreatinfosfokinase) til en av de aliquoter inneholdende ¹⁴ N-og ¹⁵ N-merkede celler (disse er på + ATP aliquoter).
5. Legg 930 pl lysebuffer og 70 pl 1 U / pl apyrase til andre alikvoter inneholdende ¹⁴ N-og ¹⁵ N-merkede celler (disse er de-ATP alikvoter).
6. Inkuber i 2 min ved 25 ° C på et rør valse å etablere ATP-utarme og ATP-replete stater. Hvis tverrbindingen trinnet utelates, legge til et 1 ml lyseringsbuffer.
   For kryssbinding bare: i tilfelle undersøkte protein-protein interaksjoner er forbigående er det tilrådelig å ta dem ved en tverrbinding trinn. For dette, tilsett 500 pl 20 mM ditio-bis (succinimidyl propionat) (DSP) oppløst i DMSO (sluttkonsentrasjon er 2 mM) til each tube direkte før sonikering.
7. Sonicate fire ganger 20 sek på isen å bryte celler med 20-sek pauser i mellom for kjøling. (Vi bruker Bandelin Sonoplus HD2070 med en KE76 tips på effektstyring av 75% og driftssyklus på 60%. Må de nødvendige innstillingene for andre maskiner / enheter / tips skal fastsettes på forhånd for å sikre fullstendig cellelyse og for å unngå søl. )
   For kryssbinding bare: tillate protein komplekser å tverrbinde ved inkubering i 1 time ved 4 ° C på et rør valse. Etter kryssbinding, supplere hvert rør med 500 pl 1 M glycin og inkuber på en tube valse i 15 min ved 4 ° C for å slukke fri tverrbinder.
8. Forbered fire 6-ml sukrose puter (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 0,6 M sukrose) i SW41 Ti tynnvegget rør (Beckman Coulter Item No: 344059), nøye lå hele ~ 5,5 ml cellelysater på sukrose puter (balanse med Lysis buffer) og sentrifuger i 30 minutter ved 200.000 xg og 4 ° C i en SW41 Ti rotor.
9. Overfør toppen av gradient inneholdende oppløselige protein komplekser inn i fire 15-ml Falcon rør (unngå overføre deler av sukrose pute), tilsett 350 pl 10% Triton X-100 til en sluttkonsentrasjon på 0,5% til hver av dem, bland forsiktig og legge Lysis buffer til et totalt volum på 7 ml hver.
   (Overføring 70 ul av hver oppløselig celleekstrakt til ferske 1,5 ml koniske rør (Eppendorf-rør) og legge 70 pl 2 x SDS-prøvebuffer (4% SDS, 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20% glycerol, 10 % 2-merkaptoetanol) for hver for SDS-PAGE og immunoblot-analyser.)
10. Kast sukrosen puter og resuspender membranegenskapene pellets i 3 ml lyseringsbuffer hver. Legg til hver 1 ml 10% Triton X-100 til en sluttkonsentrasjon på 2%, sonicate på isen å oppløse pellets, og legge Lysis buffer til et totalt volum på 5 ml hver.
11. Forbered ytterligere fire 6-ml sukrose puter i SW41 Ti tynnveggede rør, lå ~ 5 ml solubilisert membraner fra trinn 2,10 forsiktig på sukroseputer, og sentrifuger i 30 minutter ved 200.000 xg og 4 ° C i en SW41 Ti rotor.
12. Overfør toppen av gradient inneholdende membranprotein komplekser inn i fire 15-ml Falcon rør og legge lyseringsbuffer (inneholdende 2% Triton X-100) til et endelig volum på 7 ml hver. (Overføring 70 ul av hver oppløselig celleekstrakt til frisk Eppendorf-rør og legge 70 pl 2 x SDS-prøven til hver for SDS-PAGE og immunoblot analyser.)

3. Immunoutfelling

1. Pelletere protein A Sepharose-kuler inneholdende koblede antistoffer (fra trinn 1,8 eller 1,9) av en 60-sek sentrifugering ved 1000 xg og 4 ° C, fjern forsiktig supernatanten og resuspender perler i 4 ml lyseringsbuffer. Gjenta dette trinnet to ganger for å stabilisere kuler i Lysis buffer.
2. Fyll opp til 8 ml med lyseringsbuffer og overføre 1 ml av suspensjonen på hver av de åtte 15-ml Falcon rør inneholdende oppløselige eller membran protein komplekser fra ATP-replete og ATP-deplete ¹⁴ 15 N-merkede celler (fra trinn 2.9 og 2.12).
3. Inkuber i 2 timer ved 4 ° C på et rør valse å utfelle protein komplekser.
4. Pellet perlene ved en 60-sek sentrifugering ved 1000 xg og 4 ° C og kastes supernatantene. La et lite volum av væske på toppen av perlene for å lette overføringen.
5. Overfør perler fra hver Falcon rør til 1,5 ml konisk rør (Eppendorf rør). Å samle alle gjenværende perler i Falcon rør, til en annen 0,8 ml lyseringsbuffer inneholdende 0,1% Triton til hver, vortex forsiktig, sentrifuger i 60 sek ved 1000 xg og 4 ° C og overføre bufferen med gjenstående perler til Eppendorf-rør. Tube utveksling er nødvendig for å hindre forurensing fra proteiner følger de plast vegger.
6. Pellet perlene ved en 15-sek sentrifugering ved 16.100 xg og 4 ° C, fjern forsiktig supernatantene og resuspender perler i 1,3 ml lyseringsbuffer inneholdende 0,1% Triton. Gjenta dette trinnet to ganger med lysis buffer inneholder Triton og to ganger med lyseringsbuffer mangler Triton å grundig vaske perlene. La et lite volum av væske på toppen av perlene for å lette overføringen.
7. Igjen overføre perler til ferske 1,5 ml Eppendorf-rør for å fjerne proteiner følger de plast vegger. Vask de gamle rørene med 1 ml lyseringsbuffer mangler Triton og overføre alle gjenværende perler til de friske rør.
8. Sentrifuger i 15 sek på 16.100 xg og 4 ° C, fjern supernatantene første med en normal pipette, og deretter fjerne eventuelle gjenværende supernatant helt med en 50-ul Hamilton sprøyte.

4. Prøveopparbeidelse for nano-LC-MS/MS

1. Tilsett 100 pl ferskt tilberedte elueringsbuffer (8 M urea, 25 mM NH ₄ HCO ₃₎ til hvert rør, benytte 100 pl elueringsbuffer å vaske perlene stikker til Hamilton sprøyte og inkuber i 10 min i en Thermomixer ved 800 opm og 65 ° C, og for en annen 20 minutter ved 30 ° C. (En mye mer kompletteluering av bundne proteinene oppnås ved eluering med 2% SDS og påfølgende utfelling med 80% aceton.)
2. Sentrifuger i 15 sek på 16 100 xg og 25 ° C. Overføre supernatanter til ferske rør med en 50-ul Hamilton sprøyte.
3. Tilsett 50 pl elueringsbuffer til perlene, bruke 50 pl elueringsbuffer å vaske perlene stikker til Hamilton sprøyte og gjenta inkubering og sentrifugering trinn 4,1 og 4,2, respektivt. Pool de respektive eluatene.
   (Overføring 30 pl av de eluatene til ferske Eppendorf-rør, tilsett 30 pl 2 x SDS-prøvebuffer for hver for SDS-PAGE og immunoblot-analyser.)
4. Kombiner eluerte utfellinger fra + /-ATP-behandlet, ¹⁴ N-og ¹⁵ N-merket løselig og membran proteiner som følger:
   120 ul ¹⁵ N / + ATP og 120 ul ¹⁴ N /-ATP
   120 ul ¹⁴ N / + ATP og 120 ul ¹⁵ N /-ATP
   120 ul ¹⁵ N / + ATP og 120 ul ¹⁴ N /-ATP <br /> 120 ul ¹⁴ N / + ATP og 120 ul ¹⁵ N /-ATP
5. Tilsett 1,5 pl tilberedes 1 M DTT til en endelig konsentrasjon på 6,5 mM til hver av de fire kombinasjoner å redusere disulfidbindinger (inkludert de i tverrbindingsmiddelet) og inkuber i 30 minutter ved 25 ° C.
6. Tilsett 10,5 pl tilberedes 0,6 M jodacetamid til en endelig konsentrasjon på 25 mM til carboxymethylate reduserte tioler og inkuber i 20 min ved 25 ° C i mørke.
7. Legg 256 pl 40 mM NH ₄ HCO ₃ og 4 pl Lys-C (0,1 ug / ul), sel rør med parafilm og inkuberes i minst 16 timer over natten på en rotasjon hjulet ved 37 ° C.
8. Legg 470 pl 20 mM NH _{4 3} HCO, 10 pl 100% acetonitril (til en endelig konsentrasjon på 1%) og 8 ul trypsin perler, og inkuber på en rotasjon hjulet for minst 16 timer ved 37 ° C.
9. Sentrifuger i 5 min ved 16100 xg og 4 ° C, og overfør supernatanter til frisk 2-ml Eppendorf karetes. Vask de gamle rør med 50 pl 20 mM _{NH4 3} HCO, 0,5% eddiksyre, og et basseng med første supernatanter.
10. For avsalting, forberede hjemmelaget C _18-StageTips ved å kutte ut to plater fra Empore C ₁₈ materiale med en sprøyte nål og plassere dem i en 200-ul pipettespiss. På denne måten forberede fire 200-ul tips. Hull i lokkene av fire 2-ml Eppendorf-rør og sette inn tips.
11. Forutsetning C _18-StageTips med 50 ul løsning B (80% acetonitril, 0,5% eddiksyre). Sentrifuger i 3 min ved 800 g og 25 ° C.
12. Stabilisere C _18-StageTips med 100 ul løsning A (0,5% eddiksyre, 2% acetonitril). Sentrifuger i 3 min ved 800 g og 25 ° C. Gjenta dette trinnet gang.
13. Last 100 ul av supernatantene fra tryptisk digestions (4.9) på C _18-StageTips og sentrifuger i 3 min ved 800 g og 25 ° C. Gjenta dette trinnet til de komplette supernatanter ble brukt tilkolonnene.
14. Vask C _18-StageTips med 100 ul løsning A. Sentrifuger i 3 min ved 800 g og 25 ° C. Gjenta dette trinnet to ganger.
15. Eluere Tryptisk peptider til en frisk 1,5 ml Eppendorf-rør med 50 ul løsning B. Sentrifuger i 3 min ved 800 g og 25 ° C. Gjenta dette trinnet gang. Tørre peptider til ferdigstillelse i en hastighet vac.
16. Valgfritt: seal Eppendorf rør med parafilm og oppbevar ved -80 ° C inntil videre bruk.
17. Resuspender de tørkede peptider med 20 ul løsning A og inkuberes i minst 1 time på is, avbrutt av to 15-min inkubasjoner i en sonikator bad. Sentrifuger i 20 minutter ved 16 100 xg og 4 ° C, og gjelder supernatant til nano-LC-MS/MS.

5. Representant Resultater

Som vist exemplarily for ¹⁴ N-merkede celle ekstrakter i figur 2A, er HSP70B og CGE1 nesten utelukkende lokalisert til den oppløselige fraksjon, uavhengig av ATP staten. Ikontrast CF1β er lokalisert til oppløselige og membran-beriket fraksjoner, som sonikering shears del av det fra membran beligget CF _o, og derfor tjener som lasting kontroll for begge fraksjoner. Som vist på figur 2B, ble tilsvarende mengder HSP70B utfelt med anti-HSP70B antistoffer fra ¹⁴ N-og ¹⁵ N-merkede oppløselige ekstrakter, uavhengig av ATP staten. I kontrast, ble bare litt HSP70B utfelt fra membran fraksjoner med litt større mengder stammer fra ATP-utarmet membran fraksjoner i forhold til ATP replete fraksjoner, derav bekreftende tidligere resultater ^9. Ingen CGE1 var co-utfelt med HSP70B i ATP-replete løselige eller membran fraksjoner, mens store mengder CGE1 samtidig var utfelt med HSP70B fra ATP-utarmet løselig fraksjoner, og litt fra ATP-utarmet membran fraksjoner.

Samspillet av CGE1 med HSP70B bare i ADP tilstanden er også observert iMS-analyse: i Figur 3, MS1 representativt spektra av HSP70B og CGE1 peptider fra utfellinger generert med HSP70B antiserum fra løselige celle ekstrakter vises. I eksperimentet vist i figur 3A, utfellinger var fra blandinger av ¹⁴ N-merkede ekstrakter mangler ATP og ¹⁵ N-merket ekstrakter inneholdende ATP. Mens de tunge og lette merket form av HSP70B peptidet ble påvist ved samme intensitet, ble bare lys merket form av den CGE1 peptid (fra-ATP ekstrakter) funnet. I Figur 3B samme peptider fra den anti-HSP70B bunnfall avledet fra blandinger av gjensidig merkede oppløselige celle ekstrakter vises. Følgelig, denne gangen bare den tunge merket form av CGE1 peptid (fra-ATP utdrag) ble oppdaget, mens dette var igjen tilfellet for begge, lette og tunge merket HSP70B peptider.

<strong> Figur 1. Eksperimentelle arbeidsflyt. Cellene metabolsk merket med ¹⁴ N og ¹⁵ N i minst 10 generasjoner, høstet og leveres med eller utarmet fra ATP. Etter cellelyse protein komplekser eventuelt kan være tverrbundet (X-link) med DSP. Lyserte cellene blir deretter separert i løselig (Sol) og membran beriket (PEL) fraksjoner. Target proteiner (her HSP70B) og en kontrollgruppe protein (her CF1β) er immunoutfelt med spesifikke antistoffer koblet til protein A Sepharose-kuler (svart). Etter vasking, blir utfelte proteiner eluert og enten direkte analysert ved immunoblotting, eller de respektive ¹⁴ N-og ¹⁵ N-merket fraksjoner i + ATP og-ATP statene samles, spaltet og analysert ved nano-LC-MS/MS. I eksemplet tilfellet vist her ¹⁵ N-merket fraksjon ble utarmet fra ATP. Følgelig er forholdet intensiteter av tunge merket (mørke farger) for å tenne merket (lyse farger) peptider fra kontrolltårnet proteinet(CF1β), målet protein (HSP70B) og ikke-spesifikt bundet forurensninger bør være rundt ett, mens dette forholdet er forventet å være svært høy for proteiner spesifikt samspill med målet protein (CGE1). Klikk her for å se større figur .

Figur 2. En analyse av den inngang for HSP70B immunoutfelling. Total protein ble ekstrahert fra løselig (Sol) og membran anriket (PEL) fraksjoner enten utarmet fra ATP (-ATP) eller suppleres med ATP og en ATP regenererende system (+ ATP). 0,01% av proteinekstrakter ble separert på en 10% SDS-polyakrylamidgel, og nivåene av HSP70B og CGE1 protein i forhold til lasting kontroll CF1β ble analysert ved immunoblotting. B Analyse av immunoutfellinger. HSP70B ble immunoutfelt fra ¹⁴ N-og¹⁵ N-merket oppløselig og membran-beriket celle ekstrakter inneholder eller mangler ATP. Proteiner tilsvarende 3,3% av immunoutfellinger ble separert på en 10% SDS-polyakrylamidgel og nivåer av HSP70B og CGE1 forhold til lasting kontroll CF1β ble analysert ved immunoblotting. Klikk her for å vise større figur .

Figur 3. En representant massespektra av HSP70B og CGE1 peptider fra anti-HSP70B immunoutfellinger utført på blandede oppløselige fraksjoner ⁽¹⁴ N-ATP / ¹⁵ N + ATP). Full MS spektra av ¹⁴ N og ¹⁵ N merket peptider, som tilsvarer den-ATP og + ATP stater, henholdsvis fra HSP70B og co-immunoutfelt CGE1 vises. Begge peptider er triply ladet, inneholder HSP70B peptidet 22 nitrogenatomer, de CGE1 pept19 IDE, tilsvarende en masse forskyvning av 7,33 og 6,33 m / z, hhv. B Representative massespektra fra den resiproke eksperiment ⁽¹⁴ N + ATP / ¹⁵ N-ATP). Full MS spektra av de samme ¹⁴ N og ¹⁵ N merket peptider, her tilsvarer + ATP og-ATP stater, henholdsvis fra HSP70B og co-immunoutfelt CGE1 vises. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Vi har nylig lansert to forbedringer i QUICK tilnærming: en crosslinking trinn for å fange forbigående protein-protein interaksjoner (QUICK-X), og en kontroll nedbør å normalisere for ulike nedbør effektivitet ^6. Her presenterer vi en protokoll som inneholder to flere forbedringer av Quick: for det første erstatter vi SILAC ⁵ for ¹⁵ N metabolsk merking. Fordelene er at ¹⁵ N metabolsk merking er mye billigere enn SILAC hvis ¹⁵ N er gitt som enkel uorganisk salt. Videre med ¹⁵ N metabolsk merking QUICK kan påføres organismene prototrofe for alle aminosyrer, som de fleste planter, sopp og bakterier. Og til slutt, ikke arginin-til-proline interkonversjon iboende til SILAC ^5,6 ikke presentere et problem for kvantifisering av ¹⁵ N merket peptider. Eksempler på egnede verktøy for kvantitativ vurdering av ¹⁵ N proteomikk data er MSQUANT ¹² eller jegOMIQS ^13.

Sekund, introduserer vi affinitet modulasjon som et middel for spesifikt å redusere mengden av proteiner i samspill med en gitt målprotein i en prøve og en annen. Fordelene med denne fremgangsmåten er at det omgår bygging av knockdown mutanter, som for noen modellsystemer er vanskelig å generere eller ikke kan genereres i det hele tatt i tilfelle av essensielle target proteiner. Videre unngår den feiltolkninger forårsaket av differensial protein ekspresjon potensielt oppstått som respons av cellen til banket ned et målprotein: hvis andre proteiner er nedregulert samt og kryssreagerer med antiserumet som brukes for immunoutfelling, ville de tolkes som sanne interaksjonspartnere av målet protein. Endelig, avskaffer affinitet modulasjon behovet for å finne en riktig antistoff til antigen ratio.

Selv om vi bruker vår protokoll til Chlamydomonas reinhardtii som modell organisme, Kan den enkelt tilpasses enhver annen organisme som kan dyrkes i cellekultur og er i stand til å bruke ammonium-eller nitrat som nitrogenkilde. Affinity modulering av protein komplekser av ATP / ADP kan direkte brukes til andre anstand som interaksjon med underlag og kohortstudier proteiner avhenger ATP staten, som de GroEL/HSP60/Cpn60 eller HSP90 anstand systemer ^14,15, eller til et annet system der bindingsaffiniteter er modulert av ATP. Affinity modulasjon bør også arbeide for tilfeller der slektskap mellom protein interaksjoner er endret av bestemte legemidler, som radicicol eller geldanamycin i tilfelle av HSP90 systemer ^15.

En klar begrensning av protokoll vår er at det krever affinitetsrenset antistoffer mot et målprotein kjent for å være følsomme for en spesifikk behandling / stoff som modulerer dets affinitet for partner proteiner. Derfor er det ingen høy-throughput metoden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ProteinA Sepharose	Sigma-Aldrich	P3391
DMP (Dimethyl pimelimidate)	Sigma-Aldrich	D8388	Store desiccated at -20 °C, dissolve directly before use
Protease inhibitor (complete, EDTA-free)	Roche Applied Science	11873580001
ATP (Adenosin-5'-triphosphat)	Carl Roth	K054
Creatine phosphate	Sigma-Aldrich	27920
Creatine phosphokinase	Sigma-Aldrich	C7886
DSP Dithiobis [succinimidyl propionate]	Thermo Sientific	22585	Store desiccated at 4 °C
15NH4Cl	Cambridge isotope laboratories, Andover, MA	NLM-467
Lys-C (Endoproteinase Lys-C)	Roche Applied Science	11047825001
Trypsin beads (Poroszyme Immobilized Trypsin)	Applied Biosystems	2-3127-00	Mix vigorously directly before use
Empore C18 47 mm Disk	Varian	12145004