Summary
Cet article détaille comment utiliser à flux continu chambres hypoxie pour générer des atmosphères avec des concentrations définies de O
Abstract
L'oxygène est essentiel pour tous les métazoaires à survivre, à une exception près connue 1. Diminution de la disponibilité d'O 2 (hypoxie) peuvent survenir pendant les états de la maladie, le développement normal ou changements des conditions environnementales 2-5. Comprendre les voies de signalisation cellulaires qui sont impliqués dans la réponse à l'hypoxie pourrait fournir un nouvel éclairage sur les stratégies de traitement pour diverses pathologies humaines, de course à un cancer. Cet objectif a été entravée, du moins en partie, par des difficultés techniques associées à l'exposition hypoxique contrôlée dans des organismes modèles génétiquement dociles.
Les nématode Caenorhabditis elegans est idéalement adapté comme un organisme modèle pour l'étude de la réponse hypoxique, comme il est facile de culture et de manipuler génétiquement. En outre, il est possible d'étudier les réponses cellulaires à hypoxiques spécifiques concentrations d'O 2 sans effets confondants depuis C. elegans obtenir O 2 (et d'autres gaz) par diffusion, par opposition à un système respiratoire facilitée 6. Facteurs connus pour être impliqués dans la réponse à l'hypoxie sont conservées dans C. elegans. La réponse réelle à l'hypoxie dépend de la concentration spécifique de O 2 qui est disponible. Dans C. elegans, l'exposition à l'hypoxie modérée provoque une réponse transcriptionnelle médiée en grande partie par HIF-1, les très conservées facteur de transcription hypoxia-inducible 6-9. C. elegans embryons exigent HIF-1 à survivre dans 5,000-20,000 ppm O 2 7,10 . L'hypoxie est un terme général pour "inférieure à la normale O 2". Normoxie (normal O 2) peut aussi être difficile à définir. On considère généralement l'air ambiant, qui est 210 000 ppm 2 O à la normoxie. Toutefois, il a été démontré que C. elegans a une préférence comportementale pour concentrations d'O 2 à partir de 5-12% (50,000-120,000 ppm 2 O) 11. Dans larvae et les adultes, HIF-1 agit pour prévenir l'hypoxie induite par la diapause en 5000 ppm 2 O 12. Toutefois, HIF-1 ne joue pas un rôle dans la réponse à de faibles concentrations de O 2 (anoxie, une définition opérationnelle <10 ppm 2 O) 13. En anoxie, C. elegans entre dans un état d'animation suspendue réversible dans laquelle toutes les activités observables au microscope cesse 10. Le fait que différentes réponses physiologiques se produisent dans des conditions différentes met en évidence l'importance d'avoir un contrôle expérimental sur la concentration de O 2 hypoxique.
Ici, nous présentons une méthode pour la construction et la mise en œuvre des chambres de l'environnement qui produisent fiables et reproductibles des conditions hypoxiques avec des concentrations définies de O 2. La méthode des flux continuel assure l'équilibration rapide de la chambre et augmente la stabilité du système. En outre, la transparence et laaccessibilité des chambres permettre une visualisation directe des animaux étant exposées à l'hypoxie. Nous avons en outre démontrer une méthode efficace de la récolte C. échantillons elegans rapidement après une exposition à l'hypoxie, ce qui est nécessaire pour observer un grand nombre des changements rapidement inversée qui se produisent dans 10,14 hypoxie. Cette méthode fournit une fondation de base qui peut être facilement modifié pour les besoins de chaque laboratoire, y compris des systèmes modèles différents et une variété de gaz.
Protocol
1. Construction de chambres de l'environnement
- Sélectionnez le plus petit volume raisonnable de la chambre requis pour la portée de votre projet. Chambre doit être composée de gaz (O 2) un matériau imperméable. Plats en Pyrex de cristallisation, des boîtes Anaeropack ou de grandes boîtes en acrylique coulé (Ellard Instrumentation), peuvent être utilisés. Nous avons constaté que 9 mm 50 plaques peuvent tenir dans un plat de 100 x 50 cristallisation Kimex. Les plaques de verre peut être utilisé comme couvercles pour les plats en Pyrex de cristallisation.
- Percez un trou dans la chambre choisie et monter avec un mâle en plastique à raccord Luer cannelé (Cole Parmer). Raccords peut être assurée par raccord de tuyau ou avec de l'époxy. Installer un raccord similaire sur le côté opposé du récipient pour permettre au gaz de s'écouler dans et hors de la chambre. Si possible, compenser les trous pour augmenter le mélange turbulent.
- Obtenir des réservoirs de gaz comprimé avec définies concentrations de O 2 (en balance avec N 2) qui sont certifiés standard pour O 2 content ou, pour des conditions anoxiques, N 2 pur (<10 ppm 2 O). Utilisez commutation automatique pour les organismes de réglementation à long terme des études pour éviter de perturber les niveaux d'oxygène dans les chambres.
- Réponse à l'hypoxie organismique a été démontré que la température 15 à charge. En plaçant la chambre dans un incubateur, différentes températures puisse être maintenue. Températures au sein d'un incubateur peut être inégale et, comme tel, il est prudent de faire usage de la température d'un enregistreur de données de mesurer en permanence la température à l'intérieur de la chambre.
2. Raccordement du gaz à la Chambre de l'environnement
- Pour toutes les connexions, utiliser un huitième de pouce de diamètre extérieur tube relié par des connecteurs ou mousquetons soit raccords à compression. Tubulure doit être imperméable et non réactive avec O 2, tels que l'éthylène-propylène fluoré (FEP) ou en nylon (Cole Parmer). Pour un schéma de l'installation terminée, voir la figure 1.
- Branchez le comréservoirs de gaz pressées à un dispositif de commande d'écoulement, comme un régulateur de débit massique (Sierra Instruments) ou rotamètre (Aalborg). Faire en sorte que la pression en amont de la cuve est dans la gamme du dispositif d'écoulement et les raccords flexibles cannelés. Deux-détendeurs sont généralement utilisés, avec la deuxième étape mis à la pression désirée [Voir la section trois pour la sélection du débit approprié]
- Hydrater le gaz par barbotage dans l'eau distillée en utilisant une bouteille de lavage de gaz avec bouteille fritte, puis directement dans l'un des raccords sur la chambre de l'environnement, laissant le deuxième raccord ouvert pour des gaz d'échappement (voir Figure 1). Pour études à court terme, l'hydratation de gaz protège contre le dessèchement de plaque, mais la surveillance d'humidité peut être nécessaire pour études à long terme.
- Graisse Dow Corning sous vide peut être utilisé pour sceller la chambre. Placer des poids sur le couvercle de la chambre afin d'assurer un joint étanche à l'air. Pour confirmer un joint étanche et un débit adéquat, tenir une petite piscine d'eau dans la paume de ynotre main gantée pour le montage sur la chambre et de vérifier les bulles.
3. Sélection Débit
- En supposant un mélange parfait, il ya un échange de gaz de 90% de l'atmosphère gazeuse à chaque fois le volume de la chambre est remplacé (loi de Fick). Par exemple, dans une chambre de 100 cc avec un débit de 100 cc / min, l'air de la maison d'origine dans la chambre sera remplacé par 90% de votre gaz désiré après 1 minute, et asymptotiquement vers un échange complet de 90% chaque minute par la suite.
- Des débits plus élevés et les plus petits contenants atteindrez votre concentration d'oxygène souhaitée plus rapidement. Pour 100 x 50 Kimex conteneurs (400 cc), un débit de 120 cc / min atteindra échange 99,9% en 10 minutes (3 échanges). Ce débit est adapté à la plupart des conditions d'oxygène. A notre connaissance il n'y a pas eu d'enquête systématique de la façon dont le taux de variation de concentration en O 2 influe sur la réponse en C. elegans.
- Worms exposés à des conditions hypoxiques couramment s'échapper de la surface de plaques de gélose. Pour éviter cela, placez une bague d'acide palmitique (10 mg / ml dans l'éthanol) autour du bord des plaques. L'acide palmitique sortira de la solution lors de l'évaporation d'éthanol, formant une barrière physique. Barrières acide palmitique n'affectent pas le taux de ponte, la fécondité ou la durée de vie en C. elegans 16,17. Terriers ne se produisent plus fréquemment dans des conditions hypoxiques, si d'autres mesures préventives ne sont généralement pas nécessaire.
- Générer des populations synchronisées par le blanchissement des adultes gravides dans une petite goutte de l'eau de Javel non ensemencés alcaline sur les nématodes de croissance des médias (NGM) plaques 18. Contrairement à des protocoles standard de l'hypochlorite de grande lots de blanchiment, choisissez 1-100 animaux dans une goutte d'eau de Javel sur la surface d'une plaque NGM, puis laisser l'eau de Javel à absorber dans la plaque
- Évitez d'exposer les embryons blanchis à l'hypoxie, car cela peut réduire la viabilité 13. Pour recueillir des embryons jeunes (2-4 cellules), les adultes gravides peuvent être coupés dans un petit volume d'eau avec une lame de rasoir et d'embryons déménagé à plaques par pipette bouche pour l'exposition subséquente à l'hypoxie.
- Générer des populations synchronisées par le blanchissement des adultes gravides dans une petite goutte de l'eau de Javel non ensemencés alcaline sur les nématodes de croissance des médias (NGM) plaques 18. Contrairement à des protocoles standard de l'hypochlorite de grande lots de blanchiment, choisissez 1-100 animaux dans une goutte d'eau de Javel sur la surface d'une plaque NGM, puis laisser l'eau de Javel à absorber dans la plaque
- Sceller les plaques dans la chambre de l'environnement. Les animaux témoins doivent être conservés dans des conditions de normoxie (air de la maison) à la même température que les vers traités. Il n'y a aucune différence observable entre les échantillons laissés dans la maison de l'air et ceux maintenus dans une chambre identique à air de la maison qui coule sur eux. Initier flux de gaz et de maintenir l'exposition pour le temps désiré. Pour assurer l'uniformité dans la rampe, assurez-vous deremplacer l'eau dans la bouteille de gaz de lavage avant l'exposition.
- Pour la survie des embryons de dosage, de permettre aux vers de se développer pour 48 h après le retour à l'air ambiant, à quel point ils devraient être le quatrième stade larvaire / jour, un adulte. Score à la survie, la censure des vers qui ne peuvent pas être pris en compte.
- Pour visualiser les animaux exposés à l'hypoxie, déplacez vers une baisse de M9 sur un 22 mm 2 lamelle, et renverser sur un coussin de 2% d'agarose dans M9 18. Si nécessaire, le lévamisole (25 mm) ou l'azoture de sodium (10 mM) peut être utilisé comme anesthésique. L'azoture de sodium et le lévamisole peut confondre certaines observations dues à la toxicité et doivent être utilisées judicieusement 19.
5. Récolte rapide de l'hypoxie-exposées Worms (Exemple: Préparation des échantillons pour HIF-1 Analyse de l'Ouest)
Beaucoup induite par l'hypoxie effets sont rapidement inversés lors du retour à l'air ambiant, y compris la reprise de la production d'œufs 12, la phosphorylation d'épitopes mitotiquesdans l'embryogenèse 13 et la dégradation de la protéine HIF-1 9,20. L'isolement rapide des animaux exposés à une hypoxie est nécessaire pour obtenir des effets reproductibles dans ces conditions. Avec cette configuration, les animaux peuvent être récoltés et congelés dans l'azote liquide en moins de deux minutes. Tandis que les chambres à gants hypoxie case Autoriser pour la manipulation des échantillons dans des conditions anoxiques, leur coût et de praticité pour d'autres conditions que l'anoxie limitent leur utilité.
- Cultiver Bristol vers N2 sur 4 à 10 cm en forte croissance (HG) plaques jusqu'à ce que la majorité des vers sont adultes gravides 18. Laver vers un tube de 15 ml conique contenant une solution de blanchiment alcalin et 01:05 incuber avec la rotation jusque vers commencent à se dissoudre, pas plus de 5 minutes 9. Laver les vers à trois reprises avec M9, le filage bas à 1500 xg entre chaque lavage sans freinage.
- Embryons de plaques décolorées SUR DES 8 150 plaques NGM mm et permettent de développer de larves L4 (~ 48 heures pour Bristol N2 à 22 ° C).Déplacez plaques aux chambres environnementales et exposer à hypoxique (1.000 ppm, 5,000 ppm) et anoxiques (N2) des conditions pour les 4 heures. Les temps d'exposition varie en fonction de la conception expérimentale. Bien que l'exposition à l'hypoxie a un effet immédiat sur le taux de ponte, deux embryons de cellules meurent après 16-18 heures d'exposition 12. Avec cette configuration chambre de l'hypoxie, la limite inférieure de l'exposition est limitée par le taux de change atmosphère nécessaire pour atteindre l'équilibre.
- Étiqueter un tube de 1,5 ml de micro et un tube de 15 ml conique pour chaque échantillon expérimental. Worms exposés à une hypoxie sont plus susceptibles de s'en tenir aux côtés du tube lors de la récolte. Pour éviter cela, placer 100 ul de dodécylsulfate de sodium à 1% (SDS) dans chaque tube 15 ml conique. Si SDS inhibe les applications en aval, la sérum albumine bovine (BSA) peut être utilisé pour empêcher de coller. L'utilisation systématique de la SDD ou BSA ne semble pas avoir une différence apparente. Ajouter 50 ul de 2x chargement protéines colorant (4% SDS, 10% de 2-mercaptoéthanol et untrace de bleu de bromophénol dans le glycérol 30% (p / v)) pour le tube de 1,5 ml de micro. Avoir un Dewar d'azote liquide prêt.
- Temps des étapes après avoir enlevé les vers de l'hypoxie et l'enregistrement. Retirez le couvercle de la chambre hypoxique, prendre une plaque échantillon, et refermer la chambre. Utiliser de l'eau distillée pour se laver les vers sur un filtre en nylon, puis versez-le dans le tube 15 ml conique. Faites tourner les vers le bas dans une centrifugeuse de bureau à 1500 xg pendant 15-20 secondes avec frein.
- Utilisez un aspirateur pour enlever la plupart du surnageant du tube, laissant le culot à vis sans fin intacte.
- Avec une pipette, déplacez le culot à vis sans fin dans 50 ul de la tube de 1,5 ml de micro. Scellez le tube et le plonger dans l'azote liquide.
- Répétez jusqu'à ce que tous les échantillons ont été isolés. Suivez ces procédures pour les échantillons de contrôle internes de l'air pour la cohérence. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C.
6. Les résultats représentatifs
Effets de l'hypoxie organismales peut être vuen examinant la viabilité à l'âge adulte de C. elegans (Figure 2). Les embryons pondus par type sauvage Bristol (N2) et HIF-1 (IA04) mutants de délétion sont tous de survivre dans l'air des maisons concentrations de O 2 (210.000 ppm 2 O). N 2 vers sont capables de s'adapter et de survivre à l'âge adulte en 5000 ppm 2 O, tandis que HIF-1 embryons ne sont pas viables. Cela montre que HIF-1 est indispensable pour s'adapter à l'évolution des niveaux d'oxygène disponible dans l'environnement 10. Ni N2, ni HIF-1 les animaux peuvent survivre à l'exposition à 1000 ppm O 2.
Visualisation ver directement dans l'hypoxie est réalisable avec l'utilisation d'un microscope à dissection et récipient transparent (Figure 3). En plaçant directement la chambre de l'hypoxie sur la portée de dissection, il n'est pas nécessaire d'enlever les vers de l'hypoxie d'observer les réactions des organismes. La portée peut être équipé d'illumation fluorescence (comme dans la figure 3
Figure 1. Exemple de l'hypoxie chambre. Direction du débit de gaz est indiqué par des flèches. Le gaz est stocké dans des réservoirs de gaz comprimé avec définies concentrations de O 2 (1) et un régulateur à deux étages est attaché (2). Le gaz pénètre dans la partie inférieure du tube d'écoulement (3), sortant du haut au débit correcte. Gaz s'écoule ensuite dans le ballon bulle (4), hydratant le gaz (assurer une connexion correcte de la fiole à bulles par observation de bulles). Gaz hydratée passe ensuite dans la chambre de l'hypoxie à la soupape d'admission (5), d'exposer les échantillons à l'hypoxie. Le gaz, enfin, des évents dans la pièce à travers un trou d'échappement percé dans la chambre.
Figure 2. La viabilité des embryons exposés à 1000 ppm 2 O, O ppm 5000
Figure 3. Visualisation de C. elegans dans l'hypoxie à la microscopie. Worms sont exposés à une hypoxie en utilisant les méthodes décrites. La chambre transparente de l'environnement (construit avec un plat en pyrex de cristallisation et la plaque de verre) est placé directement sur la scène d'un microscope à dissection. Deux points de vue sont présentés, l'un incluant le flux de gaz toute mise en place, l'autre avec juste la chambre sur la platine du microscope.
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Discussion
Cette méthode présente une stratégie pour construire un environnement hypoxique qui permet pour les environnements avec des concentrations précises d'oxygène pour être maintenus dans le laboratoire. Ces chambres offrent une méthode simple pour exposer les organismes à certains de faibles concentrations de O 2 et le suivi des sorties moléculaires et physiologiques. La chambre de l'environnement décrit est assemblé par le laboratoire au lieu de commerce achetés et peut donc être modifié pour s'adapter aux besoins de l'expérience.
Un avantage de cette méthode est la conception à flux continu. Ceci élimine les difficultés habituellement rencontrées avec le maintien de faibles concentrations de O 2 dans les chambres lorsque le externes concentration d'O 2 est beaucoup plus élevé (210.000 ppm 2 O dans l'air ambiant). Le procédé de remplacement est un arrêté-débit, dans lequel un environnement hypoxique est maintenu dans une chambre étanche. Même les petites fuites, qui peuvent être difficiles à détecter, de préévacuer le maintien de conditions hypoxiques en utilisant stopped-flow méthodes. La méthode à flux continu d'échanges continuellement de l'air dans la chambre avec la concentration en oxygène définie dans le réservoir d'air comprimé et maintient une pression positive qui empêche les fuites de perturber les conditions hypoxiques.
Obtention exactes, les concentrations d'oxygène pré-mélangés de fournisseur de gaz résout un autre problème difficile à une hypoxie. Il est très difficile de mesurer des concentrations extrêmement faibles de O 2. La plupart des capteurs O 2 sont la diffusion limitée et assez cher. Parce que O 2 diffuse lentement, à la mesure de faibles concentrations d'O 2 peut être lente ou imprécise 21. En revanche, il est assez facile de générer des mélanges de gaz en mesurant le poids de gaz. Les mélanges que nous achètent régulièrement sont certifiés norme soit moins de 2% teneur en O 2 du mélange désiré.
Cette méthode peut être utilisée pour obtenir observable hypoxia changements induits tant au niveau organismique et moléculaire. Bien que cette méthode donne un aperçu des tests de survie et rapide d'isolement ver ensemble pour des expériences moléculaires, il existe une myriade lectures en aval qui pourraient être utilisés. Par exemple, cette conception permet de visualiser la direction de vers dans l'hypoxie pour l'étude du comportement en temps réel et les modifications apportées constructions rapporteurs. Pour visualiser les vers avec un microscope à dissection, assembler la chambre en utilisant des boîtes transparentes avec un petit volume et la hauteur minimale. La chambre entière peut être placé sur le champ d'application de dissection et est facilement maniable pour une visualisation optimale (voir Figure 3). Il serait également possible d'observer des échantillons à plus fort grossissement en utilisant des chambres de perfusion avec un microscope inversé. Cela nécessite une certaine adaptation des chambres de l'interfacer avec des tubes qui est normalement utilisé pour les flux de gaz, et de déterminer un débit approprié. Les résultats représentatifs indiqués ne font qu'effleurer la surface de possibi expérimentalelités, comme l'hypoxie a été montré pour affecter les systèmes cellulaires de synthèse de l'ADN à 22,23 dégradation des protéines.
Le caractère pratique de cette méthode ne se limite pas à C. elegans. Tant que la taille appropriée chambres sont utilisées, cette méthode est facilement adaptable à presque n'importe quel modèle. Pour l'adaptation à des milieux liquides ou sur culture cellulaire, les constantes de diffusion de l'oxygène en solution, le dégazage à partir de plastique et le temps de s'équilibrer dans la culture doit être pris en compte, et il peut être plus approprié d'utiliser O 2 plaques de culture perméables 24,25.
Il est possible de modifier les chambres présentés dans le présent protocole pour une utilisation avec d'autres gaz. Par exemple, des chambres peut être adapté pour fournir un environnement anoxique seulement en omettant l'O 2 dans les réservoirs de gaz comprimé servant à créer une chambre hypoxie (le solde étant rempli d'azote). Cela a permis pour l'observation de C. elegans dans suspanimation terminée (données non présentées) 10,13,26. Légères modifications doit être faite sur la base des propriétés du mélange de gaz utilisé. La composition de la tubulure de gaz utilisé pour tuyau dans et hors de la chambre peut être varié. Certains plastiques sont perméables au CO 2, tandis que d'autres ne sont pas compatibles avec les gaz corrosifs tels a sulfure d'hydrogène (H 2 S) 16,26. Une liste des matières plastiques compatibles peuvent être trouvées sur le site Web Cole-Parmer.
Pour les gaz toxiques de la sortie de gaz de la chambre doit être évacué dans une hotte certifiée fumées et de protection individuelle approprié, tels que les détecteurs, doivent être employées. En outre, les agents de EH & S devrait être consulté avant de commencer toute expérience en utilisant des gaz potentiellement dangereux. Gaz corrosifs peut également exiger une attention particulière. Par exemple, H 2 S peut corroder la plupart des matières plastiques utilisées dans le matériel tubes standard ainsi que raccord en laiton se corrode. En général, nous assurez-vous que toute mouilléeTed plastique est Kalrez ou équivalent dans les instruments utilisés par H 2 S. Certaines gaz peut interagir avec des impuretés dans l'eau du robinet, de sorte Dih 2 0 doit être utilisé dans le ballon de bulle. Considérations particulières concernant la verrerie peut également être nécessaire, par exemple, H 2 S nécessite l'équipement avec mouillée joints toriques.
Changements à la fois organismales et moléculaires sont observées en utilisant des expériences qui peuvent être complétés en une journée. Cette capacité à introduire rapidement des échantillons à l'hypoxie constitue un outil précieux dans les domaines du vieillissement et le cancer pour le développement.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous remercions les membres du laboratoire Miller pour la discussion et la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse de nouveau chercheur du Centre de choc Nathan d'excellence dans la biologie fondamentale du vieillissement de DLM et le National Institutes of Health Award R00 AG030550 à DLM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon | YO-95821-00 (1/8" FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8" PTFE)’ R-3603 | |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16") 06363-62 (F. coupler 1/16") 06363-60 (M. coupler 1/8") 06363-61 (F. coupler 1/8") | |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) | |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) | |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order | |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16") | |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order | |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4" nut) B-200-3 (1/8" union tee) B-400-set (1/4" ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8" male conn) | |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) | |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) | |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 | |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
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