Summary
En ELISA kan enkelt konverteres til en Luminex xMAP analysen og gjennom fordelene ved multipleksing, flere antistoffer kan være skjermet samtidig for å identifisere en optimal antistoff par, noe som resulterer i økt følsomhet og dynamisk omfang, og samtidig redusere analysen kostnad.
Abstract
Enzymet-koblede immunsorbent analyse (ELISA) har lenge vært det viktigste verktøyet for påvisning av analytter av interesse i biologiske prøver for både livet forskning og klinisk diagnostikk. Imidlertid har ELISA begrensninger. Det er vanligvis utført i en 96-brønns mikroplate, og brønnene er belagt med fangst antistoff, som krever en relativt stor mengde prøve å fange en antigen av interesse. Det store arealet av brønner og hydrofobe binding av fangst antistoff kan også føre til ikke-spesifikk binding og økt bakgrunn. I tillegg fleste ELISAs avhengige av enzymet-mediert forsterkning av signal for å oppnå rimelig følsomhet. Slik forsterkning er ikke alltid lineær og kan dermed skew resultater.
I de siste 15 årene har en ny teknologi dukket som gir fordelene ved ELISA, men også gir høyere gjennomstrømning, økt fleksibilitet, redusert prøvevolum, og lavere kostnad, med en lignende wo1 rkflow, to. Luminex xMAP Technology er en mikrosfære (perle) matrise plattformen muliggjør både monoplex og multiplekse analyser som kan brukes til både protein og nukleinsyre applikasjoner 3-5. Perlene har fangst antistoffet kovalent immobilisert på et mindre areal, som krever mindre fangst antistoff og mindre prøvevolumer, sammenlignet med ELISA, og ikke-spesifikk binding er betydelig redusert. Mindre prøvevolumer er viktig når man arbeider med å begrense prøver som cerebrospinalvæske, leddvæsken, etc. 6. Multipleksing analysen reduserer ytterligere prøvevolum krav, slik at flere resultater fra en enkelt prøve.
Nylige forbedringer av Luminex inkluderer: den nye MAGPIX systemet, en mindre, rimeligere, enklere å bruke instrument; Low-Konsentrasjon Magnetic MagPlex Mikrokuler som eliminerer behovet for kostbare filter plater og kommer i en arbeidsgruppe konsentrasjon bedre egnet for analysen utvikling oglav gjennomstrømning, og det xMAP Antistoff Coupling (ABC) Kit, som inkluderer en protokoll, reagenser og forbruksmateriell nødvendig for kobling perler til fangst antistoff av interesse. (Se Materialer seksjon for en detaljert liste over kit innhold.)
I dette forsøket, konverterer vi en pre-optimalisert ELISA-analysen for TNF-alfa cytokin til xMAP plattformen og sammenligne resultatene av de to metodene 7-11. TNF-alfa er en biomarkør som brukes ved måling av inflammatoriske responser hos pasienter med autoimmune sykdommer.
Vi begynner ved å koble fire kandidat fangst antistoffer mot fire forskjellige mikrosfære sett eller regioner. Når det blandes sammen har disse fire settene tillate samtidig testing av alle fire kandidater med fire separate brannvarslere antistoffer for å finne den beste antistoff par, lagring reagenser, utvalg og tid. To xMAP analysene blir deretter konstruert med de to mest optimale antistoff par og deres prestasjoner ersammenlignet med den opprinnelige ELISA-analysen i forhold til signalstyrke, dynamisk omfang, og følsomhet.
Protocol
I. reagensklargjøring
- Antistoff Utvalg og klargjøring
- Identifiser antistoffer som skal brukes i forsøket.
- Fire capture antistoffer: spesifikke for human TNF-alfa, enten monoklonalt eller polyklonale, alle de samme vertsarter.
- Fire detection antistoffer: spesifikke for human TNF-alfa, enten umodifisert, biotinylated, eller PE-konjugert.
- En bekreftelse antistoff: PE-konjugert og spesifikk for vertsarter av fangstanlegget antistoffer.
- Rekonstituer alle antistoffer mot produsent-anbefalte arbeider konsentrasjoner.
- Velg fire ampuller med lav konsentrasjon MagPlex mikrosfære (perle) sett eller regioner, for eksempel, Luminex delenumre MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, og MC10015-ID.
- Identifiser antistoffer som skal brukes i forsøket.
- Kobling Antistoffer mot MagPlex Mikrokuler, bruke xMAP antistoff (ABC) Coupling Kit
RePer til ABC Kit brukerveiledningen (Part # 89-00002-00-319) for hele koblingen prosedyren. (Merk: fotosensitiv mikrosfærer bør beskyttes mot lys når det er mulig.)- Ta med reagenser i ABC kit til romtemperatur og merke fire reaksjon rør med perlen regionnummer valgt for kobling reaksjonen. Overfør innholdet av de fire ampuller med MagPlex perler (1 ml hver, eller 2,5 x 10 6 perler) i de fire merkede reaksjonen rør.
- Vask hver av perlen sett to ganger i 500 mL av aktivisering buffer, som beskrevet i ABC kit manual.
- Aktiveres hver perle sett med 480 mL av aktivisering buffer, 10 mL av Sulfo-NHS, og 10 mL av EDC reagens, i henhold til prosedyren i ABC kit manual, og inkuberes i 20 minutter. (Merk:. EDC reagens må rekonstitueres i 250 mL av Aktivering buffer umiddelbart før dette trinnet)
- Gjenta forrige vask takt med nå "aktivert" mikrosfærer totalt thrEE Times med 500 mL av aktivisering buffer, som beskrevet i ABC kit manual.
- Forbered fire separate løsninger, som hver inneholder 7,5 mikrog (dvs. 3 mikrogram / million mikrosfærer) av fangst antistoff i Activation buffer.
- Legg til disse fire capture antistoff løsninger på sine respektive reaksjon rør, vortex hvert rør umiddelbart, og inkuber for to timer på en rotator.
- Gjenta forrige vask takt med nå "koblet" mikrosfærer totalt tre ganger med 500 mL av vaskebuffer følger med ABC kit.
- Etter den siste vasketrinn, legg 500 mL vaskebuffer til hvert reaksjonsrøret å gi en endelig lager konsentrasjon av 5 millioner antistoff-koblede perler per milliliter. Vortex og sonicate reaksjonsproduktene rør for å spre mikrosfærer.
MERK: Delvis submerging den lukkede mikrosfære hetteglasset i en ultrasoniske renere fylt med DI vann gir effektiv sonikator for alle vasker trinn. (Se Materialer tabell for equipment detaljer.) - Oppbevar koblede perlene ved 2-8 ° C og beskyttet mot lys inntil nødvendig.
- Bestemmelse av Coupled Mikrokuler
- Tell antall mikrosfærer gjenfunnet etter koblingen reaksjonen ved hjelp av en celleteller eller hemacytometer. Henvis til telling instrumentets bruksanvisningen for riktige instruksjonene for å gjøre det. Oppgangen fra koblingens reaksjonen er typisk over 90%.
- Kobling Bekreftelse
- Bekreft koblingen reaksjonen var vellykket ved å forberede test løsninger på de koblede perle aksjer for hvert sett, med den endelige konsentrasjonen av 100 perler / mL i Assay buffer (PBS med 1% BSA). Forbered fortynninger av phycoerythrin-(PE-) merket anti-arter IgG antistoff bekreftelse på 4 mikrogram / ml i Assay Buffer.
- Delmengde 50 mL av hver test løsning i fire brønner på en rund bunn, 96-brønn plate, for totalt 16 brønner. Deretter legger 50 μL av Assay buffer i åtte av brønnene, for å måle bakgrunn, og 50 mL fortynnet bekreftelse antistoff i de åtte resterende brønnene.
- Bland de reaksjoner forsiktig med pipettering opp og ned flere ganger med en flerkanals pipettor. Dekk platen, og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur på en plate shaker.
- Sett platen på en magnetisk plate separator i 1-2 minutter til å trekke perlene ut av løsningen. Deretter fjerner væsken med kraft snu platen, mens på separatoren, over en avfall mottaket.
- Vask hver brønn to ganger ved å tilsette 100 mL av Assay buffer og fjerne supernatanten fra platen på en lignende måte ved hjelp av magnetisk plate separator.
- Resuspender perlene i 100 mL av Assay buffer ved å forsiktig pipettering opp og ned fem ganger med en flerkanals pipettor.
- Analyser på en Luminex xMAP instrument, for eksempel MAGPIX Instrument. Intensiteten av fluorescerende signal av denne reaksjonen er directly proporsjonal med mengden av protein på overflaten av perlene, som gir en rask vurdering av den relative mengden av protein koblet til perlene.
- Kobling Biotin til umodifiserte Antistoffer for Detection
- Hvis du bruker umodifiserte deteksjon antistoffer, biotinylate disse antistoffene med Thermo Fisher EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin reagens (kat. nr. PI-21335) og fremgangsmåten som er beskrevet i pakningsvedlegget. Når biotinylated, kan påvisning antistoffer senere merkes med streptavidin phycoerythrin (SA-PE) i analysen (trinn III.6.) Slik at de kan oppdages med xMAP analysator.
II. Assay Setup
- Forbered en innledende blanding av alle fire perle settene ved å tilsette 10 mL av hver til 0,96 mL PBS med 1% BSA (Assay Buffer. Se Materialer tabell) å avgjøre hvilken som er mest effektiv med xMAP analysen.
- Forbered påvisning antistoff løsninger ved DILuting hver til 1 mikrogram / ml i Assay Buffer.
- Klargjør R & D Systems TNF-α protein standard på 2000 pg / ml i Assay Buffer.
- Fortynn streptavidin-rPhycoerythrin (SA-PE) (forutsatt @ 1 mg / ml) til 8 mg / ml i Assay Buffer.
III. Antistoff Screening
- Tilsett 50 mL av antistoff-coupled mikrosfære blanding til hver av 16 brønner på en CoStar rundbunnet 96-brønn plate for screening analysen.
- Tilsett 50 mL av Assay buffer til 8 av de 16 brønner, for å måle bakgrunn.
- Tilsett 50 mL av R & D Systems TNF-α-standarden (@ 2000 pg / ml) til de andre 8 brønner, for å måle respons.
- Inkuber i én time i romtemperatur, beskyttet mot lys, mens rister på en analyse plate shaker.
- Tilsett 50 mL av hver av de fire deteksjons antistoffer til fire brønner (to bakgrunnen og to respons) og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys, mens rister på en analyse plate shaker.
- Tilsett 50 mL av SA-PE reagens til alle brønnene og inkuber 15 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys, mens rister på en analyse plate shaker.
- Sett platen på en magnetisk plate separator i ett minutt og deretter fjerne væske ved kraftig snu platen.
- Tilsett 100 mL Assay Buffer til hver av de 16 brønner, Sett platen på magnetisk plate separator i ett minutt og deretter fjerne væske ved kraftig snu platen mens du er på separatoren.
- Tilsett 100 mL av Assay buffer til hver av de 16 brønner og lese platen med Luminex MAGPIX instrumentet, og viser til brukerhåndboken for forsvarlig drift.
- Velg et antistoff par som oppfyller ønsket signalstyrke.
IV. xMAP Funksjonell Assay
- Etter å ha valgt den beste fangst antistoff fortynnes 100 mL av at antistoff-coupled perle lager (fra trinn IB8) til 10 ml med Assay Buffer.
- Tilsett 50 mL avutvannet perler til 78 brønner på to CoStar rundbunnet 96-brønns plater. (78 brønner x 2 plater = 156 brønner) Hver plate vil bli brukt til å vurdere ytelsen til en annen oppdagelse antistoff.
- Forbered en 12-punkts standardkurve, som begynner kl 8000 pg / ml og endte på 4 pg / ml, med R & D Systems TNF-α-standarden. Legg seks 50 mL replikater av hver fortynning til hver av platene, pluss seks brønner med 50 mL av Assay buffer hver, som en bakgrunn, for totalt 78 brønner / plate.
- Inkuber platene en time ved romtemperatur, beskyttet mot lys, mens rister på en analyse plate shaker.
- Tilsett 50 mL av den første påvisning antistoff til alle 78 brønner i første plate. Gjenta for den andre deteksjon antistoffet på andre plate.
- Inkuber platene i 30 minutter, ved romtemperatur, beskyttet mot lys mens rister på en analyse plate shaker.
- Tilsett 50 mL av SA-PE reagens til alle brønner på hver tallerken.
- Inkuberde to platene i 15 minutter, ved romtemperatur, beskyttet mot lys mens rister på en analyse plate shaker.
- Plasser platene på magnetisk plate separatorer for ett minutt, deretter fjerne væske ved kraftig snu platen mens du er på separatoren.
- Tilsett 100 mL av Assay buffer til hver av de 78 brønnene på platene, legg platene på magnetisk plate separatorer for ett minutt, deretter fjerne væske ved kraftig snu platen.
- Tilsett 100 mL av Assay buffer til hver av de 78 brønnene på platene og analysere på MAGPIX instrument, med henvisning til brukerhåndboken for forsvarlig drift.
V. ELISA-analysen
- Følg instruksjonene som følger med R & D Systems Menneskelig TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit (R & D Part # DY210), måle responsen som genereres av standarden som følger med R & D kit. Gjenta ELISA-analysen tre ganger, erstatte R & D Systems fangst og deteksjon mauribodies med antistoffer av de andre leverandørene. For enkelhets skyld par antistoffene etter leverandør (f.eks Millipore fangst antistoff med Millipore deteksjon antistoff, Abcam fangst antistoff med Abcam deteksjon antistoff, etc.).
- Evaluer hvert par uavhengig av hverandre, slik det kreves i ELISA-formatet, med hver av de tre TNF-alfa protein standarder.
VI. Representative Resultater
Denne protokollen viser hvordan en typisk ELISA kan konverteres til xMAP plattformen mens utnytte multipleks evne av teknologien for å raskt optimalisere analysen. ELISA brukes i dette eksemplet var Human Tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α) DuoSet ELISA kit fra R & D Systems (R & D Part # DY210).
I tillegg til antistoff paret følger med settet, ble tre andre antistoff par fra ulike kilder (se Materials tabellen) evaluert samtidig med xMAP plattformen. FoUr av antistoffer ble utpekt som capture antistoffer og ble koplet til MagPlex lav konsentrasjon Mikrokuler. De fire andre antistoffer ble utpekt som deteksjon antistoffer; tre av disse ble kjøpt som biotin-koplet og den fjerde ble biotinylated som beskrevet i protokollen.
Antistoffene for denne studien ble valgt basert på tilgjengelighet og leverandør. Men i praktisk setting, bør antistoffer velges basert på den enkelte brukers preferanser og tidligere resultater erfaring med at antistoff. Selv om dette eksperimentet ikke teste hensiktsmessigheten av et antistoff som fangst antistoff mot deteksjon antistoff, kan denne protokollen enkelt endres til det formålet.
De Luminex xMAP analysene ble utført som en multiplex å evaluere alle fire fangst antistoffer som en blanding, ved å kombinere fire sett med TNF-α-antistoff koblet MagPlex mikrosfærer. Fangststørrelsene antistoffer ble evaluert med hver av de firebiotinylated deteksjon antistoffer individuelt, slik at samspillet av en oppdagelse antistoff med hver av de fire fange antistoffene kan fastsettes samtidig. Fire slike analyser, utført parallelt, bestemmes interaksjonene mellom alle fire detection antistoffer med alle fire fangst antistoffer. Figur 1 viser de komparative dataene fra disse screening-analyser.
Resultatene indikerte at antistoff paret fra R & D Systems DuoSet utføres best med en resulterende respons ved 6183 Median fluorescensintensitet (MFI) enheter. Det ble også observert at påvisning antistoffer fra Millipore (86% av FoU-antistoff par respons) og Abcam (67%) gitt en rimelig reaksjon i xMAP analysen, når kombinert med R & D Systems fangst antistoff. Fangststørrelsene antistoffer fra Abcam, Millipore og Novus produsert en mindre ønskelig respons i xMAP analysen.
Det er viktig å merke seg at PURposere med denne studien er ikke nødvendigvis å markere forskjeller mellom spesielle antistoffer eller leverandører, men bare for å illustrere at det er observerbare forskjeller i ytelsen sin når den brukes under lignende forhold, og at xMAP plattformen kan tilby en effektiv metode for å bedømme disse forskjellene.
The R & D Systems DuoSet protokollen ble brukt til å sammenligne de fire antistoff parene i en ELISA-format. The R & D Systems protokollen ble brukt med alle antistoff parene fordi det er reflektert av typiske ELISA protokoller mye brukt i dag og det er analogt til protokollene som brukes med xMAP teknologi. ELISA tester viste at antistoff paret fra FoU Systems igjen ga de beste resultatene (Figur 2). Antistoffet pair fra Abcam produsert ingen respons og antistoff pairer fra Millipore og Novus produsert beskjedne svar.
For å kunne vurdere eventuelle variasjoner i antistoff reaktivitet med standard, alle fire antibody parene ble testet med tre forskjellige rekombinante TNF-alfa protein standarder, fra tre forskjellige leverandører (se Materials tabellen). Dataene i figur 2 viser at de rekombinante TNF-alfa protein standarder fra de tre leverandørene ga tilsvarende resultater.
Den TNF-α protein fra FoU Systems ble brukt til å generere standard kurver med ELISA (Tabell 1) og xMAP analysene (tabell 2 og 3). Mens ELISA-analysen ble gjort med R & D Systems antistoff par, utnyttet de xMAP analysene i R & D Systems fangst antistoff og enten påvisning antistoff fra R & D Systems eller Millipore. Den TNF-α protein fra FoU Systems ble fortynnet til å produsere en rekke konsentrasjoner fra 8000 til 4 pg / ml. Bare antistoffet paret fra FoU Systems produseres det forventede utfallet i xMAP analysen, med en respons> 20 000 MFI, som vist i Tabell 2 ogFigur 3. Da deteksjon antistoff fra Millipore ble brukt med xMAP Assay i stedet for R & D Systems påvisning antistoff (tabell 3), responsen (6000 MFI) var om lag 30% av responsen oppnådd med påvisning antistoff fra R & D Systems, som vist i Figur 3.
Dataene i tabell 1 representerer standardkurven av ELISA, som hadde en produsentens anbefalte TNF-α rekke 16-1000 pg / ml. Denne serien var svært begrenset fordi OD i 1000 pg / ml var litt større enn 2 OD enheter og spektrofotometer er i stand til å måle over 3 OD. På grunn av grensen med spektrofotometer, var det ikke mulig å øke omfanget av ELISA-analysen videre. I tillegg dataene i tabell 1 indikerer at FoU Systems DuoSet ELISA er ikke i stand til å oppdage TNF-α ved konsentrasjoner langt mindre enn 16 pg / ml. På den annen side er xMAP analysen stand til å måleing TNF-α ved en konsentrasjon på mindre enn 7,8 pg / ml med fangst antistoff fra FoU Systems kombinert med påvisning antistoff fra enten FoU Systems eller Millipore.
Den dynamisk rekkevidde og følsomhet for begge metoder er bedre illustrert når plottet i en log-log skala (figur 4). Et klart skille mellom skråningen av ELISA svar og svarene fra xMAP analysene kan sees som ytterligere indikerer en mer begrensende kapasitet for påvisning av TNF-α med ELISA, med både høyere og lavere konsentrasjoner.
Grensene for deteksjon (LOD) for de to funksjonelle TNF-alfa xMAP analysene ble anslått ved å identifisere den laveste TNF-α konsentrasjonen med en observert respons nivå (MFI) større enn bakgrunnen, pluss tre ganger sin standardavvik (SD). For å oppnå statistisk signifikans, replikerer seks ble brukt til å bestemme SD for både xMAP og ELISA metoder. Tesse estimater av LOD er optimistiske og skal gi en "best-case" scenario, med den forståelse at i normale driftsforhold bare to eller tre gjentak vil bli brukt. I tabell 2, kan det observeres at når du bruker R & D Systems par, den laveste TNF-α konsentrasjon på 3,91 pg / ml produsert en respons på 66 MFI, som er større enn responsen i bakgrunnen + 3SD, møte dette kriteriet . Når Millipore påvisning antistoffet ble brukt sammen med R & D Systems Capture antistoff (tabell 3), var deteksjonsgrensen mindre enn 7,81 pg / ml. I dette tilfellet produserte andre laveste TNF-α konsentrasjon en akseptabel respons på 17 MFI, større enn responsen til den laveste TNF-α konsentrasjonen pluss tre ganger standardavvik. (10 MFI + 3 (2,4) = 16,29 MFI) Tilsvarende ble deteksjonsgrensen for R & D Systems DuoSet ELISA anslått å være mellom 63 pg / ml og 31 pg / ml (Tabell 1).
Figur 1. Median fluorescensintensitet (MFI) i R & D Systems standard (@ 2000 pg / ml) for alle mulige kombinasjoner av de fire fange antistoffer (koblet til fire forskjellige mikrosfære regioner) og de fire deteksjon antistoffer. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Den optiske tettheten (OD) av tre ulike rekombinante standarder (@ 1000 pg / ml) for fire-fangst og-deteksjon antistoff par kombinasjoner. Fang og deteksjon antistoffer ble vilkårlig sammen med leverandøren, for enkelhet. Klikk her for å se større figur .
| pg / ml | OD | Std Dev | 3 SD |
| 1000 | 2.084 | 0.035 | 2.187 |
| 500 | 1.328 | 0.038 | 1.441 |
| 250 | 0.787 | 0.025 | 0.863 |
| 125 | 0.476 | 0.026 | 0.554 |
| 63 | 0.304 | 0.023 | 0.374 |
| 31,3 | 0.212 | 0.025 | 0.287 |
| 15,6 | 0.167 | 0.244 | |
| 0 | 0.118 | 0.021 | 0.182 |
Tabell 1 optisk tetthet (OD) av to-fold fortynning serien spesifisert av R & D Systems DuoSet pakningsvedlegget, til bruk som en standard kurve;. Inkludert standardavvik (SD) og anslått deteksjonsgrensen (LOD), mellom 31,3 pg / ml og 63 pg / ml.
| R & D Systems Capture and Detection Antistoffer | |||
| pg / ml | MFI | Std Dev | 3 SD |
| 8000 | 20320 | 463 21707 | |
| 4000 | 15594 | 223 | 16263 |
| 2000 | 11098 | 79 | 11336 |
| 1000 | 6985 | 160 | 7465 |
| 500 | 4149 | 80 | 4390 |
| 250 | 2233 | 30,0 | 2323 |
| 125 | 1199 | 43,8 | 1330 |
| 63 | 636 | 14,0 | 678 |
| 31,3 | 340 | 12,9 | 379 |
| 183 | 5.9 | 201 | |
| 7.8 | 103 | 2.2 | 109 |
| 3.9 | 66 | 2.4 | 73 |
| 0 | 11 | 0.8 | 13,8 |
Tabell 2 Median fluorescensintensitet (MFI) av en standard fortynning serie målt ved xMAP teknologi, ved hjelp av antistoff paret følger med R & D Systems DuoSet;. Inkludert standardavvik (SD) og beregnet deteksjonsgrensen (LOD), mindre enn 3,91 pg / ml.
| R & D Systems Capture Ab med Millipore Detection Ab | |||
| pg / ml | MFI | | 3 SD | |
| 8000 | 5800 | 143 | 6229 |
| 4000 | 3881 | 120 | 4242 |
| 2000 | 2176 | 73 | 2396 |
| 1000 | 1138 | 32,1 | 1234 |
| 500 | 578 | 31,3 | 671 |
| 250 | 289 | 6.2 | 307 |
| 125 | 142 | 3.1 | 151 |
| 63 | 75 | 5.3 | 91 |
| 31,3 | 44 | 3.3 | 54 |
| 15,6 | 28 | 2.6 | 35,5 |
| 7.8 | 17 | 1.5 | 21,2 |
| 3.9 | 10 | 2.0 | 16,3 |
| 0 | 7 | 1.4 | 11,4 |
Tabell 3 Median fluorescensintensitet (MFI) av en standard fortynning serie målt ved xMAP teknologi, ved hjelp av R & D Systems fangst antistoff og EMD Millipore deteksjon antistoff;. Inkludert standardavvik (SD) og beregnet deteksjonsgrensen (LOD), mindre enn 7,81 pg / ml.
Figur 3. Standarden kurvene til de to xMAP analyser og R & D Systems DuoSet Elisa. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. En sammenligning av de xMAP Standardkurver og ELISA standardkurven i en log-log skala. Klikk her for å se større figur .
Discussion
Konverteringen av en ELISA-analysen til Luminex xMAP plattformen kan være så enkelt som å erstatte streptavidin pepperrot peroksidase (SA-HRP) i en typisk ELISA kit med streptavidin phycoerythrin (SA-PE), og optimalisere for ytelse. For de som ønsker å skape en xMAP immunoassay opp fra grunnen, kan dette gjøres med en enkel protokoll som også muliggjør rask, multipleks evaluering av antistoff par. Reagensene for xMAP analysen ble lett utarbeidet etter den xMAP Antistoff Kobling kit til par utpekte fangst antistoffer mot MagPlex lav konsentrasjon mikrosfærer. Bruk av lav konsentrasjon mikrosfærer reduserer kostnadene ved analysen utvikling samtidig som det gir den samme analysen ytelsen høyere konsentrasjon mikrosfærer. Tiden som kreves for å forberede kombinert MagPlex mikrosfærer er ca 3 timer, noe som er mye raskere enn 22 - 24 timer er nødvendig å belegge godt av en ELISA-plate, etterfulgt av behandlingav belagte brønner. Utførelsen av xMAP analysen er også overlegen til ELISA i form av deteksjonsgrensen (<4 pg / ml vs> 31 pg / ml) og dynamisk rekkevidde (<4 pg / ml til> 8000 pg / ml vs 16 pg / ml til 1000 pg / ml). Plate leserne har en begrenset OD serie som er enten 3 eller 4 OD, begrenser den øvre grensen av det dynamiske området for en analyse.
Utvilsomt vil ikke alle antistoffer jobbe i en ELISA-format og ikke alle antistoffer som fungerer godt i en ELISA er lett overførbar til xMAP analysen format. Men siden xMAP analyser kan multiplekset (dvs. kjøre samtidig), er det mulig å evaluere flere fangst og oppdagelse antistoff kombinasjoner samtidig å identifisere de beste paret å bruke for en analyse. Denne prosessen sparer betydelig tid og reagenser i forhold til ELISA utvikling prosedyren, som er begrenset til evaluering av ett par av gangen. Skulle to eller flere antistoff par utføre ekvivalent; andre parametere for analysen kananses for å avgjøre hvorvidt paret (f.eks tilgjengelighet, pris, etc.).
I tillegg til forbedret analysen ytelse og fleksibilitet med xMAP analysen, er det også betydelige kostnadsbesparelser. Den anbefalte mengden av antistoff er nødvendig å belegge en enkelt brønn av en ELISA-plate er 400ng, mens mengden som kreves for perlene som brukes i en brønn av en xMAP analysen er ca 7,5 ng. Dermed mengden av antistoff som kreves for en ELISA brønn vil gi mer enn 50 testresultatene, hvis de brukes i en xMAP analysen. For søknader som involverer dyrebare prøver, har xMAP også en betydelig fordel. Volumet av prøven anbefales for ELISA er 100 mL mens volumet som kreves for xMAP analysen kan være halvparten av det, eller mindre.
I sammendraget, er konvertering av en ELISA-analysen til Luminex xMAP plattformen ukomplisert, effektiv og kostnadsbesparende, mens produsere en analyse med overlegen dynamikk og følsomhet.
Disclosures
Dette arbeidet ble gjort på Luminex Corporation med utstyr produsert på Luminex Corporation.
R & D Systems & EMD Millipore er strategiske partnere i Luminex Corporation, lisensiert til å utvikle og kommersialisere multiplekse xMAP baserte analyser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Luminex Corporation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit | R D Systems | DY210 | Includes monoclonal and biotin coupled polyclonal antibodies and recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Abcam | Ab18696 | Capture Antibody, clone CH8820 |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Abcam | Ab16166 | Biotin coupled Detection Antibody, clone AS1 |
| TNF alpha protein | Abcam | Ab9642 | Recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Novus | NBP1-50115 | Capture Antibody, clone 4H31 |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Novus | NB100-78162 | Biotin coupled Detection Antibody, clone MAb11 |
| TNF alpha protein | Novus | NBC1-18460 | Recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | EMD Millipore | MAB1141 | Capture Antibody, clone 3C7.2 |
| Polyclonal Antibody to TNF-α | EMD Millipore | 654250 | Rabbit polyclonal Detection Antibody |
| Streptavidin-Phyc–rythrin | Moss | SAPE-001 | Fluorescent reporter reagent for Luminex xMAP Assay |
| MAGPIX w/ xPONENT Software | Luminex Corporation | MAGPIX-XPONENT | Luminex Instrument |
| xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | Includes EDC reagent, Sulfo-NHS reagent, activation buffer, wash buffer, 1.5 mL reaction tubes, and disposable pipettes |
| MagPlex Microspheres, Low Concentration | Luminex Corporation | MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID | Low concentration beads (@ 2.5 x 106 bead/mL) |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher | PI-21335 | Biotinylation kit for unmodified detection antibody |
| Tecan Infinite F200 Reader | Tecan | ELISA plate reader | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P-3688 | 1% PBS-BSA, Assay Buffer |
| One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner, 115 VAC | Cole-Parmer | WU-08849-00 | Produce an effective operating frequency of 55 kHz |
| Magnetic Tube Separator | Luminex Corporation | CN-0288-01 | For single 1.5mL tube magnetic separation in coupling wash steps |
| Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | For 96-well plate magnetic separation in assay wash steps |
References
- Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system. Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).
- Carson, R. T., Vignali, A. A. Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay. J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).
- Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. A method for high-throughput gene expression signature analysis. Genome Biol. 7, 61 (2006).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis. J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).
- de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies. J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).
- Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro. Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).
- de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).
- Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23. Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).
