Summary
يمكن أن يكون ELISA تحويلها بسهولة الى فحص xMAP Luminex و، من خلال الفوائد من الأجسام المضادة، ومضاعفة عدة يمكن عرضه في وقت واحد لتحديد هوية زوج الضد الأمثل، مما أدى إلى زيادة الحساسية ومجموعة ديناميكية، في حين خفض تكلفة الفحص.
Abstract
كان فحص انزيم مرتبط المناعي (ELISA) لفترة طويلة الأداة الرئيسية للكشف عن من analytes من مصلحة في العينات البيولوجية لكل من الأبحاث والتشخيص السريري. ومع ذلك، ELISA له حدود. وعادة ما يتم تنفيذ ذلك في microplate 96-جيدا، والمغلفة الآبار مع الأجسام المضادة الطبيعية، التي تتطلب كمية كبيرة نسبيا من عينة لالتقاط مستضد من الفائدة. يمكن أن مساحة كبيرة من الآبار وملزم مسعور من الأجسام المضادة الطبيعية تؤدي أيضا إلى خلفية غير محددة ملزمة، وزيادة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم ELISAs الاعتماد على انزيم بوساطة تضخيم إشارة من أجل تحقيق حساسية معقولة. تضخيم هذه ليست دائما الخطية ويمكن لنتائج الانحراف وهكذا.
في السنوات ال 15 الماضية، برزت تقنية جديدة تقدم فوائد ELISA، ولكن أيضا تمكن أعلى من الناتج، وزيادة المرونة، وانخفاض حجم العينة، وانخفاض التكلفة، مع التعليم الجامعي مماثلةrkflow 1 و 2. Luminex xMAP التكنولوجيا هي منصة microsphere الصفيف (حبة) تمكين كل من monoplex وفحوصات متعددة والتي يمكن تطبيقها على كل من البروتين وتطبيقات الحمض النووي 3-5. حبات لديهم الأجسام المضادة يجمد تساهمي القبض على أصغر مساحة السطح، وتتطلب قدرا أقل من الأجسام المضادة الطبيعية، وأحجام أصغر العينة مقارنة مع إليسا، وغير محدد وملزم انخفاضا كبيرا. حجم أصغر عينة مهمة عند التعامل مع العينات الحد من مثل السائل المخي الشوكي، السائل الزليلي، الخ 6. الإرسال المتعدد الفحص يقلل من متطلبات حجم العينة، وتمكين نتائج متعددة من عينة واحدة.
التحسن الذي طرأ مؤخرا من قبل Luminex ما يلي: نظام MAGPIX جديدة، أصغر حجما، وأقل تكلفة وأسهل للاستخدام محلل؛ منخفضة التركيز المغناطيسي MagPlex المجهرية التي تلغي الحاجة إلى لوحات مرشح مكلفة وتأتي في تركيز عمل أكثر ملاءمة للتنمية وفحصمنخفضة الإنتاجية التطبيقات، واقتران جسم xMAP مجموعة (اي بي سي)، والذي يتضمن بروتوكول والكواشف والمواد الاستهلاكية الضرورية للاقتران حبات لالتقاط الاجسام المضادة للاهتمام. (راجع المواد قسم للحصول على قائمة مفصلة من محتويات عدة.)
في هذه التجربة، ونحن تحويل فحص ELISA قبل الأمثل لTNF-ألفا خلوى إلى منصة xMAP ومقارنة أداء الطريقتين 7-11. TNF-alpha عبارة عن العلامات البيولوجية المستخدمة في قياس الاستجابات الالتهابية في المرضى الذين يعانون من اضطرابات المناعة الذاتية.
نبدأ من قبل اقتران أربعة أجسام مضادة والقبض على مرشح لأربع مجموعات microsphere أو مناطق مختلفة. عندما مختلطة معا، وهذه المجموعات الأربع تسمح للاختبار في وقت واحد من جميع المرشحين الأربعة مع أربعة أجسام مضادة كشف منفصل لتحديد هذا الزوج أفضل الأجسام المضادة، الكواشف الادخار، وعينة والوقت. هي التي شيدت بعد ذلك اثنين من المقايسات xMAP مع اثنين ازواج الضد الأمثل والأكثر من أدائهامقارنة بما كان عليه من فحص ELISA الأصلية في ما يخص قوة الإشارة، ومجموعة ديناميكية، والحساسية.
Protocol
أولا تحضير الكاشف
- اختيار الأجسام المضادة والتحضير
- التعرف على أجسام مضادة لاستخدامها في هذه التجربة.
- الأجسام المضادة القبض على أربعة: الإنسان محددة لTNF-ألفا، إما وحيدة النسيلة أو بولكلونل؛ جميع الأنواع المضيف نفسه.
- كشف الأجسام المضادة أربعة: الإنسان محددة لTNF-ألفا، غير معدلة سواء، والمعقدة البيروكسيديز، أو PE مترافق.
- واحد الأجسام المضادة تأكيد: PE-مترافق ومحددة لهذا النوع مجموعة من الأجسام المضادة الطبيعية.
- إعادة جميع الأجسام المضادة للتركيز الشركة المصنعة التي توصي بها العمل.
- حدد أربع عبوات من مجموعات قليلة MagPlex التركيز (حبة) microsphere أو المناطق، على سبيل المثال، أرقام جزء Luminex MC10012-ID، MC10013 معرف، MC10014 معرف، وMC10015 معرف.
- التعرف على أجسام مضادة لاستخدامها في هذه التجربة.
- اقتران أضداد MagPlex المجهرية، وذلك باستخدام الأجسام المضادة xMAP (ABC) كيت اقتران
إعادةفر إلى دليل المستخدم مجموعة ايه بي سي نيوز (الجزء # 89-00002-00-319) لإجراء اقتران كاملة. (ملاحظة: يجب حماية المجهرية حساس من الضوء كلما كان ذلك ممكنا.)- جلب كواشف في المجموعة ABC إلى درجة حرارة الغرفة وأنابيب التسمية رد فعل الأربع مع الأرقام منطقة خرزة التي تم اختيارها لرد فعل اقتران. نقل محتويات قارورة أربعة من الخرز MagPlex (1 مل كل أو 2.5 × 10 6 حبات) في أنابيب 4 رد فعل المسمى.
- يغسل كل من مجموعات حبة مرتين في 500 ميليلتر من الاحتياطي تنشيط، كما هو موضح في دليل عدة اي بي سي.
- تفعيل كل مجموعة حبة مع 480 ميكرولتر من العازلة التنشيط، و 10 ميكرولتر من سلفو-NHS، و 10 ميكرولتر من كاشف EDC، وفقا للإجراء في دليل عدة اي بي سي، واحتضان لمدة 20 دقيقة. (ملاحظة: يجب أن يعاد تشكيل EDC كاشف في 250 ميليلتر من الاحتياطي تنشيط السابقة مباشرة لهذه الخطوة)
- كرر الخطوة السابقة مع غسيل الآن المجهرية "تنشيط" ما مجموعه عبتيهه مرات مع 500 ميكرولتر من العازلة التنشيط، كما هو موضح في دليل مجموعة ايه بي سي.
- إعداد أربعة حلول منفصلة، كل منها يحتوي على 7.5 ميكروغرام (أي 3 ميكروغرام / مليون المجهرية) من الأجسام المضادة الطبيعية في تنشيط العازلة.
- إضافة هذه الأجسام المضادة القبض على أربعة حلول لأنابيب من رد فعل منها، دوامة كل أنبوب على الفور، واحتضان لمدة ساعتين على محور دوار.
- كرر الخطوة السابقة مع الغسيل "إلى جانب" المجهرية الآن ما مجموعه ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت غسيل المتضمنة في مجموعة اي بي سي.
- بعد الخطوة غسل النهائي، إضافة 500 مخزن غسيل ميكرولتر إلى كل أنبوب رد فعل لتوفير تركيز الأوراق المالية النهائية من الخرز الأجسام المضادة الديناميكي 5 ملايين دولار في المليلتر. دوامة ويصوتن للأنابيب رد فعل لتفريق المجهرية.
ملاحظة: غمر جزئيا القارورة microsphere مغلقة في نظافة بالموجات فوق الصوتية مملوءة بالماء DI يوفر صوتنة فعالة لجميع الخطوات غسيل. (انظر جدول المواد للبريدتفاصيل quipment.) - تخزين الخرز بالإضافة إلى 2-8 درجة مئوية، ومحمية من الضوء لحين الحاجة إليها.
- تعداد المجهرية المتقارنة
- حساب عدد المجهرية انتشلت بعد رد فعل اقتران باستخدام عداد الخلية أو عدادة الكريات. الرجوع إلى دليل المستخدم الصك عد للللحصول على التعليمات المناسبة للقيام بذلك. الانتعاش من رد فعل اقتران هو عادة أكثر من 90٪.
- اقتران تأكيد
- وكان تأكيد رد فعل اقتران ناجح من خلال إعداد حلول اختبار من أسهم حبة بالإضافة لكل مجموعة، مع تركيز النهائي من 100 الخرز / ميكرولتر في الواق الفحص (PBS مع جيش صرب البوسنة 1٪). إعداد التخفيفات من فيكوإيريترين-(PE-) وصفت لمكافحة أنواع الأجسام المضادة IgG في تأكيد 4 ميكروغرام / مل في الواق الفحص.
- قسامة 50 ميكرولتر من كل حل اختبار في أربعة آبار لوحة مستديرة أسفل 96-جيدا،، أي ما مجموعه 16 بئرا. ثم تضاف 50 μL من الاحتياطي الفحص إلى ثمانية من الآبار، لقياس الخلفية، و 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة تأكيد المخفف في الآبار الثمانية المتبقية.
- مزيج من ردود الفعل من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات مع pipettor متعدد القنوات. تغطية لوحة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على لوحة شاكر.
- وضع لوحة على لوحة فاصل المغناطيسي لمدة 1-2 دقائق لرسم حبات من حل. ثم، وإزالة السائل بواسطة لوحة على عكس بقوة، بينما على الفاصل، أكثر من وعاء النفايات.
- غسل كل بئر مرتين بإضافة 100 ميكروليتر من الاحتياطي الفحص وإزالة طاف من لوحة بطريقة مماثلة باستخدام الفاصل لوحة المغناطيسي.
- Resuspend الخرز في 100 ميكرولتر من العازلة الفحص بواسطة pipetting بلطف صعودا ونزولا خمس مرات مع pipettor متعدد القنوات.
- تحليل على صك xMAP Luminex، مثل الصك MAGPIX. كثافة إشارة فلوري من رد الفعل هذا غير مباشرهذ النسبي لكمية البروتين على السطح من الخرز، وتوفير تقييم سريع للكمية النسبية للبروتين بالإضافة إلى الخرز.
- اقتران البيوتين إلى أجسام غير معدل لكشف
- إذا باستخدام الاجسام المضادة كشف معدلة، biotinylate هذه الأجسام المضادة مع الكاشف فيشر الحرارية سلفو-NHS-LC-EZ-البيوتين وصلة (الفئة رقم PI-21335)، وهذا الإجراء هو موضح في النشرة الداخلية. المعقدة البيروكسيديز مرة واحدة، ويمكن في وقت لاحق كشف الأجسام المضادة يمكن أن توصف مع فيكوإيريترين streptavidin (SA-PE) في فحص (الخطوة III.6.) بحيث يمكن الكشف عنها مع محلل xMAP.
II. فحص الإعداد
- يعد خليط الأولية لجميع المجموعات الأربع حبة بإضافة 10 ميكرولتر من كل إلى 0.96 مل من برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 1٪ (الواق الفحص. انظر مواد الجدول) لتحديد ما الذي هو الأكثر فعالية مع الفحص xMAP.
- إعداد حلول الأجسام المضادة الكشف عن طريق ديلuting كل إلى 1 ميكروغرام / مل في الواق الفحص.
- إعداد البحث والتطوير النظم القياسية بروتين TNF-α في 2000 جزء من الغرام / مل في الواق الفحص.
- تمييع Streptavidin-rPhycoerythrin (SA-PE) (قدم @ 1 ملغ / مل) إلى 8 ميكروغرام / مل في الواق الفحص.
ثالثا. فحص الجسم المضاد
- إضافة 50 ميكرولتر من الخليط microsphere الأجسام المضادة، مضافا إلى كل من 16 بئرا من لوحة Costar 96-جيدا ذهابا وأسفل لفحص فحص.
- إضافة 50 ميكرولتر من العازلة الفحص إلى 8 من الآبار 16، لقياس الخلفية.
- إضافة 50 ميكرولتر من البحث والتطوير أنظمة TNF-α معيار (@ 2000 بيكوغرام / مل) إلى 8 آبار أخرى، لقياس استجابة.
- احتضان لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء، في حين تهتز على فحص لوحة شاكر.
- إضافة 50 ميكرولتر من كل واحد من الأجسام المضادة كشف 4-4 الآبار (2 الخلفية واستجابة 2)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء، في حين تهتز على فحص لوحة شاءكير.
- إضافة 50 ميكرولتر من كاشف SA-PE على جميع الآبار واحتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء، في حين تهتز على فحص لوحة شاكر.
- وضع لوحة على لوحة فاصل المغناطيسي لدقيقة واحدة ثم قم بإزالة السائل بواسطة لوحة على عكس بقوة.
- إضافة 100 العازلة ميكروليتر الفحص لكل من الآبار 16، وضع لوحة على لوحة فاصل المغناطيسي لدقيقة واحدة ثم قم بإزالة السائل بواسطة لوحة على عكس بقوة أثناء الفاصل.
- أضف 100 ميكرولتر من العازلة الفحص لكل من الآبار 16 و قراءة لوحة مع الصك MAGPIX Luminex، مشيرا إلى دليل المستخدم لعملية المناسبة.
- اختيار الزوج الأجسام المضادة التي تلبي قوتك إشارة المطلوب.
رابعا. xMAP الفحص وظيفي
- بعد اختيار أفضل التقاط الأجسام المضادة، تمييع 100 ميكرولتر من أن الأوراق المالية حبة الأجسام المضادة الديناميكي (من الخطوة IB8) إلى 10 مل مع الواق الفحص.
- إضافة 50 ميكرولتر منحبات المخفف إلى 78 بئرا من صفيحتين Costar 96-جيدا جولة القاع. وسوف (78 بئرا × 2 = 156 لوحات الآبار) أن تستخدم كل لوحة لتقييم أداء لكشف الأجسام المضادة المختلفة.
- إعداد منحنى من 12 نقطة القياسية، بدءا من 8000 جزء من الغرام / مل وتنتهي في 4 جزء من الغرام / مل، مع مستوى البحث والتطوير TNF-α الأنظمة. إضافة ستة مكررات 50 ميكرولتر من كل تخفيف إلى كل من لوحات، بالإضافة إلى الآبار 6 مع 50 ميكرولتر من العازلة الفحص لكل منهما، كخلفية، أي ما مجموعه 78 بئرا / لوحة.
- احتضان لوحات لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء، في حين تهتز على فحص لوحة شاكر.
- إضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة أول اكتشاف لجميع الآبار 78 من لوحة 1. كرر لاكتشاف الأجسام المضادة الثانية على لوحة ثانية.
- احتضان لوحات لمدة 30 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء في حين تهتز على فحص لوحة شاكر.
- إضافة ميكرولتر 50 من كاشف SA-PE على جميع الآبار من كل لوحة.
- احتضاناثنين من لوحات لمدة 15 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء في حين تهتز على فحص لوحة شاكر.
- وضع لوحات في لوحة فواصل المغناطيسي لدقيقة واحدة، ثم إزالة السائل بواسطة لوحة على عكس بقوة أثناء الفاصل.
- أضف 100 ميكرولتر من العازلة الفحص لكل من الآبار 78 على لوحات، وضع لوحات في لوحة فواصل المغناطيسي لدقيقة واحدة، ثم إزالة السائل بواسطة لوحة على عكس بقوة.
- أضف 100 ميكرولتر من العازلة الفحص لكل من الآبار 78 على لوحات وتحليلها على صك MAGPIX، مشيرا إلى دليل المستخدم لعملية المناسبة.
خامسا ELISA الفحص
- اتباع الإرشادات المتضمنة في البحث والتطوير أنظمة الإنسان TNF-α/TNFSF1A عدة ELISA DuoSet (R & D الجزء # DY210)، وقياس استجابة الناتجة عن معيار توفيرها مع مجموعة البحث والتطوير. تكرار فحص ELISA أكثر ثلاث مرات، والاستعاضة عن القبض على أنظمة البحث والتطوير واكتشاف نملةibodies مع الأجسام المضادة من الشركات الأخرى. للزوج، والبساطة الأجسام المضادة من قبل بائع (على سبيل المثال، ميليبور التقاط الأجسام المضادة مع الجسم المضاد كشف ميليبور، Abcam التقاط الأجسام المضادة مع الجسم المضاد كشف Abcam، الخ).
- تقييم كل زوج مستقل، كما هو مطلوب في شكل ELISA، مع كل واحد من المعايير الثلاثة بروتين TNF-α.
سادسا. ممثل النتائج
هذا البروتوكول يوضح كيف يمكن تحويلها ELISA نموذجي لمنصة xMAP مع الاستفادة من قدرات متعددة من التكنولوجيا لتحسين سرعة الفحص. كان ELISA المستخدمة في هذا المثال لنخر الورم الإنسان عامل ألفا (TNF-α) DuoSet ELISA عدة من أنظمة R & D (R & D الجزء # DY210).
بالإضافة إلى زوج الأجسام المضادة المنصوص عليها في هذه المجموعة، وجرى تقييم ثلاثة أزواج الأضداد غيرها من مصادر مختلفة (انظر الجدول مواد) في وقت واحد باستخدام منصة xMAP. FOوقد تم تعيين اور من الأجسام المضادة والأجسام المضادة الطبيعية واقترنت إلى MagPlex المجهرية تركيز منخفض. وقد تم تصنيف الدول الاربع الاخرى الأجسام المضادة كما كشف الاجسام المضادة، وثلاثة من التي تم شراؤها والبيوتين إلى جانب والمعقدة البيروكسيديز الرابع كما هو موضح في البروتوكول.
وقد تم اختيار الأجسام المضادة لهذه الدراسة بناء على توافر والبائعين. ومع ذلك، في إعداد العملية، ينبغي اختيار أجسام مضادة تقوم على تفضيل المستخدم الفرد والماضي تجربة أداء مع هذا الجسم المضاد. وعلى الرغم من هذه التجربة لا اختبار مدى صلاحية أحد الأجسام المضادة والأجسام المضادة القبض على الضد مقابل الكشف، ويمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة لهذا الغرض.
وأجريت فحوصات للxMAP Luminex باعتبارها متعددة لتقييم جميع الأجسام المضادة القبض على أربعة في خليط، من خلال الجمع بين أربع مجموعات من TNF-α المجهرية الضد MagPlex الديناميكي. وجرى تقييم الأجسام المضادة الطبيعية مع كل دولة من الدول الأربعكشف الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز على حدة، بحيث يمكن تحديد التفاعل بين الجسم المضاد كشف واحد مع كل واحد من الأجسام المضادة القبض على 4 في وقت واحد. تحديد أربعة فحوصات من هذا القبيل، التي أجريت في موازاة ذلك، التفاعلات بين جميع الأجسام المضادة كشف الأربع مع جميع الأجسام المضادة القبض على أربعة. ويظهر الشكل 1 البيانات المقارنة من هذه المقايسات فحص.
أشارت النتائج إلى أن هذا الزوج الضد من DuoSet أنظمة البحث والتطوير أداء أفضل مع استجابة الناتج في كثافة 6183 الإسفار متوسط (MFI) وحدة سكنية. ولوحظ أيضا أن الأجسام المضادة من الكشف ميليبور (86٪ من استجابة الجسم المضاد زوج R & D) وAbcam (67٪) قدمت ردا معقولا في فحص xMAP، عندما جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة للبحث والتطوير القبض على الأنظمة. إنتاج الأجسام المضادة من التقاط Abcam، ميليبور ونوفوس استجابة اقل من المرغوب فيه في فحص xMAP.
من المهم أن نلاحظ، أن بورتشكل هذه الدراسة ليست بالضرورة لتسليط الضوء على الخلافات بين الأضداد خاصة أو الباعة ولكن لمجرد توضيح أن هناك اختلافات ملحوظة في أدائها عند استخدامها في ظل ظروف مماثلة، وذلك في منصة xMAP يمكن أن تقدم وسيلة فعالة لتقييم هذه الاختلافات.
تم استخدام أنظمة R & D DuoSet بروتوكول للمقارنة بين أزواج الأضداد الأربعة في شكل ELISA. تم استخدام أنظمة البحث والتطوير بروتوكول مع جميع أزواج الأضداد لأنها تعبر عن بروتوكولات ELISA المعتادة المستخدمة على نطاق واسع اليوم، وهذا هو مماثل لالبروتوكولات المستخدمة مع التكنولوجيا xMAP. وأظهرت اختبارات ELISA أن هذا الزوج الضد من أنظمة R & D مرة أخرى أعطت أفضل النتائج (الشكل 2). أنتج هذا الزوج الضد من Abcam أي رد، وأزواج من الأضداد ردود ميليبور ونوفوس متواضع المنتجة.
من أجل تقييم أي اختلاف في التفاعل مع الأجسام المضادة للمعيار، وجميع الأضداد 4تم اختبار أزواج Y مع ثلاثة معايير مختلفة المؤتلف بروتين TNF-α، من ثلاث شركات مختلفة (انظر الجدول مواد). البيانات الموجودة في المعرض 2 الشكل أن المؤتلف المعايير بروتين TNF-α من البائعين 3 اعطت نتائج مماثلة.
تم استخدام بروتين TNF-α من البحث والتطوير أنظمة لتوليد المنحنيات القياسية في ELISA (الجدول 1) والمقايسات xMAP (الجداول 2 و 3). في حين تم إجراء فحص ELISA مع الزوج R & D أنظمة الجسم المضاد، الاستفادة من فحوصات xMAP القبض أنظمة R & D الأجسام المضادة وإما كشف الأجسام المضادة من البحث والتطوير أو أنظمة ميليبور. وقد تضعف بروتين TNF-α من أنظمة R & D لإنتاج مجموعة من تركيزات 8000-4 بيكوغرام / مل. تنتج سوى الزوج الضد من أنظمة R & D النتيجة المتوقعة في فحص xMAP، مع استجابة> 20000 مؤسسة التمويل الأصغر، كما هو مبين في الجدول رقم (2) والشكل 3. عندما تم استخدام الأجسام المضادة الكشف من ميليبور مع الفحص xMAP في مكان من الجسم المضاد R & D الكشف عن أنظمة (الجدول 3)، واستجابة (6،000 MFI) وكان حوالي 30٪ من الاستجابة التي تم الحصول عليها مع الجسم المضاد كشف من البحث والتطوير الأنظمة، كما هو مبين في الشكل 3.
البيانات الواردة في الجدول رقم 1 يمثل منحنى القياسية لإليسا، والتي كان لها الشركة الصانعة أوصى TNF-α مجموعة من 16 حتي 1000 جزء من الغرام / مل. كان محدودا جدا هذا النطاق لأن التطوير التنظيمي في 1000 جزء من الغرام / مل كان أكبر قليلا من وحدات التطوير التنظيمي (2) ومقياس الطيف غير قادر على قياس أكثر من 3 OD. بسبب الحد مع طيفي، لم يكن من الممكن زيادة مدى فحص ELISA أخرى. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البيانات في الجدول رقم 1 يشير إلى أن البحث والتطوير أنظمة DuoSet ELISA ليست قادرة على اكتشاف TNF-α بتركيزات أقل بكثير من 16 جزء من الغرام / مل. من ناحية أخرى، فإن فحص xMAP قادر على قياس آثافةجي TNF-α بتركيز أقل من 7.8 جزء من الغرام / مل مع الضد من القبض على البحث والتطوير جنبا إلى جنب مع أنظمة كشف الأجسام المضادة من أنظمة R & D أو ميليبور.
ويتضح على نحو أفضل مجموعة ديناميكية وحساسية كلا الأسلوبين عندما المرسومة في نطاق السجل، سجل (الشكل 4). ويمكن الاطلاع على تمييز واضح بين المنحدر من الردود والردود ELISA من المقايسات xMAP التي تشير إلى مزيد من الحد من قدرة أكثر للكشف عن TNF-α مع إليسا، في كل من تركيزات أعلى وأدنى.
ويقترب من حدود الكشف (اللد) لاثنين وظيفي المقايسات xMAP TNF-α عن طريق تحديد أدنى TNF-α تركيز بمستوى استجابة لاحظ (MFI) أكبر من الخلفية، بالإضافة إلى ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري (SD). لتحقيق دلالة إحصائية، وستة مكررات كانت تستخدم لتحديد SD لأساليب كل من xMAP وإليسا. تسا تقديرات (ه) من اللد متفائلون وتهدف إلى توفير "أفضل حالة" سيناريو، مع العلم أن في ظروف التشغيل العادية سوى اثنين أو ثلاثة مكررات وسوف تستخدم. في الجدول رقم 2، ويمكن لوحظ أنه عند استخدام هذا الزوج أنظمة البحث والتطوير، أدنى TNF-α تركيز على 3.91 جزء من الغرام / مل ينتج استجابة من 66 مؤسسة التمويل الأصغر، والذي هو أكبر من الاستجابة للخلفية + 3SD، وتلبية هذه المعايير . وكان الحد الأقصى من كشف عندما تم استخدام الأجسام المضادة كشف ميليبور مع الجسم المضاد البحث والتطوير لقطة أنظمة (الجدول 3)، أي أقل من 7.81 جزء من الغرام / مل. في هذه الحالة، أنتجت أدنى 2 TNF-α تركيز ردا مقبولا من 17 مؤسسة تمويل أصغر، أكبر من الاستجابة للتركيز أدنى TNF-α زائد ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري. (10 + 3 مؤسسات التمويل الأصغر (2.4) = 16.29 MFI) وبالمثل، كان من المقدر أن الحد من الكشف عن ELISA R & D DuoSet الأنظمة لتكون بين 63 بغ / مل و 31 جزء من الغرام / مل (الجدول 1).
ق ق = "jove_content"> 
الشكل 1. وشدة متوسط مضان (MFI) لمعيار أنظمة R & D (@ 2000 بيكوغرام / مل) عن كل تركيبة ممكنة من الأجسام المضادة القبض على أربعة (بالإضافة إلى أربع مناطق microsphere مختلفة)، والأجسام المضادة كشف الأربعة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم .
الشكل 2. الكثافة الضوئية (OD) من المعايير الثلاثة المترابطة المختلفة (@ 1000 بيكوغرام / مل) لمدة اربع اسر ومجموعات كشف الزوج الأجسام المضادة. التقاط وكانت مقترنة بشكل تعسفي من قبل بائع كشف الأجسام المضادة، لبساطة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
| جزء من الغرام / مل | OD | STD ديف | +3 SD |
| 1000 | 2،084 | 0،035 | 2،187 |
| 500 | 1،328 | 0،038 | 1،441 |
| 250 | 0،787 | 0،025 | 0،863 |
| 125 | 0،476 | 0،026 | 0،554 |
| 63 | 0،304 | 0،023 | 0،374 |
| 31.3 | 0،212 | 0،025 | 0،287 |
| 15.6 | 0،167 | 0،244 | |
| 0 | 0،118 | 0،021 | 0،182 |
الجدول رقم 1 وتبلغ الكثافة الضوئية (OD) من سلسلة تخفيف 2-أضعاف المحدد من قبل ادخال نظم البحث والتطوير حزمة DuoSet، لاستخدامها بوصفها منحنى عادي؛ بما في ذلك الانحراف المعياري (SD)، والحد قدر من الكشف (اللد)، بين 31،3 جزء من الغرام / مل و 63 جزء من الغرام / مل.
| R & D أنظمة التقاط وكشف الأجسام المضادة | |||
| جزء من الغرام / مل | مؤسسة التمويل الأصغر | STD ديف | +3 SD |
| 8000 | 20320 | 463 21707 | |
| 4000 | 15594 | 223 | 16263 |
| 2000 | 11098 | 79 | 11336 |
| 1000 | 6985 | 160 | 7465 |
| 500 | 4149 | 80 | 4390 |
| 250 | 2233 | 30.0 | 2323 |
| 125 | 1199 | 43.8 | 1330 |
| 63 | 636 | 14.0 | 678 |
| 31.3 | 340 | 12.9 | 379 |
| 183 | 5.9 | 201 | |
| 7.8 | 103 | 2.2 | 109 |
| 3.9 | 66 | 2.4 | 73 |
| 0 | 11 | 0.8 | 13.8 |
الجدول 2 وشدة متوسط مضان (MFI) من سلسلة تخفيف معيار يقاس تكنولوجيا xMAP، وذلك باستخدام زوج الأضداد المتضمنة DuoSet أنظمة R & D؛. بما في ذلك الانحراف المعياري (SD) والحد الأقصى المقدر للكشف (اللد)، أي أقل من 3.91 جزء من الغرام / مل.
| R & D أنظمة أب لقطة مع ميليبور كشف أب | |||
| جزء من الغرام / مل | مؤسسة التمويل الأصغر | | +3 SD | |
| 8000 | 5800 | 143 | 6229 |
| 4000 | 3881 | 120 | 4242 |
| 2000 | 2176 | 73 | 2396 |
| 1000 | 1138 | 32.1 | 1234 |
| 500 | 578 | 31.3 | 671 |
| 250 | 289 | 6.2 | 307 |
| 125 | 142 | 3.1 | 151 |
| 63 | 75 | 5.3 | 91 |
| 31.3 | 44 | 3.3 | 54 |
| 15.6 | 28 | 2.6 | 35.5 |
| 7.8 | 17 | 1.5 | 21.2 |
| 3.9 | 10 | 2.0 | 16.3 |
| 0 | 7 | 1.4 | 11.4 |
الجدول 3 كثافة متوسط مضان (MFI) من سلسلة تخفيف معيار يقاس تكنولوجيا xMAP، وذلك باستخدام التقاط أنظمة البحث والتطوير الأجسام المضادة وكشف ميليبور الضد EMD؛. بما في ذلك الانحراف المعياري (SD) والحد المقدر للكشف (اللد)، وأقل من 7.81 جزء من الغرام / مل.
الشكل 3. منحنيات معيار للفحوصات xMAP البلدين والبحث والتطوير أنظمة ELISA DuoSet. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 4. مقارنة بين المنحنيات القياسية xMAP ومنحنى معيار ELISA في نطاق وسجل الدخول. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Discussion
ويمكن تحويل لفحص ELISA إلى منصة xMAP Luminex ان تكون بسيطة مثل استبدال streptavidin الفجل البيروكسيديز (SA-HRP) في مجموعة ELISA نموذجي مع فيكوإيريترين streptavidin (SA-PE)، وتحسين الأداء. لأولئك الذين يريدون لإنشاء المناعية xMAP من الألف إلى الياء، ويمكن تحقيق ذلك مع بروتوكول واضحة أن تمكن أيضا من تقييم سريع متعددة، من أزواج الأضداد. وأعدت بسهولة الكواشف لفحص xMAP استخدام عدة جسم xMAP اقتران الزوجين إلى الأجسام المضادة المحددة لالتقاط MagPlex المجهرية تركيز منخفض. استخدام المجهرية التركيز المنخفض يقلل من تكلفة تطوير فحص في الوقت الذي توفر أداء الفحص نفسه من المجهرية تركيز أعلى. مقدار الوقت اللازم لإعداد يقترن MagPlex المجهرية ما يقرب من 3 ساعات، وهو أسرع بكثير من ال 22 - 24 ساعة المطلوبة لمعطف جيد من لوحة ELISA، تليها معاملةمن الآبار المغلفة. أداء فحص xMAP أيضا متفوقة على إليسا من حيث الحد من كشف (<4 بيكوغرام / مل مقابل> جزء من الغرام / مل 31) مجموعة والديناميكية (<4 بيكوغرام / مل إلى> 8000 جزء من الغرام / مل مقابل 16 جزء من الغرام / مل إلى 1000 جزء من الغرام / مل). القراء لوحة لديها مجموعة والتطوير التنظيمي المحدودة التي هي إما 3 أو 4 التطوير التنظيمي، وتقييد الحد الأعلى من النطاق الديناميكي للحصول على فحص.
مما لا شك فيه، وليس كل الأجسام المضادة تعمل في شكل ELISA وليس كل الأجسام المضادة التي تعمل بشكل جيد في ELISA يمكن نقلها بسهولة إلى تنسيق فحص xMAP. ومع ذلك، نظرا لأنه يمكن المضاعفة المقايسات xMAP (أي تشغيل في نفس الوقت)، فمن الممكن لتقييم القبض على عدة مجموعات وكشف الأجسام المضادة في وقت واحد لتحديد أفضل زوج لاستخدام لفحص. هذه العملية يوفر وقتا كبيرا والكواشف بالمقارنة مع إجراء تطوير ELISA، والذي يقتصر على تقييم من زوج واحد في وقت واحد. وينبغي أن أزواج الأضداد اثنين أو أكثر من أداء مكافئ؛ المعلمات الأخرى للفحص يمكنينبغي النظر لتحديد مدى ملاءمتها للزوج (على سبيل المثال، وتوافر، والتكلفة، وما إلى ذلك).
بالإضافة إلى فحص أداء أفضل ومرونة مع مقايسة xMAP، وهناك أيضا وفورات كبيرة في التكاليف. الكمية الموصى بها من الأجسام المضادة اللازمة لمعطف بئر واحدة من لوحة ELISA هو 400ng، في حين أن الكمية المطلوبة لالخرز المستخدمة في بئر واحدة لفحص xMAP هو ما يقرب من 7.5 نانوغرام. وبالتالي، فإن كمية من الأجسام المضادة اللازمة لأحد ELISA سوف توفر كذلك نتائج الاختبار أكثر من 50 عاما، إذا ما استخدمت في فحص xMAP. للتطبيقات التي تنطوي على العينات الثمينة، xMAP أيضا لديه ميزة كبيرة. حجم عينة الموصى بها لإليسا هو 100 ميكروليتر في حين أن حجم اللازمة لفحص xMAP يمكن أن يكون نصف هذا، أو أقل.
في ملخص، وتحويل لفحص ELISA إلى منصة xMAP Luminex هو غير معقدة والكفاءة وتوفير التكاليف، في حين أن انتاج مقايسة مع مجموعة ديناميكية متفوقة وحساسية.
Disclosures
وقد تم هذا العمل في شركة Luminex مع المعدات المصنعة في شركة Luminex.
البحث والتطوير للنظم وEMD ميليبور من الشركاء الاستراتيجيين لشركة Luminex؛ ترخيص لتطوير وتسويق فحوصات xMAP متعددة القائم.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل شركة Luminex.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit | R D Systems | DY210 | Includes monoclonal and biotin coupled polyclonal antibodies and recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Abcam | Ab18696 | Capture Antibody, clone CH8820 |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Abcam | Ab16166 | Biotin coupled Detection Antibody, clone AS1 |
| TNF alpha protein | Abcam | Ab9642 | Recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Novus | NBP1-50115 | Capture Antibody, clone 4H31 |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Novus | NB100-78162 | Biotin coupled Detection Antibody, clone MAb11 |
| TNF alpha protein | Novus | NBC1-18460 | Recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | EMD Millipore | MAB1141 | Capture Antibody, clone 3C7.2 |
| Polyclonal Antibody to TNF-α | EMD Millipore | 654250 | Rabbit polyclonal Detection Antibody |
| Streptavidin-Phyc–rythrin | Moss | SAPE-001 | Fluorescent reporter reagent for Luminex xMAP Assay |
| MAGPIX w/ xPONENT Software | Luminex Corporation | MAGPIX-XPONENT | Luminex Instrument |
| xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | Includes EDC reagent, Sulfo-NHS reagent, activation buffer, wash buffer, 1.5 mL reaction tubes, and disposable pipettes |
| MagPlex Microspheres, Low Concentration | Luminex Corporation | MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID | Low concentration beads (@ 2.5 x 106 bead/mL) |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher | PI-21335 | Biotinylation kit for unmodified detection antibody |
| Tecan Infinite F200 Reader | Tecan | ELISA plate reader | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P-3688 | 1% PBS-BSA, Assay Buffer |
| One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner, 115 VAC | Cole-Parmer | WU-08849-00 | Produce an effective operating frequency of 55 kHz |
| Magnetic Tube Separator | Luminex Corporation | CN-0288-01 | For single 1.5mL tube magnetic separation in coupling wash steps |
| Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | For 96-well plate magnetic separation in assay wash steps |
References
- Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system. Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).
- Carson, R. T., Vignali, A. A. Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay. J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).
- Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. A method for high-throughput gene expression signature analysis. Genome Biol. 7, 61 (2006).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis. J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).
- de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies. J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).
- Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro. Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).
- de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).
- Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23. Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).
