Summary
O tanımlanan konsantrasyonları ile atmosfer oluşturmak için sürekli akış hipoksi odalarına nasıl kullanılacağı Bu kağıdı ayrıntıları
Abstract
Tüm metazoans tek bilinen istisnası 1, yaşaması için oksijen çok önemlidir. Azalmış O 2 durumunu (hipoksi) hastalığı, normal gelişim ve çevresel koşullarda 2-5 değişikliklerin devletlerin sırasında ortaya çıkabilir. Hipoksiye yanıt olarak katılan hücresel sinyal yollarının anlaşılması inme kansere kadar, çeşitli insan patolojiler için tedavi stratejileri hakkında yeni ipuçları sağlayabilir. Bu amaç, genetik olarak müsait modeli organizmalarda kontrollü hipoksik maruz kalma ile bağlantılı teknik zorluklar göre, en azından kısmen, büyük ölçüde azalmıştır.
Nematod Caenorhabditis elegans ideal bir kültür kolaydır ve genetik olarak manipüle olarak, hipoksik yanıt çalışmaları için bir model organizma olarak uygundur. Ayrıca, C. yana karıştırıcı etkisi olmadan belirli hipoksik O 2 konsantrasyonları hücresel yanıtları incelemek mümkündür elegans O 2 (eldeve difüzyon ile diğer gazlar) gibi bir kolaylaştırılmış solunum sistemi 6. karşı. Hipoksiye yanıt olarak dahil olmak üzere bilinen faktörleri C'de muhafaza edilmektedir elegans. Hipoksiye gerçek cevap mevcuttur O 2 spesifik konsantrasyonuna bağlıdır. C. elegans, hipoksi orta maruz hif-1 tarafından büyük ölçüde aracılık ettiği bir transkripsiyonel yanıt verilmesini sağlar, yüksek korunmuş hipoksi-indüklenebilir transkripsiyon faktörü 6-9. C. elegans embriyo O 2 7,10 5,000-20,000 ppm hayatta kalmak için hif-1 gerektirir . Hipoksi "normal O 2 daha az" için genel bir terimdir. Normoksi (normal O 2) de tarif etmek zor olabilir. Biz genellikle normoksi olması 210,000 ppm O 2 oda havası, düşünün. Bununla birlikte, bu gösterilmiş olduğu C. elegans% 5-12 arası O 2 konsantrasyonları (ppm 50,000-120,000 O 2) 11 için davranışsal bir tercihi vardır. Larvae ve yetişkinler, 5.000 ppm O 2 12 hipoksi bağlı diapause önlemek için hif-1 davranır. Ancak, hif-1 O 2 'nin düşük konsantrasyonlarda (anoksi, operasyonel tanım <10 ppm O 2) 13 yanıt olarak bir rol oynamıyor. Anoksi, C. elegans tüm mikroskobik gözlemlenebilir etkinliği 10 sona erdiği asılı animasyon tersinir bir duruma geçer. Farklı koşullarda farklı fizyolojik tepkiler meydana gerçeği O 2 hipoksik konsantrasyonu üzerinde deney kontrolü olmasının önemini vurgulamaktadır.
Burada, O 2 tanımlanmış konsantrasyonlarını güvenilir ve tekrarlanabilir hipoksik koşullarda üretmek çevre odalarının yapımı ve uygulanması için bir yöntem sunuyoruz. Sürekli bir akış yöntemi haznesinin hızlı dengeleme sistemi sağlar ve stabilitesini arttırır. Ayrıca, şeffaflık veodalarının erişilebilirlik hipoksiye maruz hayvanların doğrudan görselleştirme için izin verir. Biz daha C. hasat etkili bir yöntem gösterilmektedir elegans örnekleri hızla hipoksi maruz kaldıktan sonra, bu hipoksi 10,14 meydana hızla-ters değişiklikleri birçok gözlemlemek için gereklidir. Bu yöntem, kolayca farklı model sistemler ve gazlar çeşitli dahil bireysel laboratuar ihtiyaçları için değiştirilebilir temel bir temel sağlar.
Protocol
1. Çevre Odaları İnşaatı
- Projenizin kapsamı için gerekli odasının küçük makul ses seçin. Odası (O 2) gaz sızdırmaz malzemeden yapılmış olmalıdır. Pyrex kristalizasyon yemekleri, Anaeropack kutuları veya büyük dökme akrilik kutuları (Ellard Enstrümantasyon), kullanılabilir. Biz 9 50 mm levha 100 x 50 KIMEX kristalizasyon çanak sığabilecek bulduk. Cam levhalar Pyrex kristalizasyon yemekler için kapak olarak kullanılabilir.
- Seçilen odasında bir delik delin ve hortum barb uydurma (Cole Parmer) için Luer plastik bir erkek ile uyum. Parçaları boru bağlantı veya epoksi ile güvence altına alınabilir. Gaz odasının akan ve dışarı için izin kabın karşı tarafta benzer bir bağlantı kurun. Mümkünse, türbülans artırmak için delikler ofset.
- O 2 eş için standart sertifikalı tanımlanan O 2 konsantrasyonları (N 2 ile dengeli) ile sıkıştırılmış gaz tankları edininanoksi koşulları için ntent ya da saf N 2 (<10 ppm O 2). Odalarında oksijen seviyesi kesintiye önlemek için uzun vadeli çalışmalar için otomatik geçiş-over düzenleyiciler kullanın.
- Hipoksiye organizma tepkisi sıcaklığında 15 bağımlı olduğu gösterildi. Bir inkübatörde haznesi yerleştirerek, farklı sıcaklık muhafaza edilebilir. Bir inkübatör içinde Sıcaklıklar dengesiz ve gibi olabilir, bunu sürekli odasının içindeki sıcaklığı ölçmek için bir sıcaklık veri kayıt cihazı yararlanmak için isabetli olmuştur.
2. Çevre Odası Gaz Bağlantı
- Tüm bağlantıları için, çıt çıt bağlantı veya sıkıştırma parçaları ya bağlanmış sekizde biri-inç dış çaplı tüp kullanmayın. Boru gibi florinlenmiş etilen propilen olarak O 2, (FEP) veya naylon (Cole Parmer) ile sızdırmaz ve reaktif olmalıdır. Tamamlanmış kurulum şematik için, bakınız Şekil 1.
- Com bağlayınBöyle bir kütle akış kontrolörü (Sierra Instruments) veya rotametre (Aalborg) gibi bir akış kontrol cihazı için basılan gaz tankları,. Tanktan giriş basınç akış cihazın aralığı ve hortum barb parçaları içinde olduğundan emin olun. İki kademeli regülatörleri genellikle istenen basınç ayarlı ikinci aşamada, kullanılan [uygun akış hızı seçimi için üç bölüme bakınız]
- (Bkz. Şekil 1) egzoz gazı için ikinci uydurma açık bırakarak çevre bölmesi üzerindeki parçaları biri, sonra içine doğrudan fritli silindirli bir gaz yıkama şişesi kullanılarak saf su ile köpüren tarafından hidrat gazı. Kısa vadeli çalışmalar için, gaz hidrasyon plaka Kuraklığa karşı korur, ancak nem izleme uzun vadeli çalışmalar için gerekli olabilir.
- Dow Corning Vakum Yağ haznesi mühürlemek için kullanılabilir. Haznesinin kapağının üzerine koyun ağırlıkları hava geçirmez bir mühür sağlamak. Sıkı bir mühür ve yeterli akımı onaylamak için, y avuç su küçük bir havuz tutunBizim eldivenli odasında dışarı montaj için el ve kabarcıkları kontrol edin.
3. Debisi Seçimi
- Karıştırma mükemmel varsayarsak, gaz atmosferi% 90 gaz değişimi odasının hacmi (Fick Kanunu) yerine her zaman vardır. Örneğin, 100 ml / dak 'lık bir akış oranı ile bir 100 cc odasında, odacık içinde orijinal ev hava 1 dakika sonra arzu edilen gaz% 90 ile değiştirilir, ve asemptotik% 90 dakikada tarafından tam değişimi yaklaşacak bundan sonra.
- Yüksek debi ve küçük kaplarda daha hızlı istenen oksijen konsantrasyonu ulaşacak. 100 x 50 KIMEX kapları (400 cc), 120 ml / dak akış hızı 10 dakika (3 alışverişi) içinde% 99.9 değişimi ulaşacaktır. Bu akış hızı en oksijen koşulları için uygundur. Bildiğimiz kadarıyla O 2 konsantrasyonunun değişim oranı C. yanıtı nasıl etkilediğini sistematik bir soruşturma olmamıştır elegans.
- Hipoksik koşullarına maruz solucanlar yaygın agar plakalar yüzeyi atlanır. Bunun önlenmesi için, plakalar kenarı etrafında palmitik asit (etanol içinde 10 mg / ml) bir halka yerleştirin. Palmitik asit fiziksel bir bariyer oluşturarak, etanol buharlaşır gibi çözüm çıkacaktır. Palmitik asit engelleri yumurtlama, doğurganlık veya C. ömrü oranı etkilemez elegans 16,17. Sığıntı hipoksik koşullarda daha sık oluşmaz, bu nedenle ek önlemler genellikle gerekli değildir.
- Dereceye giremeyen nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları 18 alkali çamaşır suyu küçük bir düşüş gravida yetişkin beyazlatma ile senkronize nüfus oluşturun. Standart büyük kesikli hipoklorit beyazlatma protokolleri aksine, bir NGM plakanın yüzeyinde ağartıcı çözeltinin bir düşüş 1-100 hayvanlar alma, sonra ağartıcı çözelti plakası içine emmek için izin
- Bu canlılık 13 azaltabilir olarak, hipoksi ağartılmış embriyolar maruz bırakmayın. Genç embriyoların (2-4 hücreleri) toplamak için, gravida yetişkin hipoksi sonraki poz için ağız pipeti plaklara taşınmış bir jilet ve embriyo su ile az miktarda kıyılmış edilebilir.
- Dereceye giremeyen nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları 18 alkali çamaşır suyu küçük bir düşüş gravida yetişkin beyazlatma ile senkronize nüfus oluşturun. Standart büyük kesikli hipoklorit beyazlatma protokolleri aksine, bir NGM plakanın yüzeyinde ağartıcı çözeltinin bir düşüş 1-100 hayvanlar alma, sonra ağartıcı çözelti plakası içine emmek için izin
- Çevre odasında yüzeyleri. Kontrol hayvanlarına muamele solucanlar aynı sıcaklıkta normoksi (ev hava) içinde tutulmalıdır. Ev havada kaldı örnekleri ve ev havada üzerlerine akan özdeş bir odasında tutulan olanlar arasında hiçbir gözlemlenebilir bir fark yoktur. Gaz akışını başlatmak ve istenilen zaman için pozlama korumak. Rampa yeknesaklık sağlamak için, emin olunmaruz önce gaz yıkama şişe suyu değiştirin.
- Embriyoların test yaşam için, solucanlar oda havasına döndükten sonra 48 saat için geliştirmeye olanak hangi noktada onlar dördüncü dönem larva / gün bir yetişkin olmalıdır. Sağkalım, sansürlemek için izah edilemez bir solucan için Puan.
- , Hipoksiye maruz kalan hayvanlarda görselleştirmek ise 22 mm 2 coverslip üzerine M9 bir damla solucanlara taşıyın ve M9 18% 2 agaroz bir ped üzerine dönüştürmelidir. Gerektiğinde, levamisole (25 mM) ve sodyum azid (10 mM) anestezi olarak kullanılabilir Eğer. Sodyum azid ve levamizol toksisite nedeniyle bazı gözlemler yanıltabilecek ve mantıklı 19 kullanılmalıdır.
5.. Hipoksi maruz kalan Worms (: HIF-1 Batı Analizi için Numune Hazırlama Örneği) Rapid Harvest
Birçok hipoksi kaynaklı etkileri hızla yumurta üretimi 12, mitotik epitoplarının fosforilasyon yeniden başlaması da dahil olmak üzere, oda havasında dönmek üzerine iptal edilirembriyogenez 13 ve HIF-1 proteini 9,20 bozulması içinde. Hipoksi maruz kalan hayvanlarda, hızlı izolasyonu bu koşullarda tekrarlanabilir etkiler elde etmek için gereklidir. En az iki dakika bu ayarı ile, hayvanlar hasat edilebilir ve sıvı azot içinde dondurulur. Torpido gözü hipoksi odaları oksijensiz koşullarda numunelerin manipülasyon için izin verirken, anoksi haricindeki koşullar için maliyet ve pratiklik kullanışlılığını sınırlayan.
- Solucanlar çoğunluğu 18 gebe yetişkin olana kadar 4 10 cm yüksek büyüme (HG) plakalar üzerinde Bristol N2 solucanlar büyür. Bir 01:05 alkalin çamaşır suyu çözeltisi içeren bir 15 ml konik tüp solucanları yıkayın ve solucanlar 5 dakikadan fazla, 9 değil çözülmeye başlayana kadar rotasyon ile inkübe edin. Frenleme ile her yıkama arasında 1500 xg'de aşağı iplik, M9 ile solucanlar üç kez yıkayın.
- Plaka ağartılmış 8 150 mm NGM levhaları üzerine embriyo ve L4 larvaları (22 at Bristol N2 için ~ 48 saat ° C) geliştirmeye olanak sağlar.Çevresel odalarına plakalar taşımak ve hipoksik (1000 ppm, 5000 ppm) ve 4 saat boyunca anoksi (N2) koşullarına maruz bırakmaktadır. Pozlama süreleri deneysel tasarım bağlı olarak değişecektir. Hipoksiye maruz yumurtlama oranı üzerinde hemen bir etkisi olsa da, iki hücreli embriyo maruz 12 16-18 saat sonra ölür. Bu hipoksi odası kurulumu ile, pozlama alt limit denge ulaşmak için gerekli ortamı kur tarafından sınırlanır.
- Etiket biri 1.5 mL mikrofuge'de tüp ve her deneysel örnek için bir 15 ml konik boru. Hipoksi maruz solucanlar hasat sırasında boru tarafı sopa daha olasıdır. Bunu önlemek için, yerine her biri 15 ml konik tüp içinde% 1 sodyum dodesil sülfat (SDS) 100 mcL. SDS aşağı uygulamalar inhibe ise, sığır serum albümini (BSA) yapışmasını engellemek için de kullanılabilir. SDS veya BSA rutin kullanımı belirgin bir fark var gibi görünmüyor. 2x proteini yükleme boya (4% SDS,% 10 2-mercaptoethanol ile 50 ul ekleme1,5 mL mikrofüj tüpe% 30 gliserol (w / v)) içinde bromphenol mavi iz. Hazır sıvı nitrojen bir Dewar var.
- Hipoksi ve kayıttan solucanlar çıkardıktan sonra Zaman adımları. , Hipoksik odasına kapağını çıkarın ve tek bir numune levha alır ve odasına kapatın. 15 ml konik tüp içine dökün sonra bir naylon filtre üzerine solucanlar yıkayın ve distile su kullanın. Frenli 15-20 saniye için 1500 xg'de bir masaüstü santrifüj solucanlar aşağı Spin.
- Solucan pelet bakir bırakarak, tüpten en çıkarmak için bir vakum kullanın.
- Bir pipet kullanarak 1,5 mL mikrofuge'de tüpe 50 uL olarak solucan pelet taşıyın. Sıvı azot tüpü ve batırmayın Seal.
- Tüm örneklerde izole edilmiştir kadar tekrarlayın. Tutarlılığı için ev hava kontrol örnekleri için bu işlemleri takip edin. Numuneler -20 ° C'de saklanabilir
6. Temsilcisi Sonuçlar
Hipoksi organizma etkileri görülebileceğiC yetişkinliğe canlılığı inceleyerek elegans (Şekil 2). Vahşi tip Bristol (N2) ve HIF-1 (ia04) delesyon mutantlar tarafından döşenen Embriyolar evi havaya O 2 konsantrasyonları (210,000 ppm O 2) hayatta edilir. HIF-1 embriyoların canlı değildir iken N 2 solucanlar, 5.000 ppm O 2 yetişkinliğe uyum ve hayatta edebiliyoruz. Bu HIF-1 ortamında 10 mevcut oksijen değişen seviyelere adapte için elzem olduğunu gösterir. N2 ne hif-1 hayvanlar Ne 1.000 ppm O 2 maruz yaşayabilir.
Hipoksi doğrudan solucanı görselleme bir kesme kapsamı ve berrak kabın (Şekil 3) kullanımı ile mümkündür. Doğrudan kesme kapsamı üzerinde hipoksi haznesi yerleştirerek, organizma reaksiyonları gözlemlemek için hipoksi ile solucanların kaldırmak için gerek yoktur. Kapsamı (Şekil 3 'de olarak floresans illumation takılabilir
Şekil 1.. Gaz akış Hipoksi haznesi. Yönü Örneği oklarla gösterilmiştir. Gaz tanımlandığı O 2 konsantrasyonları (1) ve bir iki aşamalı regülatörü (2) bağlı olan sıkıştırılmış gaz tankları içinde saklanır. Gaz doğru akış hızında üst çıkmadan, akış tüp (3) alt girer. Gaz daha sonra gaz (baloncuklar gözlemleyerek kabarcık balonun doğru bağlantı sağlamak) nemlendirici, kabarcık balonuna (4) akar. Sönmüş gaz daha sonra hipoksiye örnekleri açığa giriş vanası (5) hipoksi odasına geçer. Odasında delinen bir egzoz deliğinden odasına gaz son delikleri.
Şekil 2. 1.000 ppm O 2, 5,000 ppm O maruz kalan embriyoların Canlılık
Şekil 3. C. Görselleştirme mikroskobu ile hipoksi elegans. Worms açıklanan yöntemleri kullanarak hipoksi maruz kalmaktadır. Şeffaf çevre bölmesi (payreks bir kristalizasyon çanak ve cam plakası ile yapılmış) bir diseksiyon kapsamı sahnede doğrudan yerleştirilir. İki kez tüm gaz akışı da dahil olmak üzere bir mikroskop sahnede sadece oda ile, diğer kurmak, gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem, laboratuvarda muhafaza edilecek oksijen konsantrasyonları hassas ortamlar için izin veren bir hipoksik ortam oluşturmak için bir strateji sunar. Bu odaların O 2 özel düşük konsantrasyonda organizmalar teşhir ve moleküler ve fizyolojik çıkışları izlemek için basit bir yöntem sağlar. Açıklanan çevre odası laboratuar yerine ticari olarak satın tarafından birleştirilir ve böylece deney ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir.
Bu yöntemin biri ayrı bir avantaj sürekli akış tasarımıdır. Bu normalde dış O 2 konsantrasyonu çok yüksek olduğunda (oda havasında 210,000 ppm O 2) odaları O 2 'nin düşük konsantrasyonlarda bakımı ile karşılaşılan zorlukları ortadan kaldırır. Alternatif bir hipoksik ortamı yalıtılmış bir bölmede muhafaza edildiği bir durduruldu akışlı bir yöntemdir. Tespit etmek zor olabilir Hatta küçük sızıntılar, öndurduruldu-akış yöntemler kullanılarak hipoksik durumlarda bakım delik. Sürekli akış yöntemi sürekli basınçlı hava tank içinde tanımlanan oksijen konsantrasyonuna sahip haznesindeki alışverişi hava ve hipoksik koşulları bozmamaları sızıntı önleyici bir pozitif basınç tutar.
Gaz tedarikçisi gelen tam, önceden karıştırılmış oksijen konsantrasyonu elde hipoksi ile bir başka zor sorunu çözer. O O 2 derece düşük konsantrasyonlarını ölçmek oldukça zordur. En çok O 2 sensörleri difüzyon sınırlı ve oldukça pahalıdır. O 2 yayılır Çünkü yavaş, ölçüm düşük O 2 konsantrasyonları yavaş veya 21 yanlış olabilir. Buna karşılık, bu gazların ağırlığı ölçerek gaz karışımları üretmek için oldukça kolaydır. Düzenli olarak satın karışımlar istenilen karışımı 2 O içeriği% 2 içinde olması için standart sertifikalıdır.
Bu yöntem, gözlemlenebilir h ortaya çıkartılması için kullanılabilirlerHer iki organizma ve moleküler düzeyde ypoxia bağlı olarak değişir. Bu yöntem sağkalım deneyleri ve moleküler deneyler için hızlı bir bütün solucanı izolasyonu özetlenmektedir iken, kullanılan olabilir sayısız aşağı readouts vardır. Örneğin, bu tasarım gerçek zamanlı davranış ve raportör yapıları değişikliklerin çalışma için hipoksi solucanların yönde görüntülenmesi için olanak sağlar. Bir kesme kapsamı ile solucanlar görselleştirmek için, küçük hacimli ve asgari yüksekliği ile şeffaf kutular kullanarak odası araya. Tüm oda diseksiyon kapsamı üzerine yerleştirilir ve (bkz. Şekil 3) en iyi görünüm için kolayca manevra kabiliyeti edilebilir. Ayrıca yüksek büyütmede bir inverted mikroskop ile perfüzyon odaları kullanarak örnekleri gözlemlemek mümkün olacaktır. Bu normal olarak gaz akımı için kullanılan hortum ile Bu arayüzü odalarına bazı adaptasyonu gerektirir, ve uygun bir akış oranını belirlemek. Gösterilen temsilcisi sonuçları sadece deneysel possibi yüzeyinde çiziklerinhipoksi DNA sentezi protein yıkımı 22,23 hücresel sistemleri etkilediği gösterilmiş olduğu lities.
Bu yöntem pratik doğası C. bunlarla sınırlı değildir elegans. uygun büyüklükteki odaları kullanıldığı sürece, bu yöntem hemen hemen her modeli sistemine kolaylıkla adapte edilebilir. Sıvı ortamda veya plastik ve kültür dengelenmeye zaman gazın atılması hücre kültürü, çözüm oksijen difüzyon sabitleri, uyum için dikkate alınması lazımdır, ve O 2 geçirgen kültür plakları 24,25 kullanmak için en uygun olabilir.
Bu, diğer gazlar ile kullanım için bu protokolü sunulan odalarına değiştirmek mümkündür. Örneğin, odalar sadece bir hipoksi odası (azot dolu olan denge ile) oluşturmak için kullanılan sıkıştırılmış gaz tanklarında O 2 omitting bir anoksik ortam sağlamak için adapte edilebilir. Bu C. gözlem için izin verdi susp yılında eleganssona animasyon (veriler gösterilmemiştir) 10,13,26. Küçük değişiklikler kullanılan gaz karışımının özelliklerine göre yapılmış olmalıdır. Içine ve dışına haznesi boru gazı için kullanılan hortum bileşimi çeşitlendirilebilir gerekebilir. Diğerleri gibi hidrojen sülfür (H 2 S) 16,26 olan aşındırıcı gaz ile uyumlu değildir Bazı plastikler, CO 2 geçirir. Uyumlu plastik listesi Cole-Parmer web sitesinde bulunabilir.
Zehirli gazlar için odasından gaz çıkış sertifikalı bir çeker ocak ve bu detektörleri gibi uygun kişisel koruyucu içine boşaltılmasını gerekir, istihdam edilmelidir. Ayrıca, EH & S memurları tehlikeli gazları kullanılarak, herhangi bir deney başlamadan önce danışılmalıdır. Aşındırıcı gazlar da özel ilgi gerektirebilir. Örneğin, H 2 S standart boru malzeme gibi pirinç uydurma paslanmasına kullanılan plastik birçok zarar verir. Biz genellikle herhangi bir ıslak emin olunted plastik Kalrez veya H 2 S ile kullanılan aletlerin eşdeğerdir Belirli gazlar musluk suyu içinde safsızlıklar ile etkileşime girebilir, dih 2 0 kabarcık şişe içinde kullanılması gerektiğini böylece. Cam ile ilgili özel hususlar da gerekli olabilir, örneğin, H 2 S O-ring ıslatılmış ile ekipman gerektirmektedir.
Organizma ve moleküler Her iki değişiklik bir gün içinde tamamlanabilir deneyler kullanan gözlenmektedir. Hızla hipoksiye örnekleri tanıtmak için bu yeteneği yaşlanma ve kanser gelişimi alanlarında değerli bir araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz tartışma ve yazının eleştirel okuma için Miller laboratuar üyeleri teşekkür ederim. Bu çalışma DLM ve DLM Sağlık ödülü R00 AG030550 National Institutes of Aging için Temel Biyoloji Mükemmellik Nathan Şok Merkezi'nden yeni bir araştırmacı ödül tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon | YO-95821-00 (1/8" FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8" PTFE)’ R-3603 | |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16") 06363-62 (F. coupler 1/16") 06363-60 (M. coupler 1/8") 06363-61 (F. coupler 1/8") | |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) | |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) | |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order | |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16") | |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order | |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4" nut) B-200-3 (1/8" union tee) B-400-set (1/4" ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8" male conn) | |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) | |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) | |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 | |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
References
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30 (2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer. Cancer Research. 60, 4693-4696 (2000).
- Harris, A. L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumour growth. Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).
- Ramirez-Bergeron, D. L. Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development. Development. 131, 4623-4634 (2004).
- Staff, F. E. Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia. Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).
- Shen, C., Powell-Coffman, J. A. Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans. Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).
- Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).
- Epstein, A. C. R. C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation. Cell. 107, 43-54 (2001).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Gray, J. M. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430, 317-322 (2004).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause. Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hu, C. -J., Wang, L. -Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation. Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).
- Treinin, M. HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).
- Miller, D. L., Roth, M. B. Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans. PNAS. 104, 20618-20622 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Salceda, S., Caro, J. Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions. Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).
- Theilacker, J. C., White, M. J. Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement. AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).
- Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts. Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).
- Probst, G., Riedinger, H. Jr, Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells. Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).
- Semenza, G. L., Sen, C. K. Oxygen Sensing. 381, Academic Press. (2004).
- Chan, K., Roth, M. B. Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression. Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).
- Nystul, T. G., Roth, M. B. Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans. PNAS. 101, 9133-9136 (2004).
